Name: fluorescence anisotropy as a tool to study protein-protein interactions
Uploaded: 2016-10-21T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions at JoVE.com

Authors acknowledge the financial support from CONACyT project numbers 167359 and 177138, and from DGAPA-UNAM project number IN201615.

1. SBDS-ФЛЭШ Tag Экспрессия белка и очистка Примечание: Для экспериментов анизотропии, фотовспышка-тег, соответствующий последовательности Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys был добавлен к С-концу человеческого SBDS кодирующей последовательности с помощью ПЦР. Эту конструкцию субклонируют в вектор экспресс?...

<ol>
	<li>Krogan, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+landscape+of+protein+complexes+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature. 440 (7084), 637-643 (2006).</li><li>Fields, S., Song, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+genetic+system+to+detect+protein-protein+interactions.">A novel genetic system to detect protein-protein interactions.</a> Nature. 340, 245-246 (1989).</li><li>Michnick, S. W., Hien Ear, P., Landry, C., Malleshaiah, M. K., Messier, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+toolkit+of+protein-fragment+complementation+assays+for+studying+and+dissecting+large-scale+and+dynamic+protein-protein+interactions+in+living+cells.">A toolkit of protein-fragment complementation assays for studying and dissecting large-scale and dynamic protein-protein interactions in living cells.</a> Methods in Enzymology. 470, 336-366 (2010).</li><li>Puig, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tandem+affinity+purification+(TAP)+method:+a+general+procedure+of+protein+complex+purification.">The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification.</a> Methods. 24, 218-229 (2001).</li><li>Dwane, S., Kiely, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+used+to+study+how+protein+complexes+are+assembled+in+signaling+cascades.">Tools used to study how protein complexes are assembled in signaling cascades.</a> Bioeng Bugs. 2 (5), 247-259 (2011).</li><li>Snider, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamentals+of+protein+interaction+network+mapping.">Fundamentals of protein interaction network mapping.</a> Mol Syst Biol. 11 (12), 848 (2015).</li><li>Fersht, A., Baldwin, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Structure and mechanism in protein science: a guide to enzyme catalysis and protein folding. , 191-214 (2002).</li><li>Menne, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Shwachman-Bodian-Diamond+syndrome+protein+mediates+translational+activation+of+ribosomes+in+yeast.">The Shwachman-Bodian-Diamond syndrome protein mediates translational activation of ribosomes in yeast.</a> Nat Genet. 39 (4), 486-495 (2007).</li><li>Boocock, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+SBDS+are+associated+with+Shwachman-Diamond+syndrome.">Mutations in SBDS are associated with Shwachman-Diamond syndrome.</a> Nat Genet. 33 (1), 97-101 (2003).</li><li>Garcia-Marquez, A., Gijsbers, A., de la Mora, E., Sanchez-Puig, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+Guanine+Nucleotide+Exchange+in+the+Elongation+Factor-like+1+(EFL1)+GTPase+by+Mutations+in+the+Shwachman-Diamond+Syndrome+Protein.">Defective Guanine Nucleotide Exchange in the Elongation Factor-like 1 (EFL1) GTPase by Mutations in the Shwachman-Diamond Syndrome Protein.</a> J Biol Chem. 290 (29), 17669-17678 (2015).</li><li>Gijsbers, A., Garcia-Marquez, A., Luviano, A., Sanchez-Puig, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guanine+nucleotide+exchange+in+the+ribosomal+GTPase+EFL1+is+modulated+by+the+protein+mutated+in+the+Shwachman-Diamond+syndrome.">Guanine nucleotide exchange in the ribosomal GTPase EFL1 is modulated by the protein mutated in the Shwachman-Diamond syndrome.</a> Biochem Biophys Res Commun. 437 (3), 349-354 (2013).</li><li>Lakowicz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of fluorescence spectroscopy. , (2010).</li><li>Nishigaki, T., Trevi&#241;o, C. L., G&#242;mez, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Tools to understand protein-protein interactions. 37, 1-14 (2012).</li><li>Johnson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Molecular Probes Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies. , (2010).</li><li>Sabnis, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Fluorescent Dyes and Probes. , (2015).</li><li>Adams, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+biarsenical+ligands+and+tetracysteine+motifs+for+protein+labeling+in+vitro+and+in+vivo:+synthesis+and+biological+applications.">New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: synthesis and biological applications.</a> J Am Chem Soc. 124 (21), 6063-6076 (2002).</li><li>Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+covalent+labeling+of+recombinant+protein+molecules+inside+live+cells.">Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells.</a> Science. 281 (5374), 269-272 (1998).</li><li>Rashidian, M., Dozier, J. K., Distefano, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+labeling+of+proteins:+techniques+and+approaches.">Enzymatic labeling of proteins: techniques and approaches.</a> Bioconjug Chem. 24 (8), 1277-1294 (2013).</li><li>Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: A laboratory manual. , (2001).</li><li>Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+staining+of+proteins+in+polyacrylamide+gels+including+isoelectric+focusing+gels+with+clear+background+at+nanogram+sensitivity+using+Coomassie+Brilliant+Blue+G-250+and+R-250.">Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250.</a> Electrophoresis. 9 (6), 255-262 (1988).</li><li>West, R. W., Chen, S. M., Putz, H., Butler, G., Banerjee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAL1-GAL10+divergent+promoter+region+of+Saccharomyces+cerevisiae+contains+negative+control+elements+in+addition+to+functionally+separate+and+possibly+overlapping+upstream+activating+sequences.">GAL1-GAL10 divergent promoter region of Saccharomyces cerevisiae contains negative control elements in addition to functionally separate and possibly overlapping upstream activating sequences.</a> Genes Dev. 1 (10), 1118-1131 (1987).</li><li>Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K., Kimura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+intact+yeast+cells+treated+with+alkali+cations.">Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations.</a> J Bacteriol. 153 (1), 163-168 (1983).</li><li>Eftink, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+methods+for+studying+equilibrium+macromolecule-ligand+interactions.">Fluorescence methods for studying equilibrium macromolecule-ligand interactions.</a> Methods Enzymol. 278, 221-257 (1997).</li><li>Han, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+Substrates+to+the+Central+Pore+of+the+Vps4+ATPase+Is+Autoinhibited+by+the+Microtubule+Interacting+and+Trafficking+(MIT)+Domain+and+Activated+by+MIT+Interacting+Motifs+(MIMs).">Binding of Substrates to the Central Pore of the Vps4 ATPase Is Autoinhibited by the Microtubule Interacting and Trafficking (MIT) Domain and Activated by MIT Interacting Motifs (MIMs).</a> J Biol Chem. 290 (21), 13490-13499 (2015).</li><li>Sanchez-Puig, N., Veprintsev, D. B., Fersht, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+natively+unfolded+HIF-1alpha+ODD+domain+to+p53.">Binding of natively unfolded HIF-1alpha ODD domain to p53.</a> Mol Cell. 17 (1), 11-21 (2005).</li><li>Trusch, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+N-terminal+Region+of+the+Ubiquitin+Regulatory+X+(UBX)+Domain-containing+Protein+1+(UBXD1)+Modulates+Interdomain+Communication+within+the+Valosin-containing+Protein+p97.">The N-terminal Region of the Ubiquitin Regulatory X (UBX) Domain-containing Protein 1 (UBXD1) Modulates Interdomain Communication within the Valosin-containing Protein p97.</a> J Biol Chem. 290 (49), 29414-29427 (2015).</li><li>Kamp, F., Beyer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+alpha-synuclein+affects+the+lipid+packing+in+bilayers+of+small+vesicles.">Binding of alpha-synuclein affects the lipid packing in bilayers of small vesicles.</a> The Journal of Biological Chemsitry. 281, 9251-9259 (2006).</li><li>Bujalowski, W. M., Jezewska, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+Intensity,+Anisotropy,+and+Transient+Dynamic+Quenching+Stopped-Flow+Kinetics.">Fluorescence Intensity, Anisotropy, and Transient Dynamic Quenching Stopped-Flow Kinetics.</a> Spectroscopic Methods of Analysis. 875, 105-133 (2012).</li><li>Asano, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+interaction+between+EFL1+and+SBDS+is+mediated+by+an+intrinsically+disordered+insertion+domain.">Direct interaction between EFL1 and SBDS is mediated by an intrinsically disordered insertion domain.</a> Biochem Biophys Res Commun. 443 (4), 1251-1256 (2014).</li></ol>

Большинство биохимических экспериментов с белками требуют не только чистый белок, но и большое количество них, независимо от используемого метода. По этой причине белки, используемые для этого типа экспериментов получаются гетерогенной экспрессии, как это было в случае, представленн?...

Клетки содержат множество биомакромолекулах, которые постоянно взаимодействуют друг с другом. Эта ассоциация рождает комплексы, которые участвуют в клеточных путей, ответственных за их функционирование в сигнальной трансдукции, регуляции экспрессии генов и миграции клеток среди других. Все белок-белковых взаимодействий, которые происходят в клетке составляют сеть, известную как интерактома. В Saccharomyces CEREVISIAE было показано более чем 70% от его белков , чтобы иметь взаимодействующих партнеров 1. Понимание интерактома клетки и их функции предоставляют соответствующую информацию о сложности и разнообразии живых организмов. Несколько методик были описаны для идентификации и характеристики белок-белковых взаимодействий. Различные высоко через положить методы , такие как дрожжи дигибридная 2, белок-фрагмент комплементационных анализов 3, 4 аффинной очистки в сочетании с масс - спектрометрии и белка microarraYS используются для идентификации взаимодействия 5,6. После идентификации, необходимо проверить его, и это может варьироваться в зависимости от случая к случаю. Как правило, эти эксперименты связаны с срыве самого взаимодействия на уровне отдельных членов пары взаимодействия, например, путем делеции гена или избыточная экспрессия одного из белков, а затем ищет изменения в свойствах или функции другого члена в то на клеточном уровне. Впоследствии, биофизические методы 7 используются для характеристики белок-белковых взаимодействий на молекулярном уровне. С этой целью, структура белковых комплексов определяются с помощью рентгеновской кристаллографии, ядерного магнитного резонанса и крио-электронной микроскопии в то время как калориметрии и флуоресцентной спектроскопии используются для количественной и механистически описания. В этой работе, анизотропии флуоресценции использовали в качестве методики для характеристики взаимодействия между ГТФ EFL1 и SBDS белок. Эти белки участвуют в синтезе рибосом путем содействия высвобождение эукариотических фактора инициации 6 от поверхности 60S рибосомальной субъединицей 8. Белок SBDS мутирует в заболевание , известное как Shwachman-Даймонд синдром 9 и действует как фактор обмена гуанина нуклеотиддля EFL1 уменьшая его сродство к гуанозиндифосфат 10,11. мутации болезни в SBDS отменить взаимодействие с EFL1 и тем самым предотвратить его активацию. Флуоресцентная анизотропия обычно используется в биологических приложениях для изучения белок-пептид или взаимодействий белок-нуклеиновых кислот. Он основан на принципе, что флуорофор возбуждаемых с поляризованными светом приводит частично поляризованного излучения. Анизотропии флуоресценции определяется уравнением 1: <img alt="Equation1" src="/files/ftp_upload/54640/54640eq1.jpg" /> где я VV , и я В.Х. являютсяинтенсивности флуоресценции вертикально (VV) и по горизонтали (VH) поляризован излучение , когда образец возбуждается с вертикально поляризованный свет 12. Флуоресцентная анизотропия чувствительна к факторам, которые влияют на скорость вращательной диффузии флуорофора и, таким образом, зависит от температуры, вязкости раствора и кажущегося размера молекул флуорофора. Видимый размер белка, содержащего флуорофор увеличивается, когда он взаимодействует с другим белком, и такое изменение может быть оценена как изменение анизотропии. Более конкретно, флуорофор , который вращается медленно в растворе по отношению к его жизни флуоресцентного будет иметь большое значение , я VV и малое значение I V H , и , следовательно , будет демонстрировать относительно большую анизотропию. Для флуорофоров , что ОБРУШЬТЕСЬ быстро по сравнению с их флуоресцентным жизни, я VV , и я В.Х. будут подобны и их анизотропии значение будет небольшим 12 </sup&gt; (Рисунок 1). Кроме того, для хорошей анизотропии сигнал измерения уровня шума, необходимо иметь флуорофор с времени жизни флуоресценции, подобной времени вращательной корреляции интерес молекулы. В противном случае, не представляется возможным точно регистрировать разницу в анизотропии между свободным белком и что в комплексе. Например, анизотропия флуоресцентного зонда с временем жизни около 4 наносекунд, такие как флуоресцеин или родамин, прикрепленных к низкомолекулярного соединения молекулярного 100 дальтон составляет 0,05. Связывание с молекулой 160 кДа увеличит его анизотропии значение 0,29; различие, которое может быть точно измерена. В противоположность этому, тот же флуоресцентного зонда участвуют в реакции связывания, чей рост размера молекул варьируется от 65 до 1000 кДа, приведет лишь к изменению анизотропии 0,28 до 0,3, который слишком мал, чтобы быть точно измерена. В этом случае зонд со временем жизни 400 нсек был бы более подходящим 12. <pкласс = &quot;jove_content&quot;&gt; <img alt="Рисунок 1" src="/files/ftp_upload/54640/54640fig1.jpg" /> Рисунок 1. Схематическое изображение оборудования , используемого для измерения анизотропии флуоресценции и процедуры. Схематическое изображение оборудования , используемого для выполнения измерительный белок-белок эксперимент взаимодействия анизотропии флуоресценции. Флуорофоры , что барабанные быстрый дисплей небольшой анизотропии , которая увеличивает на связывание с партнером взаимодействия. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54640/54640fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54640/54640fig1large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54640/54640fig1large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> Флуоресцентные системы требуют присутствия флуорофор в любой из молекул изученных. Для изучения белок-белковых взаимодействий, существуют три типа флуорофоров: 1) Триптофан остатки, присутствующие в белках, 2) химически присоединенные флуорофоры и 3) флюоресцентные партнеры слитые, такие как зеленый флуоресцентный белок (GFP) и его Derivaставители. Большинство белков имеют остатки триптофана на его структуру, таким образом, самый простой способ измерить взаимодействие является путем мониторинга изменений в соответствующих спектров флуоресценции или путем наблюдения за изменениями в интенсивности флуоресценции остатков триптофана. Тем не менее, триптофан остатки могут присутствовать в обоих белках, усложняющих анализ. С другой стороны, для флуорофора, чтобы изменить его флуоресцентные свойства из-за взаимодействия он должен быть расположен на или вблизи сайта связывания, и это может помешать само взаимодействие. Это требует особого внимания при использовании громоздких флуорофоры, такие как GFP. Если ни один из этих флуорофоров не может быть использован для исследований связывания необходимо, а затем, чтобы ввести примесные флуорофоры к одному из белков, участвующих. Многие химически синтезированные флуорофоры существовать и могут быть ковалентно связаны с белками через их реакционноспособные группы, такие как аминные группы (боковой цепи лизина или N-конца) и тиоловых групп в цистеин. Fпроизводные luorophore с изотиоцианатных и сукцинимидиловых эфиры реагируют с амидной группы в то время как йодацетамида и малеимидная являются тиол-реактивные группы 13. Наиболее распространенные красители, используемые в приложениях флуоресцентных являются производными флуоресцеина и родамина зеленые красители, кумарины, BODIPY флуорофоры и Alexa Fluor красители. Подробный перечень коммерчески доступных флуорофоров и их использование можно найти в ссылках 14,15. Для успешной маркировки, реактивная группа должна быть открыта на поверхности белка, но из-за большого количества химически активных функциональных групп, обычно присутствующих в полипептидах очень трудно получить модификации конкретного участка. Белок интерес в данном исследовании, SBDS, содержит 5 свободных цистеина и 33 лизинов, которые могут привести к многократной маркировки сайта. Неравномерный маркировка может повлиять на связывании и усложнит анализ данных, как разные молекулы флуорофором могут вызывать различные сигналы интенсивности флуоресценции при связывании. Для Овеrcome эту проблему, мы использовали флуорофора âñïûøêè, 4 &#39;, 5&#39;-бис (1,3,2 dithioarsolan-2-ил) флуоресцеина сайт-прямой этикетке белок SBDS. Это arsenoxide краситель с высоким сродством к четырем разнесенных цистеина в мотиве знают , как ФЛЭШ-тег , состоящий из CCXXCC последовательности , где X обозначает любую аминокислоту, кроме цистеина 16,17. Этот tetracysteine ​​мотив добавлен к N- или С-конце белка методом генной инженерии вместе с соответствующим линкером для предотвращения нарушения общей складки белка. Пара , состоящая из красителя и ФЛЭШ ФЛЭШ-таг был первоначально разработан для сайт-специфических белков меток в живых клетках 17 , но он также может быть использован для обозначения очищенных белков в пробирке , как это иллюстрируется здесь. Кроме того, ферментативные стратегии были также разработаны для того, чтобы сайт-специфической функционализации белков 18. В этой рукописи мы опишем полезность флуоресцентной анизотропии аса инструмент для изучения белок-белковых взаимодействий. Связывание может быть оценена с помощью простого осмотра связывающей формы кривой в то время как количественная информация может быть получена из подгонки экспериментальных данных.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="674">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">0.5 mm Glass beads</td>
			<td style="width:112px;">Biospec Products</td>
			<td style="width:119px;">11079105</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Tris Base</td>
			<td style="width:112px;">Formedium</td>
			<td style="width:119px;">TRIS01</td>
			<td style="width:225px;">Ultra pure</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Glycerol</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G5516</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">dye 4&#8217;, 5&#8217;-bis(1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescein</td>
			<td style="width:112px;">ThermoFischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;">LC6090</td>
			<td style="width:225px;">This kit contains the dye to label a FlAsH tag</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">Ampiciline</td>
			<td style="width:112px;">IBI Shelton Scientific, Inc</td>
			<td style="width:119px;">IB02040</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">D(+)-Glucose Anhydrous</td>
			<td style="width:112px;">Formedium</td>
			<td style="width:119px;">GLU03</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">D(+)-Galactose</td>
			<td style="width:112px;">Formedium</td>
			<td style="width:119px;">GAL03</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">L-Leucine</td>
			<td style="width:112px;">Formedium</td>
			<td style="width:119px;">DOC0157</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">L-Tryptofan&#160;</td>
			<td style="width:112px;">Formedium</td>
			<td style="width:119px;">DOC0189</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Bezamidine hydrochloride</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B6506-5G</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:219px;">PMSF</td>
			<td style="width:112px;">Gold Biotechnology, Inc</td>
			<td style="width:119px;">P-470-25</td>
			<td style="width:225px;">Phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">NaCl</td>
			<td style="width:112px;">Formedium</td>
			<td style="width:119px;">NAC02</td>
			<td style="width:225px;">Sodium Chloride&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">Glycerol</td>
			<td style="width:112px;">Tecsiquim, S.A. de C.V.</td>
			<td style="width:119px;">GT1980-6</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">MgCl2</td>
			<td style="width:112px;">Merck Millipore Corporation</td>
			<td style="width:119px;">1725711000</td>
			<td style="width:225px;">Magnesium Chloride</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Imidazole</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I2399-500G</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M6250-100ML</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">K2HPO4</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P3786-500G</td>
			<td style="width:225px;">Potassium phosphate dibasic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">NaH2PO4</td>
			<td style="width:112px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S3139-500G</td>
			<td style="width:225px;">Sodium phosphate monobasic</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">Yeast nitrogen base without amino acids</td>
			<td style="width:112px;">Formedium</td>
			<td style="width:119px;">CYN0410</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:112px;">Formedium</td>
			<td style="width:119px;">YEM03</td>
			<td style="width:225px;">Micro Granulated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">L-Tyroisne</td>
			<td style="width:112px;">Formedium</td>
			<td style="width:119px;">DOC0193</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Adenine sulphate</td>
			<td style="width:112px;">Formedium</td>
			<td style="width:119px;">DOC0230</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Casamino acids</td>
			<td style="width:112px;">Formedium</td>
			<td style="width:119px;">CAS03</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">Tryptone</td>
			<td style="width:112px;">IBI Shelton Scientific, Inc</td>
			<td style="width:119px;">IB49182</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">IPTG</td>
			<td style="width:112px;">Formedium</td>
			<td style="width:119px;">IPTG025</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Name of Material</td>
			<td style="width:112px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:225px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">Filtration units</td>
			<td style="width:112px;">Merck Millipore Corporation</td>
			<td style="width:119px;">UFC901096</td>
			<td style="width:225px;">Amicon Ultra-15, membrana PLGC Ultracel-PL, 10&#160;kDa</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:219px;">Membrane Filter</td>
			<td style="width:112px;">Merck Millipore Corporation</td>
			<td style="width:119px;">GSWP04700</td>
			<td style="width:225px;">Membrane Filter, mixed cellulose esters, Hydrophilic, 0.22&#160;&#181;m, 47&#160;mm, white, plain</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">Ni2+ affinity column</td>
			<td style="width:112px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:119px;">30760</td>
			<td style="width:225px;">Cartridge pre-filled with 5 ml Ni-NTA Superflow</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">Strong Sulfopropyl cation exchanger column</td>
			<td style="width:112px;">GE Healthcare Life Science</td>
			<td style="width:119px;">17-5157-01</td>
			<td style="width:225px;">HiTrap SP Sepharose FF 5 ml</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">Size Exclusion column</td>
			<td style="width:112px;">GE Healthcare Life Science</td>
			<td style="width:119px;">28989335</td>
			<td style="width:225px;">HiLoad 16/600 Superdex 200 PG</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">Fluorescence cell</td>
			<td style="width:112px;">Hellma Analytics</td>
			<td style="width:119px;">111-057-40</td>
			<td style="width:225px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Name of Equipment</td>
			<td style="width:112px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:225px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:112px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;">G6860AA</td>
			<td style="width:225px;">Cary 60 UV-Vis</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:219px;">Shaker</td>
			<td style="width:112px;">ThermoFischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SHKA4000-7</td>
			<td style="width:225px;">MaxQ 4000 Benchtop temperature range Ambient-15&#176; to 60&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:112px;">ThermoFischer Scientific</td>
			<td>75004271</td>
			<td style="width:225px;">Heraeus Megafuge 16R</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:219px;">FPLC</td>
			<td style="width:112px;">Pharmacia Biotech</td>
			<td style="width:119px;">Discontinued</td>
			<td style="width:225px;">FPLC system conductivity UV-MM II monitor P500 pump fraction</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:219px;">Spectrofluorometer</td>
			<td style="width:112px;">Olis</td>
			<td style="width:119px;">No applicable</td>
			<td style="width:225px;">Olis DM 45 with Polarization Toolbox</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence anisotropy as a tool to study protein-protein interactions

Белок-белковые взаимодействия играют существенную роль в функционировании живого организма. После того, как взаимодействие было определено и подтверждено, необходимо охарактеризовать его на структурном и механистической уровне. Существует несколько биохимических и биофизических методов для этой цели. Среди них, анизотропии флуоресценции мощный метод особенно используется, когда интенсивность флуоресценции флуорофора-меченого белка остается постоянным при белок-белкового взаимодействия. В этой технике, флуорофор-меченого белка возбуждается с вертикально-поляризованным светом с соответствующей длиной волны, который селективно возбуждают подмножество флуорофоров в соответствии с их относительной ориентации с помощью входящего пучка. В результате эмиссии также имеет направленность, отношения которых в вертикальной и горизонтальной плоскостях определяет анизотропии (г) следующим образом : г = (I VV -I В.Х.) / (I VV + 2I В.Х.), где я VV , и я <sUB&gt; В.Х. являются интенсивности флуоресценции вертикальной и горизонтальной компонент, соответственно. Флуоресцентная анизотропия чувствительна к вращательной диффузии флуорофор, а именно кажущегося размера молекул флуорофора, присоединенного к белку, который при измененном белок-белкового взаимодействия. В настоящем тексте, использование анизотропии флуоресценции в качестве инструмента для изучения белок-белковых взаимодействий был примером для решения связывания между белком мутировавшего при синдроме Shwachman-DIAMOND (SBDS) и фактор элонгации, как-1 GTPase (EFL1). Обычно маркировка белка с флуорофором осуществляется на тиоловые группы (цистеин) или в группах, амино (N-концевыми аминогруппами или лизин) белка. Тем не менее, SBDS обладает несколькими цистеина и лизинов, которые не позволяли сайт направленного маркировки его. В качестве альтернативного метода, краситель 4 &#39;, 5&#39;-бис (1,3,2-dithioarsolan 2-ил) флуоресцеина использовался для специально маркировать tetracysteine ​​мотив, Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys, методами генной инженерии в С-конце рекомбинантного белка SBDS. Место экспериментальных данных при условии количественного и механистической информации о связывании режиме между этими белками.

Для выполнения любой анизотропии эксперимент, важно, чтобы исключить большие изменения в интенсивности флуоресценции флуорофора, так как наблюдаемая анизотропия смеси вида представлен уравнением 5: <img alt="Equation5" src="/files/ftp_upload/54640/54640eq5.jpg"...

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions at JoVE.com

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Белковых взаимодействий в основе функции клетки. Калориметрические и спектроскопические методы широко используются для их характеристики. Здесь мы опишем флуоресцентной анизотропии в качестве инструмента для изучения взаимодействия между белком мутировал в синдром Shwachman-DIAMOND (SBDS) и фактор элонгации типа 1 GTPase (EFL1).

Анизотропию, как флуоресценция инструмента для изучения белок-белковых взаимодействий

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Biochemistry

Fundamentals

Macromolecules

SCIENTISTS IN ACTION

Utilizing the Ethylene-releasing Compound, 2-Chloroethylphosphonic Acid, as a Tool to Study Ethylene Response in Bacteria

Используя Этилен-рилизинг-соединение, 2-Chloroethylphosphonic кислота, в качестве инструмента для изучения Этилен ответа бактерий

Ethylene (C2H4) is a gaseous phytohormone that is involved in numerous aspects of plant development, playing a dominant role in senescence and fruit ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Используя строительные леса, липосом Развести липидами проксимальный белок-белковых взаимодействий<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Биотинилированным клеток-проникая пептиды для изучения внутриклеточный белок белковых взаимодействий

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

С использованием трехцветной сингл молекула лад для изучения корреляции взаимодействий протеина

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

A Yeast 2-Hybrid Screen in Batch to Compare Protein Interactions

Экран 2-гибрид дрожжи в пакете для сравнения взаимодействий протеина

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Флуоресценции колебания спектроскопии Assay белок белковых взаимодействий в ячейке контакты

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Применение биослойной интерферометрии (BLI) для изучения белково-белковых взаимодействий в транскрипции

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Оценка взаимодействия белкови-белков с использованием метода пищеварения On-Membrane

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

В Vivo Hydroxyl радикальный белок следдля изучения взаимодействия белков в Caenorhabditis elegans

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, ...

Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation

Оптический пинцет для изучения РНК-белковых взаимодействий в регуляции трансляции

RNA adopts diverse structural folds, which are essential for its functions and thereby can impact diverse processes in the cell. In addition, the ...