Name: preparation of extracellular matrix protein fibers for brillouin spectroscopy
Uploaded: 2016-09-15T15:00:00
Duration: 7 min 19 s
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This work was supported by the Engineering and Physical Sciences Research Council [grant number EP/M028739/1]. RSE was supported by a Santander Postgraduate Research Award 2015.

注意：使用前に生物学的安全プロトコルおよび関連するすべての物質安全データシート（MSDS）を参照してください。これらの実験に用いたレーザは、クラス3Bのレーザーです。システムを安全に使用するためのローカルルールの遵守が必要とされています。個人用保護具（安全ゴーグル）の使用を含むレーザー分光測定を行う際に、すべての適切な安全対策を使用してください。 テール腱は、1995年ウシうなじ靭帯が地元の食肉処理場から入手したEU規則2009分の1099と動物の福祉（虐殺または殺害）規則に基づき、他の目的のために安楽死させた7-8週齢のWistarラットから得ました。 サンプルファイバーの作製注：細胞外マトリックスのタンパク質繊維は、異なる手順を用いて、種々の組織から抽出することができます。プロトコルは広く適用手順に基づいて精密化しました。 <ol><li><stroラットの尾からのコラーゲン線維のNG&gt;抽出<ol><li>体重のペントバルビタールナトリウムを100mg / kgを腹腔内注射することによりラットを生け贄に捧げます。そして、シングルエッジかみそりの刃で押し下げ、本体との接触点で直接尾を切断。ラップフィルムに尾をラップし、必要になるまで、それは-20℃で凍結保存してください。 </li><li>室温でリン酸緩衝生理食塩水（PBS）溶液（pH7.4）で満たされたペトリ皿に解凍し、それを残した後、まだ凍結しながら、近位端から20ミリメートル長のセグメントをカットし、冷凍庫から尾を収集します。 </li><li>尾が解凍されたら、皮膚を分割するためにメスを用いてセグメントの長さに沿って切開を行います。そして、テール椎骨約4シーズ腱バンドルを明らかにするために戻って皮をむきます。 </li><li> （NaN 3を）軽くシースの外に各繊維を描くとvアジ化ナトリウム/ wの0.01％と蒸留水を含むバイアルに配置し、PRする微細な鉗子を使用して、任意の事前ひずみを適用しないように注意してイベント細菌の増殖、およびストアは冷蔵しました。単一の尾は約30腱繊維が得られます。 </li><li> Iコラーゲン、純粋な繊維状のタイプを取得するには、プロテオグリカンおよび他のすべての非コラーゲン性物質を除去するために腱繊維に3つの部分から酵素消化プロセス10を適用します。 <ol><li>まず、200 rpmで振盪インキュベーター中で37℃で24時間、pH8.0で0.05Mトリス緩衝液および0.06 M酢酸ナトリウム（CH 3 COONa）で0.125 U / mlのコンドロイチナーゼABCで繊維を浸します。 </li><li>その後、pH6.0の0.05 Mトリス緩衝液および0.15 Mの塩化ナトリウム（NaCl）で1 U / mlのストレプトミセスヒアルロニダーゼ中の繊維を浸漬し、37℃で24時間振とう培養器に戻ります。 </li><li>最後に、37℃の振盪インキュベーター中で16時間、pH7.2の0.05 Mリン酸ナトリウム（のNaHPO 4）、0.15 M NaCl中でトリプシン1mg / mlの中の繊維を浸します。 </li></ol></li><li>蒸留水を含むバイアルに冷蔵精製された繊維を保管し、WI測定に必要とされるまで、細菌の増殖を防ぐための第0.01％のNaN 3。 </li></ol></li><li> ウシ項靱帯からエラスチン線維の抽出 <ol><li>食肉処理場からウシ項靱帯を取得し、ラップフィルムでラップし、使用するまで-20℃で凍結して保管してください。 </li><li>純粋なエラスチンを産生するために、冷凍庫から靭帯を収集し、次のように、ランシングの手順に従って、沸騰水浴中で11靱帯を、RTで解凍メスを使用して脱脂し、消化することを可能にします。 <ol><li>蒸留水に水酸化ナトリウム（NaOH）の0.1M溶液を準備し、組織をカバーし、三角フラスコに脱脂靭帯に追加します。 </li><li> 45分間95℃の水浴でフラスコを沸騰。 </li><li>消化フラスコから靭帯を除去し、pHを7.0（pHメーターを用いてモニター）が得られるまで、蒸留水で繰り返し不溶性組織ブロックを洗います。 </li><li>最終から組織を削除します溶液を洗浄し、密閉容器中で（細菌の増殖を防ぐために、0.01％のNaN 3）と混合し、冷蔵保存し、蒸留水に沈めます。 </li></ol></li><li>冷蔵庫から組織を収集し、静かに大きなブロックから小さいエラスチンのセグメント（20〜50ミリメートル厚さ2mm、長、 約）を引き、それらを配置するためにあまりにも多くの力とプレ歪み、使用ピンセットを適用しないように注意してPBS溶液（pH7.4）でペトリ皿で​​す。 </li><li>細かい鉗子を使用して、静かに、厚さ1ミリメートルの周りの小さな繊維束をいじめるとメスを用いて数mmの長さにそれらをカット。 </li><li> （細菌の増殖を防ぐために、0.01％のNaN 3を含む）を蒸 ​​留水を含有するバイアルに繊維を移し、測定に必要となるまで、それらを冷蔵保存します。 </li></ol></li><li> 反射基板上に繊維を取り付け <ol><li>ダイヤモンドカッターを用いて、反射型シリコーンスライドの部分を切断します。 </li><li>水和compartmeを作成するにはNT、（繊維にフィットするのに十分な大きさ）中央に中空のカットを有するシリコーンスライド上に適合し、シリコン基板上にそれを置くためにパラフィルムのストリップをカット。 注：ステップ1.3.4に封入されたとき、四辺の1が空気に開いたままになるように乾燥繊維測定のために、U字状にパラフィルムをカット。 </li><li>ストレージソリューションから単繊維を収集し、サンプルを洗浄し、室温で5分間純水で満たされた小さなペトリ皿に入れて、微細ピンセットを使用し、冷蔵庫から繊維を取り出します。その後、繊維を収集し、シリコン基板上にパラフィルムの中空の中心にそれを転送します。 注意深い：この操作中にそれを延伸して繊維の損傷を防ぐため、これは機械的特性の変化を引き起こす可能性があるように基板上の試料を再配向することは避けてください。 </li><li>繊維の上に薄いガラスカバースリップを置き、下にパラフィルムを溶融し、ガラス表面上に静かに加熱された半田ごてを通過させることによって、チャンバをシールガラス。 慎重に：近すぎるこて先をもたらすか、過度に基板を加熱しないことによって、繊維に損傷を与えることは避けてください。 </li><li>小さな重みで平らな面に密閉室を置き、試料へのダメージを回避しながら、サンプルとシリコン基板との間の良好な接触を達成するために約12時間放置します。 </li><li>ネジを使用して、体重を削除して、基板上の所定の位置にチャンバーを固定します。 </li></ol></li></ol> 2.ブリルアン実験のセットアップおよびファイバスペクトルを取得<ol><li> サンプルコンパートメントの調製 <ol><li>ボリュームの位置を散乱;（ 図SI-1を参照してください2Φ= 90°）一定の散乱角を維持しながら、試料の面内回転を可能にするために、ゴニオメータを搭載した縦型ホルダーに一部1.3のように調製したサンプルをマウントします。 </li><li>ルを介して試料上のレーザ光の正確なフォーカス調整を行いますナノ秒。9 注意深い：レーザ出力パワーが高すぎると、試料中の火傷を生じさせることができます。試料への損傷を避けるために、良好な感度ではなく、高すぎるを与えるために十分に高く設定されていることを確認します。ここでは、サンプルの約 76ミリワットの電力を使用します。これはまた、これが薄いと、レーザー照射により発生した熱を放散するのに役立ちます基板と接触していることを考慮すると、試料を燃焼させずに良好な感度を得るために十分でした。 </li><li>バーニアスケールを使用して、入射レーザビームに対して45°の角度（Φ）でサンプルを配置します。 （下記参照）の測定を実行し、スペクトルのピークの強度を最大化することによって、最適なポジショニングを実現。 </li></ol></li><li> 分光器のセットアップ <ol><li>データの取得や操作のためのソフトウェアを開いて、サンプル12のブリルアンスペクトルの取得を設定します。ここで説明する手順は、ムーに適用されますltipassタンデム干渉計（ 図SI-1A）。 </li><li>独立して制御ユニットによってピエゾに印加される電圧を変化させる2ファブリペロー（FP）干渉計を合わせます。このプリアライメント手順については、各FPで反射した光を観察します。 2のFPによって反射強度がゼロになる傾向た場合、正しい位置合わせが達成されます。 </li><li>スペクトル較正：アクセス可能な周波数範囲、又は自由スペクトル領域 （FSR）が、二つの第一のFP共振器のミラー、L、FSR = C / 2 L、cは光の速度であるスルーとの間の距離に依存しますLは、ダイヤルゲージにより測定されます。 </li><li> 2 FP干渉計のスキャンを同期し、タンデムマルチパス構成に光学系を切り替えます。透過したレーザ光の強度のフィードバック制御が自動的に測定中に2つのFPの位置合わせを維持します。 </li></ol></li><li> 測定OブリルアンスペクトルF 慎重に：ブリルアンスペクトルは、試料の温度と水分補給に大きく依存していると、これらのパラメータを注意深く制御が再現可能なスペクトルを得るための鍵です。 <ol><li>サンプルのブリルアンスペクトルの取得を開始し、良好な信号対雑音比が達成されるまで、それを実行します。これは、サンプルの散乱断面積、濃度および厚さに応じて数分かかることがあります。 注：そこ信号対雑音比のための親指のルールはありませんが、スペクトル品質を分析し、特定のサンプルに基づいて、実験者によってチェックされます。測定スペクトルの品質と持続時間との間のトレードオフは、したがって、実験パラメータは、特定の用途に応じて選択する必要があります。 </li><li>乾燥試料の測定には、連続したスペクトルを取る - それらのそれぞれについて、ステップ2.3.1以下 - ピーク私の位置の変更なしまでsが観察されました。これは、サンプルが部屋の雰囲気となし、さらに乾燥させると平衡にあるときのスペクトルに影響を与えます達成されます。 </li><li>でサンプルを回転させることにより光の偏光（VVまたはVH; Vは散乱面に光の偏光の相対的な水平方向のための垂直およびHの略）を選択し、繊維軸に対してそれぞれ角度でスペクトルを取得する（ 図SI-1θ）手で飛行機。 </li><li>後続の処理のためにファイルにブリルアンスペクトルを保存します。 </li></ol></li></ol>ブリルアンスペクトルの3解析注：ブリルアンピークフィット分析は、種々の機能を用いて行うことができます。これは粘弾性メディアで減衰音響モードから発信ピークの有効なモデルであるように減衰調和振動子（DHO）機能4,13を選択しました。 <ol><li> ブリルアンピークのフィット分析 <ol><li>目への関心のピークのためのスペクトル範囲を選択します電子のブリルアンスペクトル。 </li><li>スペクトルのバックグラウンドがゼロよりもはるかに高い場合フィットのベースラインを有効にします。 注：ベースラインは、スペクトルの間で変化させることができます。補正は、体系的かつ再現可能な方法で適用されていることを確認してください。 </li><li>収束が達成され、最高のフィッティング曲線が得られるまで繰り返し関心のブリルアンピークにDHO機能4,13を使用してフィッティング詳しい最小二乗を適用します。次に、ファイルにフィット結果を保存します。 </li><li>各ブリルアンダブレットの2つのピークのフィッティングパラメータから平均値を求めます。 </li><li>ピーク周波数からの音響波速度を計算する（下式を使用して）。 </li><li>グラフを通してフィット結果をプロットし、繊維軸に対する角度対例えば、弾性波速度、θ このような弾性テンソル係数などの機械的な量を抽出する（9音響異方性のシステムのために、例えば ）関連のモデルを適用します。 </li></ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Brillouin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+de+la+lumi&#232;re+et+des+rayonnes+X+par+un+corps+transparent+homog&#232;ne;+influence+de+l'agitation+thermique.">Diffusion de la lumi&#232;re et des rayonnes X par un corps transparent homog&#232;ne; influence de l'agitation thermique.</a> Ann. Phys. 17, 88-122 (1922).</li><li>Caponi, S., Corezzi, S., Mattarelli, M., Fioretto, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+effects+on+the+elastic+properties+of+amorphous+polymeric+materials.">Stress effects on the elastic properties of amorphous polymeric materials.</a> J. Chem. Phys. 141 (21), 214901 (2014).</li><li>Mattarelli, M., Montagna, M., Still, T., Schneider, D., Fytas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibration+spectroscopy+of+weakly+interacting+mesoscopic+colloids.">Vibration spectroscopy of weakly interacting mesoscopic colloids.</a> Soft Matter. 8 (15), 4235-4243 (2012).</li><li>Comez, L., Masciovecchio, C., Monaco, G., Fioretto, D., Robert, E. C., Robert, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Solid State Physics. 63, 1-77 (2012).</li><li>Madami, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+a+propagating+spin+wave+induced+by+spin-transfer+torque.">Direct observation of a propagating spin wave induced by spin-transfer torque.</a> Nat. Nanotechnol. 6 (10), 635-638 (2011).</li><li>Harley, R., James, D., Miller, A., White, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phonons+and+the+elastic+moduli+of+collagen+and+muscle.">Phonons and the elastic moduli of collagen and muscle.</a> Nature. 267 (5608), 285-287 (1977).</li><li>Cusack, S., Miller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+elastic+constants+of+collagen+by+Brillouin+light+scattering.">Determination of the elastic constants of collagen by Brillouin light scattering.</a> J. Mol. Biol. 135 (1), 39-51 (1979).</li><li>Vaughan, J. M., Randall, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brillouin+scattering,+density+and+elastic+properties+of+the+lens+and+cornea+of+the+eye.">Brillouin scattering, density and elastic properties of the lens and cornea of the eye.</a> Nature. 284 (5755), 489-491 (1980).</li><li>Palombo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomechanics+of+fibrous+proteins+of+the+extracellular+matrix+studied+by+Brillouin+scattering.">Biomechanics of fibrous proteins of the extracellular matrix studied by Brillouin scattering.</a> J. R. Soc. Interface. 11 (101), (2014).</li><li>Sivan, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+accumulation+of+pentosidine+in+aggrecan+and+collagen+from+normal+and+degenerate+human+intervertebral+discs.">Age-related accumulation of pentosidine in aggrecan and collagen from normal and degenerate human intervertebral discs.</a> Biochem. J. 399 (1), 29-35 (2006).</li><li>Soskel, N. T., Wolt, T. B., Sandberg, L. B., Leon, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. 144, 196-214 (1987).</li><li>Fioretto, D., Scarponi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+a+glassy+polymer+studied+by+Brillouin+light+scattering.">Dynamics of a glassy polymer studied by Brillouin light scattering.</a> Mater. Sci. Eng. A. 521-522, 243-246 (2009).</li><li>Palombo, F., Madami, M., Stone, N., Fioretto, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+mapping+with+chemical+specificity+by+confocal+Brillouin+and+Raman+microscopy.">Mechanical mapping with chemical specificity by confocal Brillouin and Raman microscopy.</a> Analyst. 139 (4), 729-733 (2014).</li><li>Scarcelli, G., Yun, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multistage+VIPA+etalons+for+high-extinction+parallel+Brillouin+spectroscopy.">Multistage VIPA etalons for high-extinction parallel Brillouin spectroscopy.</a> Opt. Express. 19 (11), 10913-10922 (2011).</li><li>Scarcelli, G., Kim, P., Yun, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Measurement+of+Age-Related+Stiffening+in+the+Crystalline+Lens+by+Brillouin+Optical+Microscopy.">In Vivo Measurement of Age-Related Stiffening in the Crystalline Lens by Brillouin Optical Microscopy.</a> Biophys. J. 101 (6), 1539-1545 (2011).</li><li>Scarcelli, G., Yun, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Brillouin+optical+microscopy+of+the+human+eye.">In vivo Brillouin optical microscopy of the human eye.</a> Opt. Express. 20 (8), 9197-9202 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

ブリルアン散乱分光法は、タンパク質繊維の弾性テンソルの個々の成分は、前例のない詳細に特徴付けすることが可能なユニークなツールです。また、測定は、顕微鏡スケールで行うことができ、それによって私たちは、初めて、複雑の機械的、そしておそらく機能、意義を理解することができ、生物学的構造のマイクロスケールの力学への新たな洞察を提供してくれるだろうマトリックスアーキテクチャおよび生化学に近年では明らかにされています。 技術は、GHzの周波数範囲での機械的特性を測定します。このドメインは、構造的な生体高分子のために前に探求されていない、それは両方上昇し、弾力性の分子機構に関する基本的な質問に答えるために手段を提供します。 私たちは、動物組織からのコラーゲンとエラスチン線維を抽出するための手順を説明し、ブリルアンscatteriを測定するために繊維バイオメカニクスの完全な説明を達成するために、反射性の基板を使用してngのスペクトル。プロトコル内の重要なステップは、精製された繊維が得られ、適切な実験条件は、繊維状タンパク質の再現性の測定のための場所であることを確認するものです。しかし、抽出手順は、繊維の機械的特性を変更することが念頭に置かなければなりません。 技術の変更は、microfocusedブリルアン散乱およびマッピングのための光学顕微鏡とのカップリングが13に近づく伴い、補完的な技術と可能な組み合わせ（ 例えば、ラマン散乱）。技術の現在の用途は主に切除された生物学的材料に焦点を当てているが、重要な進展は、 例えば、複数のVIPAエタロン14に基づくものは、既にアプリケーションの範囲悪魔とのベッドサイドにベンチトップからこの技術の翻訳を可能にしていますインビボ適用における潜在含め15,16 strated。 VIPAのアプローチは、私たちが説明するものに代わるものです。それはより速い取得時間を持っているが、そのようなここで分析されるような不透明な試料の場合には、必ずしも適切ではありません。そのコントラストが準弾性光を拒絶するのに十分ではないので、また、反射基板の使用は、VIPAエタロンを使用してセットアップで実用的ではありません。スペクトルデータセットと材料の本質的に弱い散乱断面積の取得の速度に関連する制限は、動的生物学的システムへと深部組織内からのデータの取得にアプリケーションを制限することがありますが、技術的な改良は、現在のパフォーマンスを改善することができます。 BLSは、細胞外マトリックス上での基本的な生物物理学的研究の主要なツールであることを約束することにより、マトリックスの成長および病理学におけるその喪失時の機械的性質の進化に新たな洞察を生成します変性。しかし、測定が非侵襲的であるため、 生体内で行われるかもしれないことを覚えておくことが重要です。実際、これは既に角膜16で達成されており、そのような作業は、結合組織疾患の広い範囲のための新しい診断ツールを開発するためのプラットフォームを提供することができます。 超音波エラストグラフィと原子間力顕微鏡（AFM）は、マイクロメカニカル測定する別の方法ですが、BLS技術が前者よりも（細胞内スケール）より良い空間分解能を提供し、AFMとは異なり、試料に機械的な力を課さないとに限定されるものではありません表面だけの機能の解析。巨視的な株からのヤング率がMPaの（さらなる詳細は、他の場所で報告される）のオーダーでありながら、コラーゲンとエラスチンのブリルアン弾性率は、GPaの範囲内にあります。この結果は、のために、励起周波数に強く依存して差動弾性率を示し、繊維の粘弾性挙動。 BLSは、生物医学科学の問題や材料の広い範囲に適用することができます。これは、生体組織の生理学および病理学上の質問に答えるのに役立つだけでなく、分子レベルの物質との相互作用の基本的な理解のための物理的なツールを提供することができます。

ブリルアン光散乱（BLS）効果は1922年1でレオンブリルアンによって発見されたそれは、物質中の熱活性化音響フォノンによって可視光の非弾性散乱で構成されています。固体物理学では、音響フォノンは、格子内のすべての原子のコヒーレント振動があります。格子内の原子の2つの交互のタイプの一次元鎖が（ 図1）散乱IR吸収およびラマンによってプローブBLSによって明らかにされた音響フォノンと、光学フォノンとの間の差を示す簡単なモデルです。光学フォノンは、原子の外の相運動である一方で音響フォノンは、（縦音響フォノン）または伝播方向（横方向の音響フォノン）に垂直伝播の方向に沿った変位とチェーン内の原​​子の同相運動であります振動電気双極子モーメント（縦または横モード）を生成します。 BLS分光SCOPYは、1920年代から分析科学で使用されています。しかし、唯一の1980年代から高コントラストの測定は、タンデムマルチパスファブリペロー分光計の使用により可能でした。それ以来、2-4と磁性材料（光子マグノン相互作用を介して）（フォトン-フォノン相互作用が利用される）凝縮物質中の分析用途のためのBLSの進歩の増加数5がもたらされました。生物医学的応用6-8の上の精液の作品がここで適用される1との弾性テンソルの完全な説明を達成するために、血小板状に反射基板を使用して、以前に9を説明したものを含め、様々なアプローチの開発へのルートを舗装していますサンプル。 本研究では、我々は結合組織における細胞外マトリックスの基本的な構成要素、エラスチンおよびI型コラーゲン線維性タンパク質にBLS分光法を適用します。 TIコラーゲンYPEすることは、腱などの組織では本質的に剛直な繊維を形成するために大規模な架橋と横方向と縦方向に組み立て剛性、三重らせん分子です。コラーゲンのネットワークは、多くの場合、エラスチンのネットワークと、異常に、エントロピーとその環境との疎水性相互作用の組み合わせによって長距離弾性を発生し、かつ、肺や皮膚などの組織の機能に必須であるタンパク質を共存します。両方の繊維は現在研究中で六方晶モデルを用いてモデル化される。9第1部では、動物組織からの繊維を抽出し、分光測定用のサンプルを調製するためのプロトコルを説明します。パート2では、ブリルアン装置を設定し、繊維からのスペクトルを取得するための手順が示されています。第3部は、データ解析の詳細は、そこに含まれる関連した機械的な情報を抽出するブリルアンスペクトルに適用与えます。次に、代表的な結果を提示し、discusseされていますD。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="762">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Chondroitinase ABC</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">C2905</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Tris Buffer</td>
			<td style="width:119px;">Fluka</td>
			<td style="width:151px;">93358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Sodium Acetate</td>
			<td style="width:119px;">Fisher Scientific</td>
			<td>S608-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">PBS</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Sodium Azide</td>
			<td style="width:119px;">Fisher Scientific</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Streptomyces Hyaluronidase&#160;</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1136-1AMP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:119px;">Fisher Scientific</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Trypsin</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">T4665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Sodium Phosphate</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td style="width:119px;">Fisher Scientific</td>
			<td>S320-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Pure Water</td>
			<td style="width:119px;">Millipore</td>
			<td>ZRQS0P3WW</td>
			<td>Produced In-House&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">Distilled Water</td>
			<td style="width:119px;">Bibby Scientific Limited</td>
			<td style="width:151px;">D4000</td>
			<td>Produced In-House from water still</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Euthatal</td>
			<td style="width:119px;">Merial&#160;</td>
			<td style="width:151px;">J01601A&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">Tandem Interferometer TFP-1</td>
			<td style="width:119px;">JRS Scientific Instruments</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Freezer</td>
			<td style="width:119px;">Lec</td>
			<td style="width:151px;">TU55144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Refrigerator</td>
			<td style="width:119px;">Zanussi</td>
			<td style="width:151px;">ZBA15021SA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Hot Plate</td>
			<td style="width:119px;">Fisher Scientific</td>
			<td>SP88857206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Clamps</td>
			<td style="width:119px;">VWR</td>
			<td>241-7311 &#38; 241-7201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Clamp Stand</td>
			<td style="width:119px;">VWR</td>
			<td>&#160;241-0093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Thermometer</td>
			<td style="width:119px;">Fisher Scientific</td>
			<td>13-201-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Cling Film</td>
			<td style="width:119px;">Sainsbury&#39;s</td>
			<td>7650540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Parafilm</td>
			<td style="width:119px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7793-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">Silicone</td>
			<td style="width:119px;">IDB Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>No catalogue number. Order upon request</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Cover Glass</td>
			<td style="width:119px;">VWR</td>
			<td>631-1571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Conical Flask</td>
			<td style="width:119px;">VWR</td>
			<td>214-1175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Beaker</td>
			<td style="width:119px;">VWR</td>
			<td>213-0469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Measuring Cylinder</td>
			<td style="width:119px;">VWR</td>
			<td>612-3838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Vial</td>
			<td style="width:119px;">VWR</td>
			<td>548-0051 &#38; 548-0863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Petri Dish</td>
			<td style="width:119px;">VWR</td>
			<td>391-0441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">Scalpel</td>
			<td style="width:119px;">Swann Morton Ltd</td>
			<td>&#160;0914 &#38; 0308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Diamond Scribe</td>
			<td style="width:119px;">RS Instruments</td>
			<td>394-217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Soldering Iron</td>
			<td style="width:119px;">RS Instruments</td>
			<td>231-5332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Fine Forceps</td>
			<td style="width:119px;">VWR</td>
			<td style="width:151px;">232-0188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Double Micro-Spatula</td>
			<td style="width:119px;">VWR</td>
			<td>Various Sizes</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">pH Meter</td>
			<td style="width:119px;">Hanna Instruments</td>
			<td style="width:151px;">HI-2210-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:204px;">Orbital Shaker</td>
			<td style="width:119px;">IKA</td>
			<td style="width:151px;">&#160;0002819000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of extracellular matrix protein fibers for brillouin spectroscopy

Brillouin spectroscopy is an emerging technique in the biomedical field. It probes the mechanical properties of a sample through the interaction of visible light with thermally induced acoustic waves or phonons propagating at a speed of a few km/sec. Information on the elasticity and structure of the material is obtained in a nondestructive contactless manner, hence opening the way to in vivo applications and potential diagnosis of pathology. This work describes the application of Brillouin spectroscopy to the study of biomechanics in elastin and trypsin-digested type I collagen fibers of the extracellular matrix. Fibrous proteins of the extracellular matrix are the building blocks of biological tissues and investigating their mechanical and physical behavior is key to establishing structure-function relationships in normal tissues and the changes which occur in disease. The procedures of sample preparation followed by measurement of Brillouin spectra using a reflective substrate are presented together with details of the optical system and methods of spectral data analysis.

この実験（ 図SI-1A）で使用されるブリルアン分光装置は、以前に記載されている。9は、単一モードの試料に76 mWの出力パワーで532nmの固体レーザを用います。 20センチメートル色消しレンズは、試料にレーザ光を集光し、後方散乱ジオメトリのサンプルからの散乱光を収集します。タンデムマルチパスファブリペロー干渉計は、その後、低雑音フォトダイオード検出器によって検出される散乱光をフィルタリングするために使用されます。このアプローチは、エタロンの自己整合ピエゾスキャンにより非常に高いコントラスト（ 約 120デシベル）と安定性を提供します。偏光子及び検光子が入射し、散乱光の偏光を選択するために導入されます。スペクトルは、通常、O偏光子は、入射光の偏光の垂直（V）方向、あるいは垂直方向（V）を選択する分析器を選択する固定されたままで得られます散乱光の偏光のR、水平（H）方向。この構成では、縦方向および横方向の音響モードがそれぞれ検出されます。 典型的なブリルアンスペクトル弾性散乱およびサンプルの力学の署名である均等にシフトピーク、またはブリルアンダブレット 、の1つまたは複数の組に強い中央のピークを有します。これらの測定では、散乱光は、表面に対して平行な（PSモード）走行バルクフォノンから、準直交サンプルに走行バルクフォノン両方から発信され、試料基板界面における入射光の反射の後にすることができる。9 図2は、30 GHzの自由スペクトル範囲は、0.2 GHzの解像度でVV偏光で得られた乾燥および水和トリプシン消化し ​​たコラーゲン繊維のBLSスペクトルを示し、約10分間の収集時間スペクトルあたり。各スペクトルは、θ、回転の特定の角度に対応します （ 図SI-1C）。 θ= 0°での乾燥コラーゲン繊維で、縦モードは、PSモードながら（18.92±0.02）GHzでバルクピークを生じさせる（9.85±0.03）ギガヘルツ（ 図2A）です。同じ範囲内でθを変える時に低い周波数へのPSピークシフトθが 90°（フォノンラジアル方向をプロービング）に0°（繊維の軸配向をプロービングフォノン）から行くように、バルクピークに対し、ごくわずかに赤方偏移（フォノンは回転を通じて準半径方向をプロービング）。湿ったコラーゲン繊維では、原因縦フォノンに2つのピークが4.9ギガヘルツ（ 図2B）で約 10.5 GHzおよびPSピークにおけるバルクピークに、実験を通して本質的に不変です。これは、18.92のデータに対するピーク周波数の80〜100％の減少を（示しそして、9.85 GHzの、それぞれ）、従って水和に起因する材料の剛性、の。水和したコラーゲンのバルクおよびPSモードは水が果たした支配的な役割で、その弾性定数は、水と繊維の寄与の組み合わせであることを示唆し、純水のモードに周波数に近くにあることに注意してください。 図3は、VH偏波とθ= 30°で測定された乾燥トリプシン消化し ​​たコラーゲン繊維のスペクトルを示します。 VV偏波の漏洩は、PSおよびバルクピークはまだ観察することができます。横モードは（4.1±0.2）GHz帯（θ= 0°）0°〜90°からθの変化として少し青シフトでピークを占めています。両方の横方向およびPSピークに対するフィット結果も示されています。ピークパラメータを抽出し、音響波速度は、V L = Vの λ/√2として得ました<eメートル&gt; vが曲線フィットのピークの分析とλによって得られたモードの周波数は、励起波長、532 nmです。従って、;（ 図SI-1B、C散乱ジオメトリのために、Q S = 2、K iが （Φ）を SIN）このジオメトリにおいて、材料の屈折率の知識が音響モードの速度を得るために必要とされないことに注意してくださいこのアプローチは特に有利になります。 図4は、角度θの関数として縦と横モード（PSとTピーク）から得られた弾性波速度のプロットであります 。下記の式A1とA2 - -六方対称弾性ソリッド7のモデルにフィット分析では、ドライトリプシン消化型の弾性テンソルの5つのコンポーネント私は繊維（ 表1）コラーゲンを提供します。 9で与えられます。 <img alt="式（1）" src="/files/ftp_upload/54648/54648eq1.jpg" /> 、（A1） <img alt="式（2）" src="/files/ftp_upload/54648/54648eq2.jpg" /> 、（A2） ρは材料の密度、およびc 11、C 33、44 CおよびC 13がどこにある六角形の対称性を持つシステムを特徴づける5弾性定数の4です。第五の定数は、12 C、12〜C 11 Cおおよその関係に由来することができる- 。2 C 44 7 係数は、以前に未精製コラーゲンfibeから得られたものと類似していますRS。9顕著な違いは、弾性率Eの同様の値に反映されている13係数cのために発生しǁとE <img alt="垂直" src="/files/ftp_upload/54648/54648fig_flippedT.jpg" />精製されたコラーゲン（約7.2および7.7 GPaで）。 図5は、θ対湿ったコラーゲンの縦弾性波速度のプロットであります 。この場合、周波数の周期的な変化は、誤差の範囲内で一定速度を与え、観察されない。 図6は、θ= 0°で測定された乾燥および水和エラスチン線維のスペクトルを示す図 。横モードは、これらのサンプルのために検出されませんでした。乾燥エラスチンでは、バルクピークは、8.2 GHzの9（13および20％の乾燥コラーゲンの対応するピークよりも低い）でPSモードながら、16.8 GHzで発生します。湿ったエラスチン繊維は、バルクpを提示します（12.30±0.01）ギガヘルツ（乾燥エラスチンのバルクピークよりも周波数が37％以下）でEAK。湿ったエラスチンのPSモードがあるため、それらの周波数での弾性ピークの激しい尾のスペクトルには明らかではありません。一方、 約 7.5 GHzでのピークは、バルク水に起因します。 図7は、θに乾燥エラスチン繊維内の音響波速度の依存性を示します。これらのデータから、弾性テンソル成分（および機械的弾性率）は、（ 表1）を得た。9湿ったコラーゲンのように、等方性の証拠は水和エラスチン繊維の機械的弾性率です。これらの結果は、ブリルアン分光法は、剛性、組成や材料の構造的側面に関連する情報を与えることができる方法を示しています。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54648/54648fig1.jpg" /> Fiのグレ1. アコースティックと原子の1次元鎖中の光学フォノン。一次元二原子チェーンにおける音響と光の振動の模式図。原子は質量m 1およびm 2を有し、交互。矢印は原子の変位を示している。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54648/54648fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54648/54648fig2.jpg" /> 私はラットの尾の腱からコラーゲン線維トリプシン精製型の 図2 ブリルアンスペクトル。（A）乾燥繊維及び（B）のスペクトルは、度で、繊維軸θに対して異なる角度でVV測定から繊維を水和。純粋な蒸留水のスペクトルも示されています。スペクトルは、バルクピークの強度（高さ）に標準化しました。<html>標識B及びPSは、それぞれ、バルク及びパラレル表面モードに関するピークを示します。エラーバーは標準誤差（カウント数の平方根）を示す。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54648/54648fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54648/54648fig3.jpg" /> 私はラットの尾の腱からコラーゲン線維ドライトリプシン精製タイプの 図3 ブリルアンスペクトル。スペクトルθでのVHの測定から = 30°。ラベルT、PSお​​よびBは、それぞれ、平行に面横に関連するピークは、バルクモードを示します。 TとPSの両方のモードの減衰調和振動子（DHO）モデルを使用してフィット分析の結果も示されています。エラーバーは標準誤差（カウント数の平方根）を示します。/54648fig3large.jpg &quot;ターゲット=&quot; _空白 &quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54648/54648fig4.jpg" /> 繊維軸に対して角度対ドライトリプシン精製コラーゲン中の弾性波速度の 図4. プロット。ブリルアンピークのフィット分析から得乾燥コラーゲン繊維の縦方向と横方向の弾性波速度。データは、六方対称弾性固体のモデルに適合しています。レッドライン：式A1（R 2 = 0.99）。青線：式A2（R 2 = 0.36）。エラーバーは、ブリルアンスペクトルのフィットレーベンバーグ・マルカート非線形最小二乗した後、共分散行列の対角要素の平方根から得られた標準誤差を示している。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54648/54648fig4large.jpg" target="_blank">より大きなversiを表示するには、こちらをクリックしてください。</a><html>この図の上。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/54648/54648fig5.jpg" /> 繊維軸に対して角度対ウエットトリプシン精製コラーゲンの縦弾性波速度の 図5. プロット。ブリルアンピークのフィット分析由来の水和コラーゲン繊維の縦弾性波速度。示される線は、目のためのガイドであり、この範囲内で音響波速度の平均値を与えます。エラーバーは、ブリルアンスペクトルのフィットレーベンバーグ・マルカート非線形最小二乗した後、共分散行列の対角要素の平方根から得られた標準誤差を示す。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54648/54648fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> JPG &quot;/&gt; ウシ項靱帯からエラスチン線維の 図6. ブリルアンスペクトル。θで乾燥および水和繊維のスペクトル = 0°。スペクトルは、バルクピークの強度（高さ）に標準化しました。標識B及びPSは、それぞれ、バルク及びパラレル表面モードに関するピークを示します。 B FとB Wは 、それぞれ、繊維と水のバルクピークを参照してください。エラーバーは標準誤差（カウント数の平方根）を示す。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54648/54648fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図7" src="/files/ftp_upload/54648/54648fig7.jpg" /> 繊維軸に対して角度対乾燥エラスチンの縦弾性波速度の図7.プロット。ドライエラスチン嘘の縦弾性波速度ERブリルアンピークのフィット分析由来。データは、六方対称弾性固体のモデルに適合しています。レッドライン：式A1 9（R 2 = 0.74）。エラーバーは、ブリルアンスペクトルのフィットレーベンバーグ・マルカート非線形最小二乗した後、共分散行列の対角要素の平方根から得られた標準誤差を示す。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54648/54648fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="補足図1" src="/files/ftp_upload/54648/54648supfig1.jpg" /> 図SI-1。ブリルアンセットアップおよびBLS散乱ジオメトリの概略図（A）固体レーザによって放射された入射光は、色消しレンズを介して試料に送られます。バルク音響フォノンによって、およびREFLから生じるものによって散乱された光試料と接触する基板表面での光のectionは、レンズによって集めタンデムマルチパスファブリペロー干渉計によって濾過し、光電子増倍管によって検出されます。 FP1とFP2は、タンデムセットアップを構成する2つの干渉計を示しています。偏光子は、入射光の偏光を選択し、分析器は、散乱光の偏光を選択するために使用されます。 （B）は、反射性シリコン基板の表面に接触する検体と形状をBLS。スライドガラス（図示せず）が区画を密封するために、試料の上に配置され、穏やかな圧力を基板の隅部のパッドを介して印加されます。入射光（K i）は 、レンズを通過し、空気サンプルインターフェース（K &#39;I）で屈折し、サンプル基板の界面に集光されます。同じレンズバルクフォノンの両方との相互作用から（K さん ）の結果（qで収集した散乱光b）及びサンプル（Q sのもの走行PS）。 。光の方向と表面の法線間の角度がΦとΦ」として示されている（C）サンプルのと採用座標系の模式図。 zは 、繊維の方向に異常軸を平行に定義されています。 。事件の波数と光散乱; q個の B、Q：θの角度αは k iを 、K &#39;I、K、S、K のそれぞれのz -軸にbをフォノンのQ sおよびqの方向との間のものであり、それぞれの 、バルクおよびPSモードの波数ベクトル、。 （参考文献9から転載） <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54648/54648supfig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <pクラス= &quot;jove_content&quot;のfo：弾性波速度の適合分析から得キープして-next.within-ページ= &quot;常に&quot;&gt; 表1弾性テンソル係数 Iは（コラーゲン線維ドライトリプシン精製型の弾性テンソル係数この作業）とエラスチン繊維（文献9）。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> サンプル </td><td colspan="2"> 弾性係数（GPA） </td></tr><tr><td>トリプシン消化したコラーゲン</td><td> C 33 </td><td> 18.7±0.1 </td></tr><tr><td></td><td> C 11 </td><td> 14.4±0.2 </td></tr><tr><td></td><td> C 44 </td><td> 3.4±0.1 </td></tr><tr><td></td><td> C 12 </td><td> 7.2±0.2 </td></tr><tr><td></td><td> C 13 </td><td> 11.2±0.3 </td></tr><tr><td>エラスチン</td><td> C 33 </td><td> 11.5±0.2 </td></tr><tr><td></td><td> C 11 </td><td> 10.4±0.1 </td></tr><tr><td></td><td> C 44 </td><td> 1.9±0.2 </td></tr><tr><td></td><td> C 12 </td><td> 6.6±0.2 </td></tr><tr><td></td><td> C 13 </td><td> 6.8±0.3 </td></tr></tbody></table>

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Preparation of Extracellular Matrix Protein Fibers for Brillouin Spectroscopy

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