Name: methods to study lipid alterations in neutrophils and the subsequent formation of neutrophil extracellular traps
Uploaded: 2017-03-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door een beurs van de Akademie für Tiergesundheit (HvH) en een beurs van het promotietraject, &quot;Animal and zoönotische infecties,&quot; van de Universiteit van Diergeneeskunde, Hannover, Duitsland, verstrekt aan Ariane Neumann.

De collectie van het perifere bloed in dit protocol werd goedgekeurd door de lokale human onderzoek ethische commissie. Alle proefpersonen op voorwaarde dat hun informed consent. 1. Isolatie van Menselijk bloed afkomstige neutrofielen door dichtheidsgradiënt centrifugeren <ol><li> Isolatie van humaan bloed afgeleide neutrofielen <ol><li> Laag ~ 20 ml bloed op 20 ml natrium diatrizoaat / dextran-oplossing bij een vlam en zonder menging. </li><li> Centrifugeer 30 min bij 47...

<ol>
	<li>Riethmuller, J., Riehle, A., Grassme, H., Gulbins, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+rafts+in+host-pathogen+interactions.">Membrane rafts in host-pathogen interactions.</a> Biochim Biophys Acta. 1758 (12), 2139-2147 (2006).</li><li>Shahbazian, H., Atrian, A., Yazdanpanah, L., Lashkarara, G. R., Zafar Mohtashami, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-inflammatory+effect+of+simvastatin+in+hemodialysis+patients.">Anti-inflammatory effect of simvastatin in hemodialysis patients.</a> Jundishapur J Nat Pharm Prod. 10, e17962 (2015).</li><li>Bavari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+raft+microdomains:+A+gateway+for+compartmentalized+trafficking+of+Ebola+and+Marburg+viruses.">Lipid raft microdomains: A gateway for compartmentalized trafficking of Ebola and Marburg viruses.</a> J Exp Med. 195, 593-602 (2002).</li><li>Zaas, D. W., Duncan, M., Rae Wright, ., J, S. N., Abraham, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+lipid+rafts+in+the+pathogenesis+of+bacterial+infections.">The role of lipid rafts in the pathogenesis of bacterial infections.</a> Biochim Biophys Acta. 1746 (3), 305-313 (2005).</li><li>Rohde, M., Muller, E., Chhatwal, G. S., Talay, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+cell+caveolae+act+as+an+entry-port+for+group+A+streptococci.">Host cell caveolae act as an entry-port for group A streptococci.</a> Cell Microbiol. 5 (5), 323-342 (2003).</li><li>Grassme, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+defense+against+Pseudomonas+aeruginosa+requires+ceramide-rich+membrane+rafts.">Host defense against Pseudomonas aeruginosa requires ceramide-rich membrane rafts.</a> Nat Med. 9 (3), 322-330 (2003).</li><li>Heung, L. J., Luberto, C., Del Poeta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+sphingolipids+in+microbial+pathogenesis.">Role of sphingolipids in microbial pathogenesis.</a> Infect Immun. 74 (1), 28-39 (2006).</li><li>Gatfield, J., Pieters, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+role+for+cholesterol+in+entry+of+mycobacteria+into+macrophages.">Essential role for cholesterol in entry of mycobacteria into macrophages.</a> Science. 288 (5471), 1647-1650 (2000).</li><li>Rapini, R. P., Bolognia, J. L., Jorizzo, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Dermatology 2-Volume Set. , (2007).</li><li>Tamilselvam, B., Daefler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Francisella+targets+cholesterol-rich+host+cell+membrane+domains+for+entry+into+macrophages.">Francisella targets cholesterol-rich host cell membrane domains for entry into macrophages.</a> J Immunol. 180 (12), 8262-8271 (2008).</li><li>Garner, M. J., Hayward, R. D., Koronakis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Salmonella+pathogenicity+island+1+secretion+system+directs+cellular+cholesterol+redistribution+during+mammalian+cell+entry+and+intracellular+trafficking.">The Salmonella pathogenicity island 1 secretion system directs cellular cholesterol redistribution during mammalian cell entry and intracellular trafficking.</a> Cell Microbiol. 4 (3), 153-165 (2002).</li><li>Gilk, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+colonization+of+host+cells+in+the+absence+of+cholesterol.">Bacterial colonization of host cells in the absence of cholesterol.</a> PLoS Pathog. 9 (1), e1003107 (2013).</li><li>Tuong, Z. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+Ror&#945;1+and+cholesterol+25-hydroxylase+expression+attenuates+phagocytosis+in+male+Roralphasg/sg+mice.">Disruption of Ror&#945;1 and cholesterol 25-hydroxylase expression attenuates phagocytosis in male Roralphasg/sg mice.</a> Endocrinology. 154 (1), 140-149 (2013).</li><li>Bryan, A. M., Farnoud, A. M., Mor, V., Del Poeta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+cholesterol+depletion+and+its+effect+on+the+phagocytosis+of+Cryptococcus+neoformans.">Macrophage cholesterol depletion and its effect on the phagocytosis of Cryptococcus neoformans.</a> J Vis Exp. (94), (2014).</li><li>Neumann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+alterations+in+human+blood-derived+neutrophils+lead+to+formation+of+neutrophil+extracellular+traps.">Lipid alterations in human blood-derived neutrophils lead to formation of neutrophil extracellular traps.</a> Eur J Cell Biol. 93 (8-9), 347-354 (2014).</li><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>von K&#246;ckritz-Blickwede, M., Nizet, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immunity+turned+inside-out:+antimicrobial+defense+by+phagocyte+extracellular+traps.">Innate immunity turned inside-out: antimicrobial defense by phagocyte extracellular traps.</a> J Mol Med. 87 (8), 775-783 (2009).</li><li>Fuchs, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+cell+death+program+leads+to+neutrophil+extracellular+traps.">Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps.</a> J. Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).</li><li>Lauth, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M1+Protein+Allows+Group+A+Streptococcal+Survival+in+Phagocyte+Extracellular+Traps+through+Cathelicidin+Inhibition.">M1 Protein Allows Group A Streptococcal Survival in Phagocyte Extracellular Traps through Cathelicidin Inhibition.</a> J Innate Immun. 1 (3), 202-214 (2009).</li><li>Chow, O. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statins+Enhance+Formation+of+Phagocyte+Extracellular+Traps.">Statins Enhance Formation of Phagocyte Extracellular Traps.</a> Cell Host Microbe. 8 (5), 445-454 (2010).</li><li>Simons, K., Vaz, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+systems,+lipid+rafts,+and+cell+membranes.">Model systems, lipid rafts, and cell membranes.</a> Annu Rev Biophys Biomol Struct. 33, 269-295 (2004).</li><li>Bligh, E. G., Dyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+of+total+lipid+extraction+and+purification.">A rapid method of total lipid extraction and purification.</a> Can J Biochem Physiol. 37, 911-917 (1959).</li><li>Brogden, G., Propsting, M., Adamek, M., Naim, H. Y., Steinhagen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+analysis+of+membrane+lipids+and+lipid+rafts+in+common+carp+(Cyprinus+carpio+L).">Isolation and analysis of membrane lipids and lipid rafts in common carp (Cyprinus carpio L).</a> Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 169, 9-15 (2014).</li><li>Saldanha, T., Sawaya, A. C., Eberlin, M. N., Bragagnolo, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HPLC+separation+and+determination+of+12+cholesterol+oxidation+products+in+fish:+comparative+study+of+RI,+UV,+and+APCI-MS+detectors.">HPLC separation and determination of 12 cholesterol oxidation products in fish: comparative study of RI, UV, and APCI-MS detectors.</a> J Agric Food Chem. 54 (12), 4107-4113 (2006).</li><li>Hubicka, U., Krzek, J., Woltynska, H., Stachacz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+identification+and+quantitative+determination+of+selected+aminoglycoside+antibiotics+by+thin-layer+chromatography+and+densitometry.">Simultaneous identification and quantitative determination of selected aminoglycoside antibiotics by thin-layer chromatography and densitometry.</a> J AOAC Int. 92 (4), 1068-1075 (2009).</li><li>Maalouf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+lipid+composition+in+Fabry+disease+leads+to+an+intracellular+block+of+the+detergent-resistant+membrane-associated+dipeptidyl+peptidase+IV.">A modified lipid composition in Fabry disease leads to an intracellular block of the detergent-resistant membrane-associated dipeptidyl peptidase IV.</a> J Inherit Metab Dis. 33 (4), 445-449 (2010).</li><li>Correia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+pylori's+cholesterol+uptake+impacts+resistance+to+docosahexaenoic+acid.">Helicobacter pylori's cholesterol uptake impacts resistance to docosahexaenoic acid.</a> Int J Med Microbiol. 304 (3-4), 314-320 (2014).</li><li>Gorudko, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lectin-induced+activation+of+plasma+membrane+NADPH+oxidase+in+cholesterol-depleted+human+neutrophils.">Lectin-induced activation of plasma membrane NADPH oxidase in cholesterol-depleted human neutrophils.</a> Arch Biochem Biophys. 516 (2), 173-181 (2011).</li><li>Masoud, R., Bizouarn, T., Hou&#233;e-Levin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol:+A+modulator+of+the+phagocyte+NADPH+oxidase+activity+-+A+cell-free+study.">Cholesterol: A modulator of the phagocyte NADPH oxidase activity - A cell-free study.</a> Redox Biol. 3, 16-24 (2014).</li><li>Knight, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptidylarginine+deiminase+inhibition+is+immunomodulatory+and+vasculoprotective+in+murine+lupus.">Peptidylarginine deiminase inhibition is immunomodulatory and vasculoprotective in murine lupus.</a> J Clin Invest. 123 (7), 2981-2993 (2013).</li><li>Reichel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harbour+seal+(Phoca+vitulina)+PMN+and+monocytes+release+extracellular+traps+to+capture+the+apicomplexan+parasite+Toxoplasma+gondii.">Harbour seal (Phoca vitulina) PMN and monocytes release extracellular traps to capture the apicomplexan parasite Toxoplasma gondii.</a> Dev Comp Immunol. 50 (2), 106-115 (2015).</li><li>Chuammitri, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chicken+heterophil+extracellular+traps+(HETs):+novel+defense+mechanism+of+chicken+heterophils.">Chicken heterophil extracellular traps (HETs): novel defense mechanism of chicken heterophils.</a> Vet Immunol Immunopathol. 129, 126-131 (2009).</li><li>Palic, D., Ostojic, J., Andreasen, C. B., Roth, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fish+cast+NETs:+Neutrophil+extracellular+traps+are+released+from+fish+neutrophils.">Fish cast NETs: Neutrophil extracellular traps are released from fish neutrophils.</a> Dev Comp Immunol. 31 (8), 805-816 (2007).</li><li>Ng, T. H., Chang, S. H., Wu, M. H., Wang, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shrimp+hemocytes+release+extracellular+traps+that+kill+bacteria.">Shrimp hemocytes release extracellular traps that kill bacteria.</a> Dev Comp Immunol. 41 (4), 644-651 (2013).</li><li>Hawes, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+DNA:+the+tip+of+root+defenses?.">Extracellular DNA: the tip of root defenses?.</a> Plant Sci. 180 (6), 741-745 (2011).</li><li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps:+is+immunity+the+second+function+of+chromatin?.">Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin?.</a> J Cell Biol. 198 (5), 773-783 (2012).</li><li>Xu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+raft-associated+&#946;-adducin+is+required+for+PSGL-1-mediated+neutrophil+rolling+on+P-selectin.">Lipid raft-associated &#946;-adducin is required for PSGL-1-mediated neutrophil rolling on P-selectin.</a> J Leukoc Biol. 97 (2), 297-306 (2015).</li><li>Ermert, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+neutrophil+extracellular+traps+in+microbial+infections.">Mouse neutrophil extracellular traps in microbial infections.</a> J Innate Immun. 1 (3), 181-193 (2009).</li><li>Metzler, K. D., Goosmann, C., Lubojemska, A., Zychlinsky, A., Papayannopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+myeloperoxidase-containing+complex+regulates+neutrophil+elastase+release+and+actin+dynamics+during+NETosis.">A myeloperoxidase-containing complex regulates neutrophil elastase release and actin dynamics during NETosis.</a> Cell Rep. 8 (3), 883-896 (2014).</li><li>McGee, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+enhances+Helicobacter+pylori+resistance+to+antibiotics+and+LL-37.">Cholesterol enhances Helicobacter pylori resistance to antibiotics and LL-37.</a> Antimicrob Agents Chemother. 55 (6), 2897-2904 (2011).</li></ol>

De hier beschreven werkwijzen kunnen worden gebruikt om specifieke lipiden, zoals cholesterol, door HPTLC of HPLC analyseren en de effecten van farmacologische Lipidenveranderingen op de vorming van NET onderzoeken (zie Neumann et al. 15). HPTLC is een relatief kosteneffectief en eenvoudige methode om een ​​groot aantal lipiden analyseren van een groot aantal monsters. Deze werkwijze is gebruikt in vele onderzoeksgebieden, waaronder antibiotica kwantifice...

<html> Lipiden is aangetoond dat ze een belangrijke rol spelen in cel homeostase, celdood, gastheer-pathogeen interacties, en cytokine release 1. Na verloop van tijd, belangstelling voor en kennis over de impact van lipiden in gastheer-pathogeen interacties of ontsteking zijn toegenomen, en verschillende publicaties bevestigen de centrale rol van bepaalde lipiden, in het bijzonder de steroïde cholesterol, in cellulaire reacties. Farmacologische behandeling met statinen, die als remmers van cholesterol-biosynthese worden door blokkeren van 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzym-A-reductase (HMG-CoA-reductase), kan fungeren als anti-inflammatoire middelen door verlaging van de serumspiegels van interleukine 6 en C-reactief proteïne 2. Cholesterol en glycosphingolipide verrijkte structuren kan worden gebruikt door verschillende pathogenen, zoals bacteriën en virussen, als toegangspoort tot de host 3, 4, 5,class = &quot;xref&quot;&gt; 6. Sfingolipiden (zoals sfingomyeline) bleken te gebruiken door ziekteverwekkers hun pathogeniciteit 7 bevorderen. In macrofagen, mycobacteriën gebruik cholesterol-verrijkte domeinen cellen binnendringt; een uitputting van cholesterol remt mycobacteriële opname 8. Bovendien infectie van macrofagen met Francisella tularensis, een zooenoseverwekker belast tularemie (ook bekend als konijn koorts) 9, geleid tot een infectie die werd afgeschaft toen cholesterol werd ontdaan van de membranen 10. Ook de invasie van gastheercellen door Escherichia coli via lipide-rijke structuren werd aangetoond dat cholesterol-afhankelijke 4 zijn. Bovendien Salmonella typhimurium besmettingsexperimenten epitheelcellen aangetoond dat cholesterol essentieel pathogeen binnenkomst in de cellen 11. Cholesterol uitputting inhibited de opname van Salmonella 11. Bovendien, een recente studie van Gilk et al. aangetoond dat cholesterol een belangrijke rol bij de opname van Coxiella burnetii 12 speelt. Bovendien Tuong et al. bleek dat 25-hydroxycholesterol een cruciale rol in fagocytose door lipopolysaccharide (LPS) speelt gestimuleerde macrofagen 13. Fagocytose werd verminderd wanneer macrofagen farmacologisch werden getrakteerd op cholesterol 14 afbreken. Zo, cholesterol en andere lipiden lijken een belangrijke rol bij infecties en ontstekingen te spelen, omdat hun uitputting het risico op invasie van een aantal ziekteverwekkers 10, 11, 12 kan verminderen. Onlangs waren we in staat om aan te tonen dat Lipidenveranderingen, in het bijzonder de uitputting van cholesterol uit de cel, induceren de vorming van neutrofielen extracellular vallen (NET) in menselijk bloed afgeleide neutrofielen 15. Sinds de ontdekking van NET in 2004, hebben ze aangetoond dat cruciale rol spelen in bacteriële beknelling, en dus belemmeren de verspreiding van de infectie 16, 17. NET bestaan uit een DNA skelet geassocieerd met histonen, proteasen en antimicrobiële peptiden 16. De afgifte van het NET door neutrofielen kan worden geïnduceerd door binnendringende ziekteverwekkers 18, 19 en chemicaliën zoals forbol myristaat acetaat (PMA) of statines 16, 20. Echter, de gedetailleerde cellulaire mechanismen, en in het bijzonder de rol van lipiden in dit proces, zijn nog steeds niet helemaal duidelijk. De analyse van de lipiden kan leiden tot een beter begrip van de betrokken in een breed scala van cellulaire processen en interacties, zoals de vrijlating van de netten mechanismen. CholesteRol en sfingomyeline zijn vitale bestanddelen van het celmembraan en lipide microdomeinen, waar stabiliteit toe te voegen en het clusteren van de bij eiwittransport en signaleringsgebeurtenissen 21 eiwitten bevorderen. De mechanistische rol van bepaalde lipiden, amfifiele farmacologische middelen, zoals de cyclische oligosaccharide methyl-β-cyclodextrine (MβCD) onderzoeken kunnen worden toegepast om de lipidesamenstelling van een cel veranderen en cholesterol in vitro 15 verminderen. Hier presenteren we een methode om HPTLC gebruiken om de lipide samenstelling van neutrofielen te analyseren in reactie op MβCD. HPLC werd gebruikt om het niveau van cholesterol in de neutrofielen bevolking te bevestigen. Verder beschrijven we een werkwijze voor de vorming van NET door immuunfluorescentiemicroscopie in menselijk bloed afgeleide visualiseren neutrofielen als reactie op MβCD.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Neutrophil isolation, NET staining and quantification</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Flour 633 goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MPO&#945; antibody</td>
			<td>Dako</td>
			<td>A0398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3912-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marienfeld-Neubauer improved counting chamber</td>
			<td>Celeromics</td>
			<td>MF-0640010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope TCS SP5 AOBS with tandem scanner</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMI6000CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#180;s PBS 10X</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5493-1L</td>
			<td>Dilute 1:10 in water for 1X working solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dy Light 488 conjugated highly cross-absorbed</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA/Histone 1 antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB3864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>NIH</td>
			<td>1.8</td>
			<td>http://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>VWR</td>
			<td>630-1554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-&#946;-cyclodextrin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4555-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>0335.3</td>
			<td>dissolve in water, heat up to 65 &#176;C and add 1N NaOH to clear solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8139-1MG</td>
			<td>Stock 16 &#181;M, dissolved in 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymorphprep</td>
			<td>AXIS-SHIELD</td>
			<td>AN1114683</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold antifade reagent with DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P7481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P7581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI1640</td>
			<td>PAA</td>
			<td>E 15-848</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS with CaCl and Mg</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H6648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787-50ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypanblue</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15250-061</td>
			<td>0.4% solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3255.1</td>
			<td>endotoxin-free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number&#160;</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipid isolation and analysis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-propanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>33538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;l syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>701 NR 10 &#181;l</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl ether</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>346136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl acetate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7336.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Canullla 26G</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4657683</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(II)sulphatepentahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1027805000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7331.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CP ATLAS software</td>
			<td>Lazarsoftware</td>
			<td>2.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromolith HighResolution RP-18 endcapped 100-4.6 mm column</td>
			<td>Merck</td>
			<td>152022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Performance Liquid Chromatograph Chromaster</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>HITA 892-0080-30Y</td>
			<td>Paramaters are dependent on individual HPLC machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC UV Detector</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>5410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Column Oven</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>5310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Auto Sampler</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>5260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Pump</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>5160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7342.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Hexane</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7339.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>49,361,000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potters</td>
			<td>LAT Garbsen</td>
			<td>5 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CN30.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPTLC silica gel 60</td>
			<td>Merck</td>
			<td>105553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacufuge plus basic device</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22820001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar cell culture 48-well plate, flat bottom</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS3548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1198882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>1879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Tuberculin Syringe Only 1 ml</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods to study lipid alterations in neutrophils and the subsequent formation of neutrophil extracellular traps

Lipide-analyse uitgevoerd door hoge prestatie dunnelaagchromatografie (HPTLC) is een relatief eenvoudige, kosteneffectieve werkwijze voor het analyseren van een breed scala aan lipiden. De functie van lipiden (bijvoorbeeld in gastheer-pathogeen interacties of gastheer entry) is gemeld dat zij een cruciale rol in de cellulaire processen. Hier tonen wij een werkwijze voor lipidesamenstelling te bepalen, met een focus op het cholesterolgehalte primaire bloed afgeleide neutrofielen door HPTLC vergeleken met sterk scheidende vloeistofchromatografie (HPLC). Het doel was om de rol van lipiden / cholesterol veranderingen in de vorming van neutrofielen extracellulaire vallen (NET&#39;s) te onderzoeken. Nettovrijval is bekend als een afweer mechanisme om ziektekiemen te voorkomen verspreiding in de gastheer. Daarom werden bloed-afkomstige humane neutrofielen behandeld met methyl-β-cyclodextrine (MβCD) lipide veranderingen induceren in de cellen. Gebruik HPTLC en HPLC, hebben we aangetoond dat MβCD behandeling van de cellen leidt tot lipideveranderingen geassocieerd met een significante verlaging van het cholesterolgehalte van de cel. Tegelijkertijd, MβCD behandeling van neutrofielen leidde tot de vorming van NET, zoals getoond door immunofluorescentie microscopie. Kortom, hier presenteren we een gedetailleerde methode om lipide veranderingen in neutrofielen en de vorming van de netten te bestuderen.

Humaan bloed afgeleide neutrofielen werden geïsoleerd door dichtheidsgradiënt centrifugatie (figuur 2). Om het effect van Lipidenveranderingen op neutrofielen te onderzoeken, werden de cellen behandeld met 10 mM MβCD die cholesterol put uit de cel. Vervolgens werden de lipiden geïsoleerd uit monsters van Bligh en Dyer (figuur 1, linker paneel), zoals beschreven door Brogden et al. 23. De bereide lipide monsters werden...

Watch this Scientific Journal Video about Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps at JoVE.com

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

Lipiden is bekend dat ze een belangrijke rol in cellulaire functies spelen. We beschrijven een werkwijze om de lipidesamenstelling van neutrofielen te bepalen, met de nadruk op het cholesterolgehalte, door zowel HPTLC en HPLC aan een beter begrip van de onderliggende mechanismen van neutrofielen extracellulaire val vorming krijgen.

Methoden om te studeren Lipidenveranderingen in neutrofielen en de daaropvolgende vorming van neutrofielen Extracellulaire Traps

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

Neutrofielen Extracellulaire Traps: Hoe te genereren en te visualiseren

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps NETs Isolation and Handling

Vereenvoudigde Human Neutrophil Extracellular traps (NET) Isolatie en Handling

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role ...

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High Throughput Meting van extracellulaire DNA los en Kwantitatieve NET Formation in menselijke neutrofielen<em&gt; In Vitro</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In Vitro Canine neutrofiele extracellulaire Trap vorming: Dynamische en kwantitatieve analyse door fluorescentie microscopie

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...

Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT

Geautomatiseerde kwantificering van neutrofiele extracellulaire traps met behulp van NETQUANT

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. ...

A High-throughput Assay to Assess and Quantify Neutrophil Extracellular Trap Formation

Een High-throughput Assay voor het beoordelen en kwantificeren van neutrofiele extracellulaire Trap vorming

Neutrophil extracellular traps (NETs) are immunogenic extracellular DNA structures that can be released by neutrophils upon a wide variety of triggers. ...

Identification of Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescence Microscopy

Identificatie van Neutrophil Extracellular Traps in Paraffine-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescentie Microscopie

Neutrophil extracellular traps (NETs), composed of cell-free DNA (cfDNA) and proteins like histones and neutrophil elastase (NE), are released by ...

Morphological and Compositional Analysis of Neutrophil Extracellular Traps Induced by Microbial and Chemical Stimuli

Morfologische en compositorische analyse van neutrofiele extracellulaire vallen geïnduceerd door microbiële en chemische stimuli

Neutrophils function as the first line of cellular defense in an innate immune response by employing diverse mechanisms, such as the formation of ...

Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA

Kwantificeren van myeloperoxidase-DNA en neutrofiele elastase-DNA-complexen van neutrofiele extracellulaire vallen met behulp van een gemodificeerde sandwich-ELISA

Certain stimuli, such as microorganisms, cause neutrophils to release neutrophil extracellular traps (NETs), which are basically web-like structures ...

Staining and Imaging to Visualize Neutrophil Extracellular Traps

Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues

Neutrophil Extracellular Traps Imaging in Human and Mouse Tissues (Video) | JoVE

Immunofluorescentiebeeldvorming van neutrofiele extracellulaire vallen in menselijke en muizenweefsels

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in ...