Name: a fluorescence-based assay of phospholipid scramblase activity
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00
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This study was supported by the Velux Stiftung (A.K.M.), NIH grant EY024207 (A.K.M.) and the Austrian Science Fund (FWF) project J3686 (B.P.).

1. Preparazione di liposomi e proteoliposomi <ol><li> Formazione liposomi <ol><li> Usando una siringa di vetro, aggiungere 1.435 microlitri POPC (25 mg / ml, in cloroformio) e 160 microlitri POPG (25 mg / ml, in cloroformio) in un pallone a fondo rotondo da ottenere 52,5 mmol lipidi in un rapporto molare di POPC: POPG = 9: 1. </li><li> Essiccare i lipidi per 30 minuti usando un evaporatore rotante ad una velocità di rotazione di 145 rpm (senza bagno d&#39;acqua è necessaria per questo volume di solvente), quindi tra...

<ol>
	<li>Ernst, O. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+and+animal+rhodopsins:+structures,+functions,+and+molecular+mechanisms.">Microbial and animal rhodopsins: structures, functions, and molecular mechanisms.</a> Chem. Rev. 114, 126-163 (2014).</li><li>Menon, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opsin+is+a+phospholipid+flippase.">Opsin is a phospholipid flippase.</a> Curr. Biol. CB. 21, 149-153 (2011).</li><li>Goren, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+phospholipid+scramblase+activity+of+a+G+protein-coupled+receptor.">Constitutive phospholipid scramblase activity of a G protein-coupled receptor.</a> Nat. Commun. 5, 5115 (2014).</li><li>Ernst, O. P., Menon, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipid+scrambling+by+rhodopsin.">Phospholipid scrambling by rhodopsin.</a> Photochem. Photobiol. Sci. Off. J. Eur. Photochem. Assoc. Eur. Soc. Photobiol. , (2015).</li><li>Sanyal, S., Menon, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flipping+lipids:+why+an'+what's+the+reason+for?.">Flipping lipids: why an' what's the reason for?.</a> ACS Chem. Biol. 4, 895-909 (2009).</li><li>Bevers, E. M., Williamson, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipid+scramblase:+an+update.">Phospholipid scramblase: an update.</a> FEBS Lett. 584, 2724-2730 (2010).</li><li>Leventis, P. A., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distribution+and+function+of+phosphatidylserine+in+cellular+membranes.">The distribution and function of phosphatidylserine in cellular membranes.</a> Annu. Rev. Biophys. 39, 407-427 (2010).</li><li>Quazi, F., Lenevich, S., Molday, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ABCA4+is+an+N-retinylidene-phosphatidylethanolamine+and+phosphatidylethanolamine+importer.">ABCA4 is an N-retinylidene-phosphatidylethanolamine and phosphatidylethanolamine importer.</a> Nat. Commun. 3, 925 (2012).</li><li>Quazi, F., Molday, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP-binding+cassette+transporter+ABCA4+and+chemical+isomerization+protect+photoreceptor+cells+from+the+toxic+accumulation+of+excess+11-cis-retinal.">ATP-binding cassette transporter ABCA4 and chemical isomerization protect photoreceptor cells from the toxic accumulation of excess 11-cis-retinal.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 5024-5029 (2014).</li><li>Ben-Shabat, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+a+nonaoxirane+from+A2E,+a+lipofuscin+fluorophore+related+to+macular+degeneration,+and+evidence+of+singlet+oxygen+involvement.">Formation of a nonaoxirane from A2E, a lipofuscin fluorophore related to macular degeneration, and evidence of singlet oxygen involvement.</a> Angew. Chem. Int. Ed Engl. 41, 814-817 (2002).</li><li>Sparrow, J. R., Wu, Y., Kim, C. Y., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipid+meets+all-trans-retinal:+the+making+of+RPE+bisretinoids.">Phospholipid meets all-trans-retinal: the making of RPE bisretinoids.</a> J. Lipid Res. 51 (2010), 247-261 (2010).</li><li>Sch&#252;tt, F., Davies, S., Kopitz, J., Holz, F. G., Boulton, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodamage+to+human+RPE+cells+by+A2-E,+a+retinoid+component+of+lipofuscin.">Photodamage to human RPE cells by A2-E, a retinoid component of lipofuscin.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 41, 2303-2308 (2000).</li><li>Picollo, A., Malvezzi, M., Accardi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TMEM16+proteins:+unknown+structure+and+confusing+functions.">TMEM16 proteins: unknown structure and confusing functions.</a> J. Mol. Biol. 427, 94-105 (2015).</li><li>Mohammadi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+FtsW+as+a+transporter+of+lipid-linked+cell+wall+precursors+across+the+membrane.">Identification of FtsW as a transporter of lipid-linked cell wall precursors across the membrane.</a> EMBO J. 30, 1425-1432 (2011).</li><li>Meeske, A. 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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+the+wzxE+gene+of+Escherichia+coli+K-12+encodes+a+protein+involved+in+the+transbilayer+movement+of+a+trisaccharide-lipid+intermediate+in+the+assembly+of+enterobacterial+common+antigen.">Evidence that the wzxE gene of Escherichia coli K-12 encodes a protein involved in the transbilayer movement of a trisaccharide-lipid intermediate in the assembly of enterobacterial common antigen.</a> J. Biol. Chem. 278, 16534-16542 (2003).</li><li>Suzuki, J., Imanishi, E., Nagata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+of+phosphatidylserine+by+Xk-related+protein+family+members+during+apoptosis.">Exposure of phosphatidylserine by Xk-related protein family members during apoptosis.</a> J. Biol. Chem. 289, 30257-30267 (2014).</li><li>Suzuki, J., Nagata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipid+scrambling+on+the+plasma+membrane.">Phospholipid scrambling on the plasma membrane.</a> Methods Enzymol. 544, 381-393 (2014).</li><li>Alaimo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+but+interchangeable+mechanisms+for+flipping+of+lipid-linked+oligosaccharides.">Two distinct but interchangeable mechanisms for flipping of lipid-linked oligosaccharides.</a> EMBO J. 25, 967-976 (2006).</li><li>Ernst, C. M., Peschel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad-spectrum+antimicrobial+peptide+restistance+by+MprF-mediated+aminoacylation+and+flipping+of+phospholipids.">Broad-spectrum antimicrobial peptide restistance by MprF-mediated aminoacylation and flipping of phospholipids.</a> Mol. Microbial. 80 (2), 290-299 (2011).</li><li>Vehring, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flip-flop+of+fluorescently+labeled+phospholipids+in+proteoliposomes+reconstituted+with+Saccharomyces+cerevisiae+microsomal+proteins.">Flip-flop of fluorescently labeled phospholipids in proteoliposomes reconstituted with Saccharomyces cerevisiae microsomal proteins.</a> Eukaryot. Cell. 6, 1625-1634 (2007).</li><li>Rouser, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+dimensional+then+[sic]+layer+chromatographic+separation+of+polar+lipids+and+determination+of+phospholipids+by+phosphorus+analysis+of+spots.">Two dimensional then [sic] layer chromatographic separation of polar lipids and determination of phospholipids by phosphorus analysis of spots.</a> Lipids. 5, 494-496 (1970).</li><li>Rigaud, J. -. L., L&#233;vy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+membrane+proteins+into+liposomes.">Reconstitution of membrane proteins into liposomes.</a> Methods Enzymol. 372, 65-86 (2003).</li><li>Geertsma, E. R., Nik Mahmood, N. A. B., Schuurman-Wolters, G. K., Poolman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+reconstitution+of+ABC+transporters+and+assays+of+translocator+function.">Membrane reconstitution of ABC transporters and assays of translocator function.</a> Nat. Protoc. 3, 256-266 (2008).</li><li>Mimms, L. T., Zampighi, G., Nozaki, Y., Tanford, C., Reynolds, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipid+vesicle+formation+and+transmembrane+protein+incorporation+using+octyl+glucoside.">Phospholipid vesicle formation and transmembrane protein incorporation using octyl glucoside.</a> Biochemistry. 20, 833-840 (1981).</li><li>Malvezzi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2+-dependent+phospholipid+scrambling+by+a+reconstituted+TMEM16+ion+channel.">Ca2+-dependent phospholipid scrambling by a reconstituted TMEM16 ion channel.</a> Nat. Commun. 4, 2367 (2013).</li><li>Eckford, P. D. W., Sharom, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+reconstituted+P-glycoprotein+multidrug+transporter+is+a+flippase+for+glucosylceramide+and+other+simple+glycosphingolipids.">The reconstituted P-glycoprotein multidrug transporter is a flippase for glucosylceramide and other simple glycosphingolipids.</a> Biochem. J. 389, 517-526 (2005).</li><li>Marek, M., G&#252;nther-Pomorski, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+of+Flippase+Activity+in+Proteoliposomes+Using+Fluorescent+Lipid+Derivatives.">Assay of Flippase Activity in Proteoliposomes Using Fluorescent Lipid Derivatives.</a> Methods Mol. Biol. 1377, 181-191 (2016).</li><li>Coleman, J. A., Kwok, M. C. M., Molday, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+purification,+and+functional+reconstitution+of+the+P4-ATPase+Atp8a2,+a+phosphatidylserine+flippase+in+photoreceptor+disc+membranes.">Localization purification, and functional reconstitution of the P4-ATPase Atp8a2, a phosphatidylserine flippase in photoreceptor disc membranes.</a> J. Biol. Chem. 284, 32670-32679 (2009).</li><li>Coleman, J. A., Quazi, F., Molday, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+P4-ATPases+and+ABC+transporters+and+their+role+in+phospholipid+transport.">Mammalian P4-ATPases and ABC transporters and their role in phospholipid transport.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1831, 555-574 (2013).</li><li>Romsicki, Y., Sharom, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipid+flippase+activity+of+the+reconstituted+P-glycoprotein+multidrug+transporter.">Phospholipid flippase activity of the reconstituted P-glycoprotein multidrug transporter.</a> Biochemistry. 40, 6937-6947 (2001).</li><li>Zhou, X., Graham, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+phospholipid+translocase+activity+with+purified+Drs2p,+a+type-IV+P-type+ATPase+from+budding+yeast.">Reconstitution of phospholipid translocase activity with purified Drs2p, a type-IV P-type ATPase from budding yeast.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 16586-16591 (2009).</li></ol>

Il saggio di attività scramblase ci ha permesso inizialmente di determinare che opsin ha fosfolipidi attività scramblase 2. Il test ha anche permesso di caratterizzare l&#39;attività scramblase di opsin testando specificità (abbiamo usato una varietà di lipidi giornalista NBD-etichettati come NBD-fosfatidiletanolamina, marcato con NBD su una catena acilica come mostrato ad NBD-PC in Figura 1A, o headgroup, NBD-sfingomielina o NBD- fosfatidilserina 2), l&#39;effetto di vescicol...

La rodopsina fotorecettore, un G protein-coupled receptor prototipo (recensito ad esempio in riferimento 1), è il primo scramblasi essere identificati e biochimicamente verificato 2,3. Scramblases sono trasportatori fosfolipidi che aumentano il tasso intrinsecamente lento movimento transbilayer fosfolipide a fisiologicamente livelli appropriati in un bidirezionale, modalità ATP-indipendenti 4-6. Esempi di loro azioni possono essere trovati nel reticolo endoplasmatico e batterica membrana citoplasmatica dove è necessaria scrambling costitutivo per l&#39;omeostasi di membrana e la crescita, così come per una varietà di percorsi di glicosilazione 5. Scrambling fosfolipide regolamentata è necessaria per esporre fosfatidilserina (PS) sulla superficie delle cellule apoptotiche dove agisce come un &quot;mangia-me&quot; -signal per macrofagi 7 e fornisce una superficie procoagulante sulle piastrine attivate per catalizzare la produzione di fattore proteicos necessaria per la coagulazione del sangue. In membrane disco fotorecettori, l&#39;attività scrambling di rodopsina è stato suggerito di contrastare lo squilibrio fosfolipidi tra i due volantini membrana del doppio strato che viene generato dalla ATP-dipendente, lipidi unidirezionale flippase ABCA4 4,8,9 10-12. Nonostante l&#39;importanza fisiologica di scramblases, la loro identità è rimasta inafferrabile fino rodopsina è stato segnalato come un scramblase nei dischi dei fotorecettori 2, i membri della famiglia di proteine ​​TMEM16 sono stati identificati come Ca 2+ scramblases -dipendenti necessari per l&#39;esposizione di PS a livello della membrana plasmatica (recensione in riferimento 13), e la proteina batterica FTSW stato proposto come scramblase richiesto un lipide II per la sintesi del peptidoglicano 14. Queste scoperte sono state basate sulla ricostituzione delle proteine ​​purificate in liposomi e dimostrazione di attività scramblase nelle proteoliposomi risultanti mediante la metodologia describcato qui. Altri potenziali scramblases 15-21 - Le proteine ​​MurJ e AMJ implicati nella biosintesi peptidoglicano, WzxE e proteine ​​correlate implicati in rimescolando precursori O-antigene, le proteine ​​MPRF bisogno di traslocare phosphatidylglycerol aminoacylated attraverso la membrana citoplasmatica batterica, e membri della famiglia Xkr8 che sono stati proposti esporre PS sulla superficie delle cellule apoptotiche - restano da testare biochimicamente. Questo mette in evidenza l&#39;importanza di un saggio robusto per identificare e caratterizzare l&#39;attività scramblase. Qui, descriviamo la ricostituzione di opsin purificata, la apoprotein della rodopsina fotorecettore, in grandi vescicole unilamellari (luvs), e la successiva analisi dell&#39;attività scramblase nelle proteoliposomi risultante utilizzando un saggio basato sulla fluorescenza. Ci sono diversi protocolli ben descritto in letteratura per l&#39;espressione eterologa e purificazione di opsin, quindi non ci saràdescriverlo in questo protocollo; usiamo i protocolli descritti nelle Goren et al. 3, che i rendimenti FLAG-tag, opsina termostabile a circa 100 ng / ml a 0,1% (w / v) dodecylmaltoside (DDM). Ricostituzione si ottiene trattando luvs con detersivo sufficiente in modo che si gonfiano, ma non si sciolgono. In queste condizioni, una proteina di membrana - fornita in forma di micelle proteina-detergente - integrerà nei liposomi e diventare ricostituito nella membrana del liposoma alla rimozione del detersivo, causando proteoliposomi. Per ricostituire opsin (ottenuto come proteina purificata nello 0,1% (w / v) DDM), luvs sono preparati da una miscela di POPC (1-palmitoil-2-oleoyl- sn -glycero-3-phosphocholine) e POPG (1- palmitoil-2-oleoyl- SN -glycero-3- [fosfo-rac- (1-glicerolo)]) e satura di DDM prima di aggiungere opsina e NBD-PC. Il detergente viene poi rimosso mediante trattamento del campione con perle di polistirene. lass = &quot;jove_content&quot;&gt; Il principio alla base del saggio basato sulla fluorescenza è mostrato nella Figura 1B. Luvs sono simmetricamente ricostituiti con una quantità traccia di NBD-PC o un altro giornalista di fosfolipidi fluorescente NBD marcato (Figura 1A). In aggiunta ditionito, un non fluorescente dianione membrana impermeant, molecole NBD-PC nel foglietto esterno delle luvs sono resi come nitro-gruppo di NBD è ridotta ad un ammino-gruppo non fluorescente. Poiché né molecole NBD-PC né ditionito sono in grado di attraversare la membrana sulla scala temporale dell&#39;esperimento (&lt;10 min), questo si traduce in una riduzione del 50% del segnale fluorescente. Tuttavia, se i liposomi sono ricostituiti con una scramblase, molecole NBD-PC nel foglietto interno possono rimescolare rapidamente all&#39;esterno dove vengono ridotti. Ciò comporta la perdita totale della fluorescenza nel caso ideale (Figura 1C). es / ftp_upload / 54635 / 54635fig1.jpg &quot;/&gt; . Figura 1: Rappresentazione schematica del saggio di attività scramblase Il saggio utilizza una fluorescenza NBD marcato reporter di lipidi; NBD-PC è mostrato (A). Le grandi vescicole unilamellari sono ricostituiti con una quantità traccia di NBD-PC. Ricostituzione produce vescicole simmetriche, con NBD-PC distribuito equamente negli opuscoli esterne ed interne. Ditionito (S 2 O 4 2-) riduce chimicamente il nitro-gruppo di NBD ad un ammino-gruppo non fluorescente. Trattamento di liposomi privi di proteine ​​con ditionito (B, top) causa una riduzione del 50% della fluorescenza poiché solo le molecole NBD-PC nel foglietto esterno vengono ridotti: ditionito è caricato negativamente e non possono attraversare la membrana per reagire con molecole NBD-PC nel foglietto interno. Trattamento dithionite di proteoliposomi opsin contenenti (B, in basso), vale a dire, proteoliposomi scramblase-attiva, si traduce in perdita di 100% di fluorescence come opsina facilita il movimento di NBD-PC tra l&#39;interno e il foglietto esterno. (C) mostra le tracce di fluorescenza idealizzate ottenuti sul trattamento liposomi senza proteine ​​e proteoliposomi opsin contenenti con ditionito. Il tasso di perdita di fluorescenza è la stessa in entrambi i casi che indicano che la riduzione chimica dei NBD da ditionito è limitante, e che scrambling avviene ad una velocità uguale o superiore alla velocità della reazione chimica. Tracce ottenuti da un esperimento reale sono mostrati in figura 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54635/54635fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> I metodi che descriviamo possono essere utilizzati per ricostituire e saggiare altre proteine ​​purificate, nonché miscele di proteine ​​di membrana ottenute, ad esempio, estraendo microsomi con detergente 22.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1148">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:683px;">1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td>
			<td style="width:141px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:132px;">850457C</td>
			<td style="width:193px;">POPC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (sodium salt)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840457C</td>
			<td>POPG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1-palmitoyl-2-{6-[7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl)amino]hexanoyl}-an-glycero-3-phosphocholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>810130C</td>
			<td>NBD-PC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>EM-5330</td>
			<td>HEPES</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653-1KG</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dodecyl-&#946;-d-maltoside&#160;</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310 5 GM</td>
			<td>DDM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorimeter cuvettes</td>
			<td>sigma</td>
			<td>C0918-100EA</td>
			<td>cuvettes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spectrofluorometer</td>
			<td colspan="2">Photon Technology International, Inc.</td>
			<td>fluorimeter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium hydrosulfite technical grade, 85%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>157953-5G</td>
			<td>dithionite</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GraphPad Prism 5 software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prism</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris Base</td>
			<td>VWR</td>
			<td>JTX171-3</td>
			<td>Tris</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LIPEX 10 mL extruder&#160;</td>
			<td>Northern Lipids, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Extruder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:683px;">Whatman, Drain disc, PE, 25 mm</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:132px;">28156-243</td>
			<td>Disc support</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:683px;">Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes, 0.4 &#181;m, 25 mm diameter</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:132px;">WHA110607</td>
			<td>400 nm membrane</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:683px;">Whatman Nucleopore Track-Etched Membranes, 0.2 &#181;m, 25 mm diameter</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:132px;">WHA110606</td>
			<td>200 nm membrane</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3264-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">VWR Culture Tubes, Disposable, Borosilicate Glass, 13x100 mm</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>47729-572</td>
			<td>glass tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Perchloric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30755-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium Molybdate Tetrahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-7302</td>
			<td>ammonium molybdate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">(+)-Sodium L-ascorbate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7631-25G</td>
			<td>sodium ascorbate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bio-Beads SM2 adsorbents</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1523920</td>
			<td>polystyrene beads</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;2.0 mL Microtubes clear</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>10011-742</td>
			<td>Reconstitution tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reconstitution glass tube</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td style="width:132px;">53283-800</td>
			<td>Reconstitution glass tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zetasizer&#160;</td>
			<td>Malvern&#160;</td>
			<td></td>
			<td>DLS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a fluorescence-based assay of phospholipid scramblase activity

Scramblases traslocano fosfolipidi attraverso il doppio strato di membrana bidirezionale in modo ATP-indipendente. Il primo scramblase per essere identificati e biochimicamente verificato è stato opsin, la apoprotein della rodopsina fotorecettori. Rhodopsin è un recettore accoppiato alla proteina G localizzato in rod fotorecettori membrane a disco della retina dove è responsabile per la percezione della luce. Attività scramblase di Rhodopsin non dipende dal suo ligando 11- cis -retinal, cioè, il opsin apoprotein è anche attivo come scramblase. Sebbene fosfolipidi costitutiva e regolato scrambling svolgono un ruolo importante nella fisiologia cellulare, solo pochi scramblases fosfolipidi sono stati identificati finora oltre opsin. Qui si descrive un saggio di fluorescenza a base di attività di scramblase opsin. Opsina viene ricostituito in grandi liposomi unilamellari composti di fosfatidilcolina, phosphatidylglycerol e una quantità traccia di fluorescenza NBD marcato PC (1-palmitoyl-2- {6- [7-nitro-2-1,3-benzoxadiazole-4-il) ammino] esanoile} - sn -glycero-3-phosphocholine). attività Scramblase è determinata misurando la misura in cui le molecole NBD-PC situati nel foglietto interno della vescicola sono in grado di accedere al foglietto esterno dove la loro fluorescenza viene eliminata chimicamente da un agente riducente che non può attraversare la membrana. I metodi che descriviamo hanno applicabilità generale e può essere utilizzato per identificare e caratterizzare le attività scramblase di altre proteine ​​di membrana.

Descriviamo la ricostituzione di opsin in luvs per caratterizzare la propria attività scramblase usando un test basato sulla fluorescenza. Analizziamo i risultati di porre un limite inferiore del tasso di fosfolipidi opsin mediata scomposizione e per determinare lo stato oligomerico in cui opsin ricostituisce funzionalmente nelle vescicole. Per identificare le condizioni ottimali di ricostituzione, è necessario determinare e...

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A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity

We describe a fluorescence-based assay to measure phospholipid scrambling in large unilamellar liposomes reconstituted with opsin.

Un test fluorescenza a base di fosfolipidi Scramblase Activity

Scramblases translocate phospholipids across the membrane bilayer bidirectionally in an ATP-independent manner. The first scramblase to be identified and ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

Espressione, purificazione e attività antimicrobica di S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

Ricerca

Biochimica

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

Analisi di attività della polimerasi del DNA usando il vicino infrarosso fluorescente DNA con etichettato visualizzato tramite elettroforesi su Gel di acrilammide

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

Un test In Vitro per rilevare attività di tRNA-Isopentenyl Transferase

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Microgravimetry dissipativo per studiare la dinamica di associazione del fosfolipide proteina Annessina A2 a lipidici solido-supportato utilizzando un risonatore al quarzo

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Rapid Fluorescence-based Characterization of Single Extracellular Vesicles in Human Blood with Nanoparticle-tracking Analysis

Rapida caratterizzazione basata sulla fluorescenza delle singole vescicole extracellulari nel sangue umano con analisi Nanoparticle tracking

Extracellular vesicles (EVs), including exosomes, are specialized membranous nano-sized vesicles found in bodily fluids that are constitutively released ...

A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen for Proteolytic Activity: Applications for coronavirus spike protein activation

Un'analisi di clivaggio Peptide fluorogenico alla schermata per attività proteolitica: applicazioni per coronavirus spike l'attivazione della proteina

Enveloped viruses such as coronaviruses or influenza virus require proteolytic cleavage of their fusion protein to be able to infect the host cell. Often ...

A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila Melanogaster

A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila Melanogaster

Un saggio colorimetrico dell'attività Citrate Synthase in Drosophila Melanogaster

Mitochondria play the most prominent roles in cellular metabolism by producing ATP through oxidative phosphorylation and regulating a variety of ...

Single-Step Enrichment of a TAP-Tagged Histone Deacetylase of the Filamentous Fungus Aspergillus nidulans for Enzymatic Activity Assay

Single-Step Enrichment of a TAP-Tagged Histone Deacetylase of the Filamentous Fungus Aspergillus nidulans for Enzymatic Activity Assay

Arricchimento in un solo passaggio di un istone deacetilasi con tag TAP del fungo filamentoso Aspergillus nidulans per il saggio di attività enzimatica

Class 1 histone deacetylases (HDACs) like RpdA have gained importance as potential targets for treatment of fungal infections and for genome mining of ...

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

Screening cinetico dell'attività nucleana utilizzando sonde con acido Nucleic

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

Fluorescence-Based Measurements of Phosphatidylserine/Phosphatidylinositol 4-Phosphate Exchange Between Membranes

Misurazioni basate sulla fluorescenza dello scambio di fosfatidilserina / fosfatidilinositolo 4-fosfato tra le membrane

Several members of the evolutionarily conserved oxysterol-binding protein (OSBP)-related proteins(ORP)/OSBP homologs (Osh) family have recently been found ...