Name: empirical, metagenomic, and computational techniques illuminate the mechanisms by which fungicides compromise bee health
Uploaded: 2017-10-09T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Empirical, Metagenomic, and Computational Techniques Illuminate the Mechanisms by which Fungicides Compromise Bee Health at JoVE.com

Forfatter eller forfattere takke University of Wisconsin bioteknologi Center DNA-sekventering facilitet for forstærkning og sekventering faciliteter og tjenester, Caitlin Carlson, Jennifer Knack, Jake Otto og Max Haase teknisk bistand med Molekylær analyse. Dette arbejde blev støttet af USDA-Agricultural Research Service bevilgede midler (nuværende forskning Information System #3655-21220-001). Yderligere støtte blev leveret fra National Science Foundation (under Grant nr. DEB-1442148), DOE Great Lakes bioenergi Research Center (DOE kontor for videnskab BER DE-FC02-07ER64494), og USDA National Institute for fødevarer og landbrug (Hatch projekt 1003258). C.T.H. er en Pew forsker i den biomedicinske videnskaber og en Alfred Toepfer Fakultet Fellow, støttet af Pew Charitable Trusts og Alexander von Humboldt-stiftelsen, henholdsvis.

1. undersøge effekten af fungicid eksponering på Bumble Bee koloni succes ved hjælp af felt bur forsøg <ol><li>sæt op ti mesh bure i et felt, der er beplantet med havre. Grave en grøft omkring hvert bur, og grave alle fire kanter af trådnet bur i jorden for at sikre, at bierne ikke kan undslippe. Stock bure med potteplanter, blomstrende planter, der er kendt for at være attraktive for bier (fx boghvede, Hjulkrone, alyssum, cosmos og solsikker) ( figur 2).</li>
	<li>Supple...

Undersøgelser af virkningerne af fungicider på biers sundhed er forblevet et forsømt aspekt af skadedyr strategier. Vores undersøgelse har til formål at slå bro over denne videnskløft, ved hjælp af en suite af supplerende teknikker, som udtrykkeligt isolere de potentielle faktorer køre bee falder. Planlægning, rationale og gengivelse af disse eksperimenter er nærmere beskrevet nedenfor.
Det er vigtigt at sikre, at ingen bier er tilladt at undslippe mesh bur eksperimenter, da dette v...

Forvaltes og vilde bee arter oplever udbredt afvisninger, med store konsekvenser for både naturlige og landbrugs-systemer1. Trods samordnet indsats for at forstå årsagerne til dette problem, er de faktorer, der styrer honey bee falder stadig ikke godt forstået2,3,4. For visse arter af vilde, native bier, er situationen blevet dire5,6. Hvis bibestandene ikke kan opretholdes, når de skærer hinanden med industrielt landbrug, deres befolkninger vil fortsætte med at falde, og de afgrøder, der kræver bestøvere (35% af verdensomspændende produktion7) vil udholde reduceret høst.
Mens mange potentielle faktorer såsom pesticider eksponering, har sygdom og habitat tab1,4,8,9,10 været impliceret i honey bee tilbagegang, relativt er lidt kendt om interaktive effekten af disse stressfaktorer på native bier sundhed, inden for eller i nærheden af landbrugssystemer. Mange nuværende forskningsindsatsen fortsat fokusere på insekticider, (fx, neonicotinoids11,12), selvom tidligere forskning indikerer at fungicider også kan spille en rolle i bee tilbagegang ved at forringe hukommelsen dannelse, olfaktoriske reception13, reden anerkendelse14, enzymaktivitet og metaboliske funktioner15,16,17. Globalt, fortsat fungicider anvendes på blomstring afgrøder under flor. Nylige undersøgelser har dokumenteret, at bier almindeligt bringe fungicid rester tilbage til bikuben18, faktisk, undersøgelser har vist en stor del af testede nældefeber indeholdt fungicid restkoncentrationer19,20. Yderligere arbejde har afsløret at fungicid rester er forbundet med høje priser af honey bee larve dødelighed21,22,23 og tilstedeværelse af "entombed pollen" inden for kolonier, som selv ikke-giftige, er blottet for mikrobielle aktivitet og er ernæringsmæssigt kompromitteret24. På trods af at fungicider har længe været betragtet "bee-safe", der er nu beviser at eksponering for fungicid alene kan forårsage alvorlige koloni tab i en native bumble bee arter, Bombus impatiens25.
For at fastslå kausalitet mellem fungicid eksponering og koloni dødelighed, modus operandi af disse kemikalier skal bestemmes. Som det fremgår i jord26, sedimenter27og vandmiljøer28, ved at målrette svampe, fungicider sandsynligvis ændre svampe overflod og mangfoldighed inden for pollen-bestemmelser, hvorved påberåbe sig et større fællesskab Skift kan kraftigt favoriserer bakterier. Uden svampe konkurrenter eller antagonister, visse sygdomsfremkaldende bakterier kan formere sig relativt ukontrolleret, lette fordærv af pollen-bestemmelser. Tidligere forskning har vist, at mikroorganismer, især gær og filamentøs svampe, tjene som ernæringsmæssige symbionter for bier29,30,31, beskytte mod parasitter og patogener32 ,33, og levere langsigtet bevaring af pollen butikker. Fungicider, derfor kan indirekte skade umodne bier ved at forstyrre den mikrobielle samfund, der er nødvendige for at yde disse tjenester og/eller ved at øge modtagelighed for opportunistiske patogener og parasitter12. Afgrøder på verdensplan ligger med stigende krav til fødevareproduktion, er der sprøjtes hvert år med fungicider under flor, hvilket understreger behovet for at forstå omfanget af sådanne fungicid-inducerede effekter.
Til dato, de primære viden huller vedrørende indfødte bee mikrobiel økologi kan være repræsenteret af følgende spørgsmål: i hvilket omfang ændrer fungicid den mikrobielle samfund i bee pollen-bestemmelserne? Hvad er downstream konsekvenserne af indtagelse af pollen med et dybt ændrede mikrobielle samfund? I overensstemmelse med disse økologisk germane spørgsmål, eksperimenter blev udviklet med de primære mål med at afsløre 1) at fungicid rester alene kan forårsage alvorlige koloni fald i en native bee arter; 2) graden som mikrobielle samfund i pollen-bestemmelser er ændret af fungicider og 3) hvordan biers sundhed påvirkes af en alvorligt ændrede mikrobielle samfund. De eksperimentelle mål blev defineret for at løse de ovenstående spørgsmål ved hjælp af en kombination af laboratorie - og felt-baserede eksperimenter. Ved hjælp af state-of-the-art metagenomic og molekylærbiologiske teknikker sammen med traditionelle metoder til feltet bemærkning, denne forskning har til formål at sammenstykke de potentielle virkninger af fungicider på biers sundhed.
Det første mål for denne undersøgelse er at vise at fungicid eksponering alene kan forårsage betydelige koloni tab blandt indfødte bee arter. En undersøgelse, der involverer store felt bure blev brugt til at undersøge virkningerne af fungicid eksponering på koloni vækst af Bombus impatiens, en allestedsnærværende, rigelige indfødte bi i USA (figur 1, figur 2, figur 3). Det var en hypotese at fungicid behandlet nældefeber ville præsentere lavere fitness og atypiske demografi i forhold til ikke-eksponerede nældefeber. Data fra dette eksperiment støttet denne hypotese, at fungicid restkoncentrationer i pollen kan være den eneste årsag til dyb koloni tab i en native bumble bee arter25. Det andet formål med denne undersøgelse er at undersøge svar af pollen microbiome fungicid eksponering. Det er en hypotese, at Fællesskabet sammensætningen af mikrober i pollen-bestemmelser udsat for fungicider vil være forskellig fra ubehandlet pollen. Mens svampe overflod og mangfoldighed forventes at falde betydeligt, vil bakterier og/eller en enkelt dominerende svampe arter sandsynligvis vokse ukontrolleret i fravær af andre konkurrerende svampe. Gennem en række in vivo forsøg, vil disse forskydninger i mikrobielle samfund sammensætning blive analyseret ved hjælp af metagenomics.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Natupol Beehive</td>
			<td>Koppert</td>
			<td>USRESM1</td>
			<td>16 hives</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propiconazole 14.3</td>
			<td>Quali-Ppro</td>
			<td>60207-90-1</td>
			<td>Propiconazole 14.3%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Abound</td>
			<td>Syngenta</td>
			<td>4033540</td>
			<td>Azoxystrobin 22.9%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorothalonil</td>
			<td>Syngenta</td>
			<td>3452</td>
			<td>Fungicide used for trials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pollen granules</td>
			<td>Bee rescued</td>
			<td>B004D5650C</td>
			<td>3X 16oz bottles, pollen for trials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial strains for inoculation</td>
			<td>Currie Lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast strains for inoculation</td>
			<td>Hittinger lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer pairs</td>
			<td>UW Biotech Center</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Isolation Kit</td>
			<td>Mo Bio</td>
			<td>12830-50</td>
			<td>Commercial DNA isolation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Q32851</td>
			<td>DNA quantification tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Select Master Mix for CFX</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>4472952</td>
			<td>Used to perform real-time PCR using SYBR GreenER dye.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1855196</td>
			<td>Instrument used for PCR amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Clean-Up Kit,</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>10159-696</td>
			<td>Used for efficient removal of unincorporated dNTPs, salts and enzymes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA 1000 Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1504</td>
			<td>Used for sizing and analysis of DNA fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiSeq Sequencer</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td>Used for next-generation sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assorted glassware (beaker, flasks, pipettes, test tubes, repietters)</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

empirical, metagenomic, and computational techniques illuminate the mechanisms by which fungicides compromise bee health

Avlere bruger ofte fungicid sprays under flor til at beskytte afgrøderne mod sygdom, hvilket udsætter bier fungicid restprodukter. Selvom betragtes som "bee-safe", er der montering beviser at fungicid restkoncentrationer i pollen er forbundet med bee falder (for både honning og bumble bee arter). Mekanismerne er stadig relativt ukendt, har forskere spekuleret på, at bi-mikrobe symbioser er involveret. Mikrober spiller en central rolle i bevarelsen og/eller forarbejdning af pollen, der tjener som ernæring for larver bier. Ved at ændre den mikrobielle samfund, er det sandsynligt, at fungicider forstyrre disse mikrobe-medieret tjenester, og dermed kompromittere biers sundhed. Dette manuskript beskriver de protokoller, der bruges til at undersøge de indirekte mekanismer som fungicider kan være årsag koloni tilbagegang. Bur forsøg udsætter bier til fungicid behandlet blomster har allerede givet de første beviser at fungicider forårsage dybe koloni tab i en native humlebi (Bombus impatiens). Ved hjælp af felt-relevante doser af fungicider, en serie af eksperimenter har udviklet for at give en finere beskrivelse af mikrobielle samfund dynamics fungicid-eksponerede pollen. Forskydninger i de strukturelle sammensætning af svampe- og bakterieinfektioner assemblager inden for pollen microbiome er undersøgt af næste generation sequencing og metagenomic analyse. Eksperimenter udviklet heri har været designet til at give en mekanistisk forståelse af hvordan fungicider påvirker microbiome pollen-bestemmelser. I sidste ende, disse resultater bør kaste lys over den indirekte vej hvorigennem fungicider kan være årsag koloni falder.

Felt bur undersøgelse:
Data fra bur forsøg viste, at bumble bee kolonier havde en betydelig reaktion på fungicid eksponering. Fungicid behandlet staderne produceret betydeligt færre arbejdstagere (12,2 ± 3.8, gennemsnit ± SE) end kontrol nældefeber (43,2 ± 11.2, F1,9= 6.8, p = 0,03) (figur 4). Derudover var bee biomasse af fungicid behandlet nældefeber (0,...

Watch this Scientific Journal Video about Empirical, Metagenomic, and Computational Techniques Illuminate the Mechanisms by which Fungicides Compromise Bee Health at JoVE.com

Empirical, Metagenomic, and Computational Techniques Illuminate the Mechanisms by which Fungicides Compromise Bee Health

Mikrobielle konsortier i bumble bee nældefeber berige og bevare pollen til bee larver. Ved hjælp af næste generation sequencing, laboratorium og feltbaseret eksperimenter, beskriver dette manuskript protokoller, der bruges til at teste hypotesen at fungicid restkoncentrationer alter pollen microbiome og koloni demografi, i sidste ende fører til kolonien tab.

Empiriske, Metagenomic og beregningsmæssige teknikker belyse mekanismerne af som fungicider kompromis biers sundhed

Growers often use fungicide sprays during bloom to protect crops against disease, which exposes bees to fungicide residues. Although considered ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Environment

Ecology

Population and Community Ecology

SCIENTISTS IN ACTION

Optimized Negative Staining: a High-throughput Protocol for Examining Small and Asymmetric Protein Structure by Electron Microscopy

Optimeret negativ farvning: en High-throughput protokol for behandlingen Små og asymmetrisk proteiners struktur ved elektronmikroskopi

Structural determination of proteins is rather challenging for proteins with molecular masses between 40 - 200 kDa. Considering that more than half of ...

Spotting Cheetahs: Identifying Individuals by Their Footprints

Spotting Geparder: Identifikation Personer ved deres fodspor

The cheetah (Acinonyx jubatus) is Africa's most endangered large felid and listed as Vulnerable with a declining population trend by the IUCN1. It ranges ...

Evaluating the Effect of Environmental Chemicals on Honey Bee Development from the Individual to Colony Level

Evaluering af effekten af ​​Environmental Chemicals på Honey Bee Udvikling fra den enkelte til Colony Level

The presence of pesticides in the beekeeping environment is one of the most serious problems that impacts the life of a honey bee. Pesticides can be ...

Nanopore DNA Sequencing for Metagenomic Soil Analysis

Nanopore DNA-sekventering for Metagenomic jordbundsanalyser

This article describes the steps for construction of a DNA library from soil, preparation and use of the nanopore flow cell, and analysis of the DNA ...

RGB and Spectral Root Imaging for Plant Phenotyping and Physiological Research: Experimental Setup and Imaging Protocols

RGB og spektral Root tænkelig nemlig plante fænotyper og fysiologiske forskning: eksperimentel opsætning og Imaging protokoller

Better understanding of plant root dynamics is essential to improve resource use efficiency of agricultural systems and increase the resistance of crop ...

Techniques for Investigating the Anatomy of the Ant Visual System

Teknikker til undersøgelse af anatomien af Ant visuelle System

This article outlines a suite of techniques in light microscopy (LM) and electron microscopy (EM) which can be used to study the internal and external eye ...

Isolation of Mandibular Gland Reservoir Contents from Bornean 'Exploding Ants' (Formicidae) for Volatilome Analysis by GC-MS and MetaboliteDetector

Isolation of Mandibular Gland Reservoir Contents from Bornean 'Exploding Ants' Formicidae for Volatilome Analysis by GC-MS and MetaboliteDetector

Isolering af Mandibular kirtel Reservoir indholdet fra Bornean ' eksploderende myrer (Formicidae) for Volatilome analyse af GC-MS og MetaboliteDetector

The aim of this manuscript is to present a protocol describing the metabolomic analysis of Bornean &#39;exploding ants&#39; belonging to the Colobopsis ...

In Situ Hybridization Techniques for Paraffin-Embedded Adult Coral Samples

In Situ Hybridization Techniques for Paraffin-Embedded Adult Coral Samples

In Situ Hybridisering teknikker til Paraffin-Embedded voksen koraller prøver

Corals are important ocean invertebrates that are critical for overall ocean health as well as human health. However, due to human impacts such as rising ...

Necropsy-based Wild Fish Health Assessment

Obduktion-baserede vilde fisk sundhedsvurdering

Anthropogenic influences from increased nutrients and chemical contaminants, to habitat alterations and climate change, can have significant effects on ...

Measuring Hypopharyngeal Gland Acinus Size in Honey Bee (Apis mellifera) Workers

Measuring Hypopharyngeal Gland Acinus Size in Honey Bee Apis mellifera Workers

Måling af Hypopharyngeal kirtel Acinus størrelse i honningbi (Apis mellifera) arbejdstagere

The nurse hypopharyngeal glands produce the protein fraction of the worker and royal jelly that is fed to developing larvae and queens. These paired ...