Name: empirical, metagenomic, and computational techniques illuminate the mechanisms by which fungicides compromise bee health
Uploaded: 2017-10-09T12:30:00
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O autor (es) graças a instalação de sequenciamento de Universidade de Wisconsin biotecnologia centro DNA para fornecer amplificação e instalações de sequenciamento e serviços, Caitlin Carlson, Jennifer Knack, Jake Otto e Max Haase para prestação de assistência técnica com análise molecular. Este trabalho foi financiado por fundos do USDA-Agricultural Research Service, que se apropriou (atual Research Information System #3655-21220-001). Apoio adicional foi fornecido pela National Science Foundation (sob Grant no. Deb-1442148), o centro de pesquisa de bioenergia do DOE grandes lagos (DOE escritório de ciência DE BER-FC02-07ER64494) e o USDA National Institute of Food e agricultura (projeto 1003258 do Hatch). C.T.H. é um estudioso do Pew em ciências biomédicas e Fellow Alfred Toepfer faculdade, suportado pelo Pew Charitable Trusts e a Fundação Alexander von Humboldt, respectivamente.

1. examinar o efeito de fungicida de exposição na Bumble Bee Colony sucesso usando gaiola experimentos de campo <ol><li>Set até dez gaiolas de malha em um campo plantaram com aveia. Cavar uma trincheira ao redor de cada gaiola e todas as quatro bordas da gaiola malha cavar o solo para garantir que as abelhas não podem escapar. Estocar as gaiolas com plantas em vasos, que são conhecidas por ser atrativo para as abelhas (por exemplo, trigo mourisco, borragem, alyssum, cosmos e girassóis) (<strong class="x...

Investigações sobre os efeitos dos fungicidas na saúde das abelhas permaneceram um aspecto pouco estudado de estratégias de manejo de pragas. Nosso estudo visa colmatar esta lacuna de conhecimento por meio de um conjunto de técnicas complementares que explicitamente isolar os fatores potenciais abelha declínios de condução. O planejamento, lógica e processamento dessas experiências são detalhados abaixo.
É importante garantir que não há abelhas podem escapar da malha das experiê...

Gerenciado e espécie de abelha selvagem está experimentando o declínio generalizado, com implicações importantes para ambos os sistemas naturais e agrícolas1. Apesar de esforços concertados para compreender as causas deste problema, os fatores que levam mel abelha declínios ainda não estão bem compreendidas2,3,4. Para certas espécies de abelhas selvagens, nativas, a situação tornou-se terríveis5,6. Se as populações de abelhas não podem ser sustentadas quando eles se cruzam com a agricultura industrial, as suas populações continuará a cair e as culturas que exigem polinizadores (35% da produção mundial7) irão perdurar reduziram das colheitas.
Enquanto muitos potenciais fatores tais como a exposição de pesticidas, doenças e habitat perda1,4,8,9,10 têm sido implicados em declínio de abelha do mel, relativamente pouco é conhecido sobre o efeito interativo desses estressores na saúde de abelhas nativas, dentro ou perto de sistemas agrícolas. Muitos esforços de pesquisa atual continuam a concentrar-se em inseticidas, (por exemplo,11,de neonicotinoides12), embora a pesquisa última indica que fungicidas podem também desempenhar um papel em declínio de abelha por prejudicando a formação da memória, recepção olfativa13, ninho reconhecimento14, atividade enzimática e funções metabólicas15,16,17. Globalmente, fungicidas continuam a ser aplicados nas culturas de floração durante a flor. Estudos recentes têm documentado que as abelhas comumente trazem resíduos do fungicida volta para a colmeia18, de fato, estudos têm demonstrado uma grande proporção de colmeias testadas contidas fungicida resíduos19,20. Continuação dos trabalhos revelou aquele resíduo de fungicida é associado com altas taxas de mel de abelha mortalidade larval21,22,23 e a presença de "sepultado pólen" dentro de colônias, que embora não-tóxico, é desprovida de atividade microbiana e é nutricionalmente comprometido24. Apesar do fato de que fungicidas tem sido consideradas "abelha-cofre", agora há evidência que a exposição ao fungicida sozinha pode causar perdas severas de colônia em uma espécie de abelha nativa bumble, Bombus impatiens25.
Para estabelecer o nexo de causalidade entre a exposição de fungicida e colônia mortalidade, o modus operandi destes produtos químicos precisa ser determinado. Como evidenciado em solos26e sedimentos27ambientes aquáticos28, alvejando os fungos, os fungicidas mais prováveis alteram abundância de fungos e diversidade dentro de pólen-disposições, invocando, assim, uma grande comunidade mudar isso fortemente pode favorecer as bactérias. Sem fungos competidores ou antagonistas, certas bactérias patogênicas podem proliferar relativamente desmarcada, facilitando a deterioração de pólen-disposições. Passado a pesquisa demonstrou que os microorganismos, particularmente leveduras e fungos filamentosos, servir como simbiontes nutricionais para abelhas29,30,31, proteger contra parasitas e patógenos32 ,33e fornecer a preservação a longo prazo das lojas de pólen. Fungicidas, portanto, podem indiretamente prejudicar as abelhas imaturas por perturbar a comunidade microbiana que é necessário para fornecer estes serviços e/ou pelo aumento da suscetibilidade a de parasitas e patógenos oportunistas12. Com o aumento da demanda na produção de alimentos, culturas em todo o mundo estão sendo pulverizadas cada ano com fungicidas durante flor, ressaltando a necessidade de compreender a magnitude de tais efeitos fungicida-induzida.
Até à data, as lacunas de conhecimento primário relacionados com abelhas nativas microbiana ecologia pode ser representada pelas seguintes perguntas: em que medida fungicida muda a comunidade microbiana dentro de pólen de abelha-disposições? Quais são os impactos a jusante de consumir pólen com uma comunidade microbiana profundamente alterada? De acordo com estas perguntas ecologicamente relevantes, experimentos foram desenvolvidos com os principais objetivos de revelar 1) desse resíduo de fungicida sozinho pode causar declínio grave colônia em uma espécie de abelha nativa; 2) o grau a que as comunidades microbianas em pólen-disposições são alteradas por fungicidas e 3) como a saúde das abelhas é afetado por uma comunidade microbiana severamente alterada. Os objetivos experimentais foram definidos para abordar as questões acima, usando uma combinação de experimentos baseados em laboratório e campo. Usando metagenomic de estado-da-arte e técnicas moleculares ao lado dos métodos tradicionais de observações de campo, esta pesquisa tem como objetivo reunir os potenciais efeitos dos fungicidas sobre a saúde das abelhas.
O primeiro objectivo deste estudo é demonstrar que a exposição de fungicida sozinho pode causar perdas de colônias significativas entre as espécies de abelhas nativas. Um estudo envolvendo gaiolas de campo grande foi usado para investigar os efeitos da exposição de fungicida sobre o crescimento da colônia de Bombus impatiens, uma abelha nativa onipresente, abundante nos Estados Unidos (Figura 1, Figura 2, Figura 3). Foi hipotetisado que urticária tratada com fungicida apresentaria menor aptidão e demografia atípica comparado a urticária não-expostos. Dados obtidos neste experimento com suporte a esta hipótese, demonstrando que os resíduos do fungicida dentro de pólen podem ser a única causa de perdas de colônias profunda em um nativo bumble bee espécie25. O segundo objectivo deste estudo é investigar a resposta do pólen microbiome para exposição de fungicida. A hipótese é de que a composição da comunidade de micróbios dentro de pólen-disposições expostos aos fungicidas será diferente do pólen não tratada. Enquanto a diversidade e abundância de fungos são esperados para diminuir significativamente, bactérias e/ou uma única espécie fúngica dominante provavelmente crescerá desmarcada na ausência de outros fungos concorrentes. Através de uma série de ensaios in vivo , estas mudanças na composição da comunidade microbiana serão analisadas usando metagenômica.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Natupol Beehive</td>
			<td>Koppert</td>
			<td>USRESM1</td>
			<td>16 hives</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propiconazole 14.3</td>
			<td>Quali-Ppro</td>
			<td>60207-90-1</td>
			<td>Propiconazole 14.3%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Abound</td>
			<td>Syngenta</td>
			<td>4033540</td>
			<td>Azoxystrobin 22.9%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorothalonil</td>
			<td>Syngenta</td>
			<td>3452</td>
			<td>Fungicide used for trials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pollen granules</td>
			<td>Bee rescued</td>
			<td>B004D5650C</td>
			<td>3X 16oz bottles, pollen for trials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial strains for inoculation</td>
			<td>Currie Lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast strains for inoculation</td>
			<td>Hittinger lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer pairs</td>
			<td>UW Biotech Center</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Isolation Kit</td>
			<td>Mo Bio</td>
			<td>12830-50</td>
			<td>Commercial DNA isolation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Q32851</td>
			<td>DNA quantification tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Select Master Mix for CFX</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>4472952</td>
			<td>Used to perform real-time PCR using SYBR GreenER dye.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1855196</td>
			<td>Instrument used for PCR amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Clean-Up Kit,</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>10159-696</td>
			<td>Used for efficient removal of unincorporated dNTPs, salts and enzymes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA 1000 Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1504</td>
			<td>Used for sizing and analysis of DNA fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiSeq Sequencer</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td>Used for next-generation sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assorted glassware (beaker, flasks, pipettes, test tubes, repietters)</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

empirical, metagenomic, and computational techniques illuminate the mechanisms by which fungicides compromise bee health

Os cultivadores costumam usam sprays de fungicida durante a flor para proteger as culturas contra a doença, que expõe as abelhas a resíduos do fungicida. Embora considerado "abelha-cofre", há evidência de montagem que resíduos do fungicida no pólen são associados com declínios de abelha (para espécies de tanto mel e bumble bee). Enquanto os mecanismos permanecem relativamente desconhecidos, pesquisadores têm especulado que a simbiose de abelha-micróbio está envolvidos. Micróbios desempenham um papel fundamental na preservação e/ou processamento de pólen, que serve como nutrição para abelhas larvas. Alterando a comunidade microbiana, é provável que os fungicidas interrompem esses serviços de micróbio-mediada e, assim, comprometem a saúde das abelhas. Este manuscrito descreve os protocolos usados para investigar o mecanismo (s) indireto pelo qual fungicidas podem estar causando declínio da colônia. Experimentos de gaiola, expondo as abelhas para flores tratada com fungicida já forneceram a primeira evidência que fungicidas causam perdas de colônias profunda em uma abelha nativa (Bombus impatiens). Utilizando doses de campo relevantes de fungicidas, uma série de experimentos foram desenvolvidos para fornecer uma descrição mais fina da dinâmica da comunidade microbiana de pólen fungicida-expostos. Mudanças na composição estrutural de assemblages fúngicas e bacterianas dentro o pólen microbiome são investigadas pela próxima geração sequenciamento e análise metagenomic. Experimentos desenvolvidos neste documento foram projetados para fornecer uma compreensão mecanicista dos como fungicidas afetam a microbiome de pólen-disposições. Em última análise, estas conclusões devem lançar luz sobre a via indirecta, através dos quais fungicidas podem estar causando declínios de colônia.

Estudo de gaiola de campo:
Dados obtidos a partir das experiências de gaiola mostram que as colônias de abelhas bumble tinham uma resposta significativa à exposição de fungicida. As colmeias tratada com fungicida produziram significativamente menos trabalhadores (12,2 ± 3,8, média ± SE) do que as colmeias de controle (43,2 ± 11,2, F1,9= 6.8, p = 0,03) (Figura 4</st...

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Empirical, Metagenomic, and Computational Techniques Illuminate the Mechanisms by which Fungicides Compromise Bee Health

Consórcios microbianos dentro bumble colmeias enriquecem e preservar o pólen para larvas de abelha. Usando o sequenciamento de próxima geração, juntamente com o laboratório e experiências no terreno, este manuscrito descreve protocolos usados para testar a hipótese de que resíduos do fungicida alteram o pólen microbiome e demografia de colônia, finalmente levando à colônia perda.

Técnicas empíricas, metagenômicas e computacionais iluminam os mecanismos pelos quais os fungicidas comprometem a saúde das abelhas

Growers often use fungicide sprays during bloom to protect crops against disease, which exposes bees to fungicide residues. Although considered ...

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