Name: empirical, metagenomic, and computational techniques illuminate the mechanisms by which fungicides compromise bee health
Uploaded: 2017-10-09T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Empirical, Metagenomic, and Computational Techniques Illuminate the Mechanisms by which Fungicides Compromise Bee Health at JoVE.com

Författaren tackar University of Wisconsin bioteknik Center DNA sekvensering anläggningen för förstärkning och sekvensering faciliteter och tjänster, Caitlin Carlson, Jennifer Knack, Jake Otto och Max Haase för tekniskt stöd med Molekylär analys. Detta arbete stöds av USDA-Agricultural Research Service avsatt medel (nuvarande forskning Information System #3655-21220-001). Ytterligare stöd tillhandahölls av National Science Foundation (under Grant nr DEB-1442148), DOE Great Lakes Bioenergy Research Center (DOE Office av vetenskap BER DE-FC02-07ER64494), och USDA nationella institutet för livsmedel och jordbruk (Hatch projektet 1003258). C.T.H. är en Pew lärd i biomedicinsk vetenskap och en Alfred Toepfer fakulteten Fellow, stöds av de Pew Charitable Trusts och Alexander von Humboldt-stiftelsen, respektive.

1. undersöka effekten av fungicid exponeringen på Bumble Bee kolonin framgång med bur fältexperiment <ol><li>uppsättning upp tio mesh burar i ett fält som är planterad med havre. Gräva ett dike runt varje bur, och gräva alla fyra kanter av mesh buren i marken för att säkerställa att bina inte kan undkomma. Lagerför burar med, blommande krukväxter som är kända för att vara attraktiv för bin (t.ex. bovete, gurkört, alyssum, kosmos och solrosor) ( figur 2).</li>
	...

Undersökningar om effekterna av fungicider på bins hälsa förblivit en understudied aspekt av pest förvaltningsstrategier. Vår studie syftar till att överbrygga denna kunskap med hjälp av en uppsättning kompletterande tekniker som uttryckligen isolerar de potentiella faktorer som driver bee nedgångar. Planering, logik, och rendering av dessa experiment beskrivs nedan.
Det är viktigt att säkerställa att inga bin tillåts fly maskorna bur experimenten, eftersom detta skulle äventyra...

Hanteras och vilda bee arter upplever utbredda nedgångar, med stora konsekvenser för både naturliga och jordbruks system1. Trots gemensamma ansträngningar för att förstå orsakerna till problemet, är de faktorer som driver honey bee minskar fortfarande inte förstådda2,3,4. För vissa arter av vilda, inhemska bin, har situationen blivit ödesdigra5,6. Om bisamhällena inte kan upprätthållas när de skär med industriellt jordbruk, deras befolkningar kommer att fortsätta att falla och de grödor som kräver pollinatörer (35% av världsproduktionen7) kommer att uthärda minskade skördar.
Medan många potentiella faktorer såsom bekämpningsmedel exponering, sjukdom och livsmiljö förlust1,4,8,9,10 har varit inblandade i honey bee nedgång, relativt är lite känt om interaktiva effekten av dessa stressfaktorer på inhemska bin hälsa, inom eller nära jordbrukssystem. Många aktuella forskningsinsatser fortsätta att fokusera på insektsmedel, (t.ex., neonicotinoids11,12), även om tidigare forskning visar att fungicider kan också spela en roll i bee nedgång genom att försämra minnesbildning, Olfactory receptionen13, boet erkännande14, enzymaktivitet och metaboliska funktioner15,16,17. Globalt, fortsätta fungicider att tillämpas på blommande grödor under bloom. Nyare studier har dokumenterat att bina tar vanligen fungicid rester tillbaka till kupan18, i själva verket, studier har visat en stor andel av testade nässelutslag innehöll fungicid rester19,20. Ytterligare arbete har visat att fungicid rester är associerade med höga honey bee larval dödlighet21,22,23 och förekomsten av ”entombed pollen” inom kolonier, som även icke-toxisk, saknar mikrobiell aktivitet och är näringsmässigt komprometterad24. Trots att fungicider har länge ansetts vara ”bee-safe”, finns nu bevis att exponering för fungicid ensam kan orsaka svår kolonin förluster i en native bumble bee art, Bombus impatiens25.
För att fastställa orsakssamband mellan fungicid exponering och kolonin dödlighet, det modus operandi av dessa kemikalier behöver fastställas. Som framgår i jordar26, sediment27och vattenmiljöer28, genom att rikta svampar, fungicider troligen förändra svamp överflöd och mångfalden inom pollen-bestämmelser, därmed åberopa en större gemenskap SKIFT som kan starkt gynna bakterier. Utan svamp konkurrenter eller antagonister, kan vissa patogena bakterier föröka relativt oskyddad, underlätta nedbrytning av pollen-bestämmelser. Tidigare forskning har visat att mikroorganismer, särskilt jäst och filamentösa svampar, tjäna som näringsmässiga symbionter för bin29,30,31, skyddar mot parasiter och patogener32 ,33, och ger långsiktigt bevarande av pollen butiker. Fungicider, kan därför indirekt skada omogna bina genom att störa mikrobiell gemenskapen som behövs för att tillhandahålla dessa tjänster och/eller genom att öka känsligheten för opportunistiska patogener och parasiter12. Med ökande krav på livsmedelsproduktion, är grödor i världen att besprutas varje år med fungicider under Blom, vilket understryker behovet av att förstå omfattningen av sådana fungicid-inducerad effekter.
Till-datum, de primära kunskapsluckorna som avser inhemska biet mikrobiell ekologi kan representeras av följande frågor: i vilken utsträckning ändrar fungicid mikrobiell gemenskapen inom bee pollen-bestämmelser? Vad är nedströms effekterna av konsumerar pollen med en djupt förändrade mikrobiell gemenskap? I linje med dessa ekologiskt nära förbunden frågor, framkallades experiment med de primära målen för att avslöja 1) som fungicid rester ensam kan orsaka svår kolonin nedgång i en native bee arter. 2) graden som mikrobiella samhällen i pollen-bestämmelser ändras med fungicider, och 3) hur binas hälsa påverkas av en kraftigt förändrad mikrobiell gemenskap. De experimentella mål definierades för att ta itu med ovanstående frågor med en kombination av laboratorium och fält-baserade experiment. Använda state-of-the-art gjorts och molekylärbiologiska metoder parallellt med traditionella metoder för fältet observation, syftar denna forskning till att pussla ihop de potentiella effekterna av fungicider på bihälsa.
Det första syftet med denna studie är att visa att fungicid exponering ensam kan orsaka betydande kolonin förluster bland infödda bee arter. En studie på stora fältet burar användes för att undersöka effekterna av fungicid exponering på kolonin tillväxten av Bombus impatiens, en allestädes närvarande, riklig infödda bee i USA (figur 1, figur 2, figur 3). Det antogs att fungicid-behandlade bikupor skulle presentera lägre fitness och atypiska demografi jämfört med icke-exponerade nässelutslag. Data som erhållits från detta experiment stödde denna hypotes, visar att fungicid rester inom pollen kan vara den enda orsaken till djupgående kolonin förluster i en native bumble bee arter25. Det andra syftet med denna studie är att undersöka den pollen mikrobiomet svar på fungicid exponering. Det är en hypotes om att annan obehandlad pollen gemenskapen sammansättningen av mikrober inom pollen-bestämmelserna utsätts för fungicider. Medan svamp populationsstorlek och mångfald väntas minska kraftigt, bakterier eller en enda dominerande svamp art kommer sannolikt att växa okontrollerat i avsaknad av andra konkurrerande svampar. Genom en serie av in vivo - studier, kommer att dessa förskjutningar i mikrobiell gemenskapen sammansättning analyseras med metagenomik.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Natupol Beehive</td>
			<td>Koppert</td>
			<td>USRESM1</td>
			<td>16 hives</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propiconazole 14.3</td>
			<td>Quali-Ppro</td>
			<td>60207-90-1</td>
			<td>Propiconazole 14.3%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Abound</td>
			<td>Syngenta</td>
			<td>4033540</td>
			<td>Azoxystrobin 22.9%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorothalonil</td>
			<td>Syngenta</td>
			<td>3452</td>
			<td>Fungicide used for trials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pollen granules</td>
			<td>Bee rescued</td>
			<td>B004D5650C</td>
			<td>3X 16oz bottles, pollen for trials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacterial strains for inoculation</td>
			<td>Currie Lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast strains for inoculation</td>
			<td>Hittinger lab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer pairs</td>
			<td>UW Biotech Center</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Isolation Kit</td>
			<td>Mo Bio</td>
			<td>12830-50</td>
			<td>Commercial DNA isolation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Q32851</td>
			<td>DNA quantification tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Select Master Mix for CFX</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>4472952</td>
			<td>Used to perform real-time PCR using SYBR GreenER dye.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-Time PCR Detection System</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1855196</td>
			<td>Instrument used for PCR amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Clean-Up Kit,</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>10159-696</td>
			<td>Used for efficient removal of unincorporated dNTPs, salts and enzymes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA 1000 Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1504</td>
			<td>Used for sizing and analysis of DNA fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiSeq Sequencer</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td>Used for next-generation sequencing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assorted glassware (beaker, flasks, pipettes, test tubes, repietters)</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

empirical, metagenomic, and computational techniques illuminate the mechanisms by which fungicides compromise bee health

Odlare använder ofta fungicid sprayer under Blom för att skydda grödor mot sjukdomen som exponerar bina att fungicid rester. Även om anses ”bee-safe”, finns det montering bevis att fungicid rester i pollen är förknippade med bee nedgång (för både honung och bumble bee arter). Medan mekanismerna är fortfarande relativt okänt, har forskare spekulerat att bee-mikrob Symbiosar är inblandade. Mikrober spelar en central roll i bevarandet eller bearbetning av pollen, som fungerar som näring för larval bin. Genom att förändra mikrobiell gemenskapen, är det troligt att fungicider störa dessa mikrob-medierad tjänster, och därmed äventyra bihälsa. Detta manuskript beskriver de protokoll som används för att undersöka de indirekta mekanismerna som fungicider som orsakar kolonin nedgång. Cage experiment utsätta bina att fungicid-behandlade blommor har redan lämnat det första beviset att fungicider orsaka djupgående kolonin förluster i en native humla (Bombus impatiens). Använder fältet-relevanta doser av fungicider, en serie experiment har utvecklats för att ge en finare Beskrivning av mikrobiell gemenskapens dynamik av fungicid-exponerade pollen. Förskjutningar i strukturella sammansättning av svamp och bakteriella konstellationer inom den pollen mikrobiomet utreds av nästa generations sekvensering och gjorts analys. Experiment som framkallade häri har utformats för att ge en mekanistisk förståelse av hur fungicider påverkar mikrobiomet pollen-bestämmelser. Slutligen, dessa fynd bör belysa den indirekta vägen genom vilken fungicider som orsakar kolonin nedgångar.

Cage fältstudie:
Data som erhållits från de bur experiment visade att bumble bee kolonierna hade en betydande svar på fungicid exponering. Fungicid-behandlade bikupor producerad betydligt färre arbetstagare (12,2 ± 3,8, medelvärde ± SE) än kontroll kuporna (43,2 ± 11.2, F1,9= 6,8, p = 0,03) (figur 4). Dessutom var bee biomassa av fungicid-behandlade bikup...

Watch this Scientific Journal Video about Empirical, Metagenomic, and Computational Techniques Illuminate the Mechanisms by which Fungicides Compromise Bee Health at JoVE.com

Empirical, Metagenomic, and Computational Techniques Illuminate the Mechanisms by which Fungicides Compromise Bee Health

Mikrobiell konsortier inom bumble bee bikupor berika och bevara pollen för bee larver. Detta manuskript med nästa generations sekvensering, tillsammans med laboratorium och fältbaserade experiment, och beskriver protokoll som används för att testa hypotesen att fungicid rester förändra pollen microbiom, och kolonin demografi, vilket slutligen leder till kolonin förlust.

Empirisk, gjorts och beräkningstekniker belysa mekanismerna genom vilka fungicider kompromiss bihälsa

Growers often use fungicide sprays during bloom to protect crops against disease, which exposes bees to fungicide residues. Although considered ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Environment

Ecology

Population and Community Ecology

SCIENTISTS IN ACTION

Optimized Negative Staining: a High-throughput Protocol for Examining Small and Asymmetric Protein Structure by Electron Microscopy

Optimerad Negativ Färgning: a hög kapacitet protokoll för prövningen Liten och Asymmetric Protein Structure genom elektronmikroskopi

Structural determination of proteins is rather challenging for proteins with molecular masses between 40 - 200 kDa. Considering that more than half of ...

Spotting Cheetahs: Identifying Individuals by Their Footprints

Spotting Cheetahs: identifiera individer av deras fotspår

The cheetah (Acinonyx jubatus) is Africa's most endangered large felid and listed as Vulnerable with a declining population trend by the IUCN1. It ranges ...

Evaluating the Effect of Environmental Chemicals on Honey Bee Development from the Individual to Colony Level

Utvärdera effekten av kemikalier i miljön på Honey Bee utveckling från individen till Colony nivå

The presence of pesticides in the beekeeping environment is one of the most serious problems that impacts the life of a honey bee. Pesticides can be ...

Nanopore DNA Sequencing for Metagenomic Soil Analysis

Nanopore DNA-sekvensering för gjorts Jordanalys

This article describes the steps for construction of a DNA library from soil, preparation and use of the nanopore flow cell, and analysis of the DNA ...

RGB and Spectral Root Imaging for Plant Phenotyping and Physiological Research: Experimental Setup and Imaging Protocols

RGB och spektrala Root Imaging för växt fenotypning och fysiologisk forskning: experiment och Imaging protokoll

Better understanding of plant root dynamics is essential to improve resource use efficiency of agricultural systems and increase the resistance of crop ...

Techniques for Investigating the Anatomy of the Ant Visual System

Tekniker för att utreda det Ant visuella systemet anatomi

This article outlines a suite of techniques in light microscopy (LM) and electron microscopy (EM) which can be used to study the internal and external eye ...

Isolation of Mandibular Gland Reservoir Contents from Bornean 'Exploding Ants' (Formicidae) for Volatilome Analysis by GC-MS and MetaboliteDetector

Isolation of Mandibular Gland Reservoir Contents from Bornean 'Exploding Ants' Formicidae for Volatilome Analysis by GC-MS and MetaboliteDetector

Isolering av Mandibular körtel reservoar innehållet från Bornean ' exploderande myror (Formicidae) för Volatilome analys med GC-MS- och MetaboliteDetector

The aim of this manuscript is to present a protocol describing the metabolomic analysis of Bornean &#39;exploding ants&#39; belonging to the Colobopsis ...

In Situ Hybridization Techniques for Paraffin-Embedded Adult Coral Samples

In Situ Hybridization Techniques for Paraffin-Embedded Adult Coral Samples

In Situ Hybridisering tekniker för Paraffin-inbäddat vuxen korall prover

Corals are important ocean invertebrates that are critical for overall ocean health as well as human health. However, due to human impacts such as rising ...

Necropsy-based Wild Fish Health Assessment

Obduktion-baserade vild fisk hälsoundersökning

Anthropogenic influences from increased nutrients and chemical contaminants, to habitat alterations and climate change, can have significant effects on ...

Measuring Hypopharyngeal Gland Acinus Size in Honey Bee (Apis mellifera) Workers

Measuring Hypopharyngeal Gland Acinus Size in Honey Bee Apis mellifera Workers

Mäta Hypopharyngeal körtel Acinus storlek i honungsbiet (Apis mellifera) arbetstagare

The nurse hypopharyngeal glands produce the protein fraction of the worker and royal jelly that is fed to developing larvae and queens. These paired ...