Name: a simple mechanical procedure to create limbal stem cell deficiency in mouse
Uploaded: 2016-11-17T13:00:00
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Os autores agradecem Ruth Zelkha, MS, por sua assistência generosa em imagem. Esta pesquisa foi apoiada pelo Programa de Clínica de Desenvolvimento Scientist Award K12EY021475 para mim, conceder R01 EY024349-01A1 a ARD, EY01792 concessão núcleo do National Eye Institute, NIH, e um donativo incondicional da Pesquisa para prevenir a cegueira. ARD é o destinatário de um Prémio Carreira de Desenvolvimento de Pesquisa para prevenir a cegueira.

Todos os procedimentos realizados em animais em conformidade com a Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia declarações para o uso de animais em pesquisa visão. Quatorze quatro a 6J de seis meses de idade, macho / fêmea C57BL / tipo selvagem foram utilizados: dez ratos para o modelo de lesão e quatro como animais de controlo (córneas sem ferimentos). 1. Preparação de animais <ol><li> Anestesiar um rato com uma injecção intraperitoneal de 100 mg / kg de cetamina e 5 mg / ...

<ol>
	<li>Afsharkhamseh, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+limbal+stem+cell+deficiency+after+mechanical+and+thermal+injuries+in+mice.">Stability of limbal stem cell deficiency after mechanical and thermal injuries in mice.</a> Exp. Eye Res. 145, 88-92 (2015).</li><li>Dor&#224;, N. J., Hill, R. E., Collinson, J. M., West, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+tracing+in+the+adult+mouse+corneal+epithelium+supports+the+limbal+epithelial+stem+cell+hypothesis+with+intermittent+periods+of+stem+cell+quiescence.">Lineage tracing in the adult mouse corneal epithelium supports the limbal epithelial stem cell hypothesis with intermittent periods of stem cell quiescence.</a> Stem Cell Res. 15 (3), 665-677 (2015).</li><li>Ahmad, S., Osei-Bempong, C., Dana, R., Jurkunas, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+culture+and+transplantation+of+human+limbal+stem+cells.">The culture and transplantation of human limbal stem cells.</a> J. Cell Physiol. 225 (1), 15-19 (2010).</li><li>Kolli, S., Ahmad, S., Lako, M., Figueiredo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+clinical+implementation+of+corneal+epithelial+stem+cell+therapy+for+treatment+of+unilateral+limbal+stem+cell+deficiency.">Successful clinical implementation of corneal epithelial stem cell therapy for treatment of unilateral limbal stem cell deficiency.</a> Stem Cells. 28 (3), 597-610 (2010).</li><li>Ahmad, S., Figueiredo, F., Lako, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+epithelial+stem+cells:+characterization,+culture+and+transplantation.">Corneal epithelial stem cells: characterization, culture and transplantation.</a> Regen. Med. 1 (1), 29-44 (2006).</li><li>He, H., Yiu, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell-based+therapy+for+treating+limbal+stem+cells+deficiency:+A+review+of+different+strategies.">Stem cell-based therapy for treating limbal stem cells deficiency: A review of different strategies.</a> Saudi J. Ophthalmol. 28 (3), 188-194 (2014).</li><li>Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+the+basement+membrane+enhances+corneal+wound+healing.">Removal of the basement membrane enhances corneal wound healing.</a> Exp Eye Res. 93 (6), 927-936 (2011).</li><li>Stepp, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wounding+the+cornea+to+learn+how+it+heals.">Wounding the cornea to learn how it heals.</a> Exp. Eye Res. 121, 178-193 (2014).</li><li>Amirjamshidi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limbal+fibroblast+conditioned+media:+a+non-invasive+treatment+for+limbal+stem+cell+deficiency.">Limbal fibroblast conditioned media: a non-invasive treatment for limbal stem cell deficiency.</a> Mol. Vis. 17, 658-666 (2011).</li><li>Li, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+AlgerBrush+II+rotating+burr+as+a+tool+for+inducing+ocular+surface+failure+in+the+New+Zealand+White+rabbit.">Evaluation of the AlgerBrush II rotating burr as a tool for inducing ocular surface failure in the New Zealand White rabbit.</a> Exp. Eye Res. 147, 1-11 (2016).</li><li>Ti, S. E., Anderson, D., Touhami, A., Kim, C., Tseng, S. C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+outcome+following+transplantation+of+ex+vivo+expanded+limbal+epithelium+on+amniotic+membrane+for+total+limbal+deficiency+in+rabbits.">Factors affecting outcome following transplantation of ex vivo expanded limbal epithelium on amniotic membrane for total limbal deficiency in rabbits.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 43 (8), 2584-2592 (2002).</li><li>Ma, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+chemically+burned+rat+corneal+surface+by+bone+marrow-derived+human+mesenchymal+stem+cells.">Reconstruction of chemically burned rat corneal surface by bone marrow-derived human mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells. 24 (2), 315-321 (2006).</li><li>Bu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+activated+omental+cells+on+rat+limbal+corneal+alkali+injury.">Effects of activated omental cells on rat limbal corneal alkali injury.</a> Exp. Eye Res. 121, 143-146 (2014).</li><li>Luengo Gimeno, F., Lavigne, V., Gatto, S., Croxatto, J. O., Correa, L., Gallo, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+corneal+stem-cell+transplantation+in+rabbits+with+severe+ocular+alkali+burns.">Advances in corneal stem-cell transplantation in rabbits with severe ocular alkali burns.</a> J. Cataract Refract. Surg. 33 (11), 1958-1965 (2007).</li><li>Lin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+limbal+stem+cell+deficiency+induced+by+topical+medication+with+the+preservative+benzalkonium+chloride.">A mouse model of limbal stem cell deficiency induced by topical medication with the preservative benzalkonium chloride.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54 (9), 6314-6325 (2013).</li><li>Huang, A. J., Tseng, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+epithelial+wound+healing+in+the+absence+of+limbal+epithelium.">Corneal epithelial wound healing in the absence of limbal epithelium.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 32 (1), 96-105 (1991).</li><li>Liu, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cornea-specific+expression+of+K12+keratin+during+mouse+development.">Cornea-specific expression of K12 keratin during mouse development.</a> Curr. Eye Res. 12 (11), 963-974 (1993).</li><li>Nakatsu, M. N., Gonz&#225;lez, S., Mei, H., Deng, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+limbal+mesenchymal+cells+support+the+growth+of+human+corneal+epithelial+stem/progenitor+cells.">Human limbal mesenchymal cells support the growth of human corneal epithelial stem/progenitor cells.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 55 (10), 6953-6959 (2014).</li><li>Pajoohesh-Ganji, A., Pal-Ghosh, S., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+goblet+cells+and+their+niche:+implications+for+corneal+stem+cell+deficiency.">Corneal goblet cells and their niche: implications for corneal stem cell deficiency.</a> Stem Cells. 30 (9), 2032-2043 (2012).</li><li>McCloy, R. A., Rogers, S., Caldon, C. E., Lorca, T., Castro, A., Burgess, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+inhibition+of+Cdk1+in+G+2+phase+overrides+the+SAC+and+decouples+mitotic+events.">Partial inhibition of Cdk1 in G 2 phase overrides the SAC and decouples mitotic events.</a> Cell Cycle. 13, 1400-1412 (2014).</li></ol>

Este artigo descreve uma técnica reproduzível e relativamente simples para criar um modelo de mouse LSCD. Há vários aspectos importantes deste modelo que são dignos de nota. Em primeiro lugar, ao contrário dos modelos que usam produtos químicos 11, 12, a lesão envolve primariamente o epitélio de superfície (e membrana basal), com danos mínimos para o estroma corneano subjacente ou para outras estruturas intra-oculares. Assim, existe apenas a inflamação limitada e cicatrizes, ambos os quais podem ...

O epitélio corneano é necessária para manter a clareza ea integridade da córnea. É constantemente renovada ao longo da vida através das células estaminais epiteliais que residem no limbo-uma zona estreita na junção da córnea e da conjuntiva. Estas células estaminais do limbo auto-renovação desempenham um papel crucial na regeneração do epitélio da córnea, tanto normalmente e após a lesão. esgotamento parcial ou total destas células estaminais irão resultar em erosões corneanas recorrentes, dor, cicatrização da córnea e neovascularização, a aparência das células caliciformes, e, se deixados sem tratamento cegueira, da córnea. Esta condição é conhecida como deficiência límbica (LSCD) e pode ser idiopática; hereditária; ou adquirida devido a lesões químicas ou térmicas, lentes de contacto prolongado desgaste, e inflamação crônica 1-6. Investigação sobre LSCD exige um modelo animal adequado que não imita apenas a doença em seres humanos, mas é reprodutível e sustentável, com o mínimo ummontagem de prejuízo para outras estruturas da córnea e oculares. Este modelo é necessário avaliar tratamentos e esclarecer os mecanismos da doença em níveis moleculares e celulares. Tal como descrito antes 1, com a utilização de uma broca rotativa, pode-se facilmente desenvolver um modelo de ratinho de LSCD que apresenta as vantagens acima mencionadas e persiste durante pelo menos três meses. O objetivo deste estudo é apresentar um modelo simples, reprodutível e sustentável do rato de LSCD. A broca rotativa é uma ferramenta útil que remove uniformemente o epitélio sem ferir o estroma subjacente 1. Ele tem sido usado para induzir a erosão da córnea central 7, 8 em estudos de cicatrização de feridas. A técnica apresentada, ora para criar LSCD em um mouse não tem sido relatada antes. Anteriormente introduzidos métodos de raspagem do epitélio com um resultado espátula romba num menos uniforme lesão, particularmente no limbo e um fenótipo mais variável 1, 9, com mais restauração óepitélio normal da córnea f 1. Ao contrário do raspador sem corte, a broca rotativa elimina a membrana basal epitelial bem como 7, 8, 10. Outros métodos descritos para separar as células estaminais envolvem a utilização de produtos químicos, tais como hidróxido de sódio, n-heptanol, e cloreto de benzalcónio, o que não só pode induzir lesão indesejada para estruturas oculares subjacentes, mas também pode levar a inflamação significativa e subsequente opacificação da córnea ou metaplasia escamosa epitelial 11-15. A rebarba de rotação não está associado a estas complicações graves. A remoção cirúrgica do epitélio do limbo, sozinho ou com o uso de produtos químicos 10, 11, 16, é mais difícil de realizar e não é a melhor opção em animais com pequenas olhos e um epitélio do limbo fina (como ratos). Além disso, surpreendentemente, limbectomy pode ainda deixar algum do epitélio do limbo para trás 10. A técnica descrita abaixo irá resultar em LSCD com uma neovascularizaçãod conjuntivalização que imita a apresentação de LSCD completa em pacientes e tem a duração de pelo menos três meses 1. É apropriado para aqueles que pretendem estudar LSCD ou fisiopatologia cicatrização de feridas, imunologia e potenciais tratamentos em ratinhos. Possivelmente, com algumas modificações, este procedimento pode ser realizado em ratos ou coelhos 10. À medida que a rebarba rotativo remove eficientemente o epitélio, ele pode ser utilizado em qualquer pesquisa relativos à abrasão da córnea epitelial / ferimento e em qualquer tratamento relacionada ou estudos de biologia molecular.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1091">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">&#160;Rotating burr: AlgerBrush II rust ring remover&#160;</td>
			<td style="width:277px;">Rumex International Co, Clearwater, FL</td>
			<td style="width:144px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 16-141</td>
			<td style="width:351px;">0.5 mm burr. Also available from other companies.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">&#160;Surgical microscope</td>
			<td style="width:277px;">Wild Heerbrugg, Switzerland</td>
			<td style="width:144px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Wild M691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">&#160;Digital camera</td>
			<td style="width:277px;">Nikon, Thailand</td>
			<td style="width:144px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">&#160;Nikon FS-2 slit lamp</td>
			<td style="width:277px;">Nikon, Japan</td>
			<td style="width:144px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">&#160;Polyclonal anti-CK12 antibody</td>
			<td style="width:277px;">Santa Cruz Blotechnology, CA,</td>
			<td style="width:144px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; SC-17101</td>
			<td>1:100 concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">&#160;Monoclonal anti-CK8 antibody</td>
			<td style="width:277px;">TROMA-I-s, Iowa City, IA</td>
			<td style="width:144px;">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; AB_531826</td>
			<td>1:50 concentration</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple mechanical procedure to create limbal stem cell deficiency in mouse

deficiência límbica (LSCD) é um estado de mau funcionamento ou perda de células-tronco epiteliais do limbo, após o qual o epitélio corneano é substituído por conjuntiva. Os pacientes sofrem de defeitos da córnea recorrentes, dor, inflamação, e perda de visão. Anteriormente, foi descrito um modelo de murídeo de LSCD e comparado com dois outros modelos. O objetivo era produzir um modelo de rato consistente de LSCD que ambos os imita o fenótipo em humanos e dura o tempo suficiente para torná-lo possível estudar a fisiopatologia da doença e avaliar novos tratamentos. Aqui, a técnica é descrita em mais detalhe. Uma ferramenta motorizada com uma broca rotativa foi concebida para remover os anéis de ferrugem a partir da superfície da córnea ou para suavizar a cama pterígio em pacientes. É um dispositivo adequado para criar o modelo LSCD desejado. É um fácil de usar ferramenta prontamente disponível, com uma ponta fina que torna apropriado para trabalhar em pequenos olhos, comoem ratinhos. A sua aplicação impede traumas desnecessários ao olho e que não resultam em lesões indesejadas, como é frequentemente o caso com os modelos de lesão química. Ao contrário de um raspador romba, que remove o epitélio com a membrana basal. Neste protocolo, a área límbica foi desgastada duas vezes, e então todo o epitélio corneano foi raspada do limbo a limbo. Para evitar lesões estroma, o cuidado foi tomado para não escovar a superfície da córnea uma vez que o epitélio já foi removido.

Dentro de um mês após a realização desta técnica, 100% das córneas desenvolveram neovascularização superficial (Figura 1A. As fotos foram tiradas com uma câmera conectada a uma lâmpada de fenda sob um campo brilhante e filtro azul cobalto). Em 18/20 (90%) dos olhos, neovascularização envolvida a totalidade da superfície da córnea (Figura 1A). Em 2/20 (10%), a neovascularização foi observada em três dos quatro quadrantes da córnea, mas a...

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A Simple Mechanical Procedure to Create Limbal Stem Cell Deficiency in Mouse

O seguinte artigo fornece uma técnica fácil, reprodutível para efetivamente criar um modelo do rato sustentável da deficiência límbica (LSCD). Este modelo animal é útil em testar e comparar a eficácia dos tratamentos para as doenças de células estaminais do limbo.

Um procedimento mecânico simples de criar Limbal Deficiência Stem Cell no mouse

Limbal stem cell deficiency (LSCD) is a state of malfunction or loss of limbal epithelial stem cells, after which the corneal epithelium is replaced with ...

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