Name: methods to study lipid alterations in neutrophils and the subsequent formation of neutrophil extracellular traps
Uploaded: 2017-03-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der Akademie für Tiergesundheit (HbH) und ein Stipendiums aus dem PhD-Programm „Tiere und Zoonosen“ der Universität für Veterinärmedizin, Hannover, Deutschland, zur Verfügung gestellt zu Ariane Neumann unterstützt.

Die Sammlung des peripheren Blutes in diesem Protokoll wurde von der lokalen Menschenforschungsethikkommission genehmigt. Alle menschlichen Probanden, wenn ihr eine schriftliche Einverständniserklärung. 1. Isolierung von humanen blutabgeleiteten Neutrophilen durch Dichtegradientenzentrifugation <ol><li> Isolierung von menschlichem Blut abgeleitetes Neutrophile <ol><li> Schicht ~ 20 ml Blut auf 20 ml Natriumdiatrizoat / Dextran-Lösung in der Nähe einer Flamme und ohne s...

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	<li>Riethmuller, J., Riehle, A., Grassme, H., Gulbins, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+rafts+in+host-pathogen+interactions.">Membrane rafts in host-pathogen interactions.</a> Biochim Biophys Acta. 1758 (12), 2139-2147 (2006).</li><li>Shahbazian, H., Atrian, A., Yazdanpanah, L., Lashkarara, G. 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Die hier beschriebenen Methoden können verwendet werden , um bestimmte Lipide zu analysieren, wie Cholesterin, durch HPTLC oder HPLC und die Auswirkungen der pharmakologischen Lipidveränderungen auf der Bildung von NETs zu untersuchen (siehe Neumann et al. 15). HPTLC ist eine relativ kostengünstige und einfache Methode, ein breites Spektrum von Lipiden in einer großen Anzahl von Proben zu analysieren. Dieses Verfahren wurde in vielen Forschungsgebieten, e...

<html> Lipids wurden 1 eine wichtige Rolle in Zellhomöostase, Zelltod, Wirt-Pathogen - Interaktionen und Zytokin - Freisetzung gezeigt spielen. Im Laufe der Zeit das Interesse für und das Wissen über die Auswirkungen von Lipiden in der Wirt-Pathogen-Interaktionen oder Entzündung haben zugenommen, und mehrere Publikationen bestätigen die zentrale Rolle bestimmter Lipide, vor allem das Steroid Cholesterin, in zellulären Antworten. Pharmakologische Behandlung mit Statinen, die durch die Blockierung 3-Hydroxy-3-methylglutaryl-Coenzym-A-Reduktase (HMG-CoA-Reduktase) als Inhibitoren der Cholesterin-Biosynthese verwendet werden, können als entzündungshemmende Mittel wirken, indem sie die Serumspiegel von Interleukin Senkung 6 und C-reaktives Protein 2. Cholesterin- und Glycosphingolipid angereicherten Strukturen können durch verschiedene Pathogene, wie Bakterien und Viren verwendet werden, als Gateway in das Wirts 3, 4, 5,class = &quot;xref&quot;&gt; 6. Sphingolipide (zB Sphingomyelin) wurde von Pathogenen verwendet gezeigt werden , um ihre Pathogenität 7 zu fördern. In Makrophagen, Mykobakterien Verwendung Domänen-Cholesterin angereicherten Zellen für die Eingabe; ein Abbau von Cholesterin hemmt Mykobakterien - Aufnahme 8. Weiterhin Infektion von Makrophagen mit Francisella tularensis, einem Zoonoseerregers verantwortlich für Tularämie (auch als Kaninchen Fieber bekannt) 9, führte zu einer Infektion , die aufgehoben wurde , wenn Cholesterin aus den Membranen 10 aufgebraucht wurde. In ähnlicher Weise wurde die Invasion von Wirtszellen durch Escherichia coli über lipidreichen Strukturen demonstriert Cholesterin-abhängige 4 sein. Darüber hinaus zeigten S. typhimurium Infektionsversuche von Epithelzellen , dass Cholesterin für Erreger Eintritt in die Zellen 11 wesentlich ist. Cholesterin Verarmungs inhibited die Aufnahme von Salmonella - 11. Ferner ist eine aktuelle Studie von Gilk et al. gezeigt , dass Cholesterin 12 eine wichtige Rolle bei der Aufnahme von Coxiella burnetii spielt. Zusätzlich Tuong et al. festgestellt , dass 25-hydroxycholesterol spielt stimulierte eine entscheidende Rolle bei der Phagozytose durch Lipopolysaccharide (LPS) Makrophagen 13. Phagozytose reduziert wurde , wenn pharmakologisch Makrophagen Cholesterin 14 verarmen behandelt wurden. So Cholesterin und andere Lipide scheinen eine wichtige Rolle bei Infektionen und Entzündungen zu spielen, da ihre Erschöpfung des Risiko einer Invasion von mehreren Erregern 10, 11 zu reduzieren, 12. Vor kurzem konnten wir feststellen, dass Lipid-Veränderungen zeigen, vor allem den Abbau von Cholesterin aus der Zelle, induziert die Bildung von neutrophilen Extrazellulärr Fallen (NETS) in menschlichem Blut abgeleitetes Neutrophile 15. Seit der Entdeckung von NETs im Jahr 2004 wurde sie gezeigt entscheidende Rolle bei der bakteriellen Einschluss zu spielen und damit in behindern die Ausbreitung der Infektion 16, 17. NETs besteht aus einem DNA - Rückgrat mit Histonen, Proteasen assoziiert und antimikrobielle Peptide 16. Die Freisetzung des NETs durch Neutrophile durch eindringende Krankheitserreger 18, 19 und chemische Substanzen wie Phorbol-Myristat-Acetat (PMA) oder Statine 16, 20 induziert werden. Allerdings sind die detaillierten zellulären Mechanismen, und vor allem die Rolle von Lipiden in diesem Verfahren sind noch nicht ganz klar. Die Analyse von Lipiden kann in einer Vielzahl von zellulären Prozessen und Interaktionen, wie zB die Freisetzung von NETs beteiligt zu einem besseren Verständnis der Mechanismen führen. Cholesterol und Sphingomyelin sind wichtige Bestandteile der Zellmembran und Lipid - Mikrodomänen, in denen sie die Stabilität hinzuzufügen und die Clusterbildung der in den Proteintransport und Signalereignisse 21 beteiligten Proteine zu erleichtern. Um die mechanistische Rolle bestimmter Lipiden, amphiphilen pharmakologischer Mittel, wie die cyclische Oligosaccharid Methyl-β-Cyclodextrin (MßCD) zu untersuchen , kann verwendet werden , um die Lipidzusammensetzung einer Zelle zu verändern , und zur Verringerung von Cholesterin in vitro 15. Hier präsentieren wir eine Methode HPTLC zu verwenden, um die Lipidzusammensetzung von Neutrophilen in Reaktion auf MßCD zu analysieren. HPLC wurde verwendet, um das Niveau des Cholesterins in der neutrophilen Population zu bestätigen. Weiterhin beschreiben wir ein Verfahren, um die Bildung von NETs durch Immunofluoreszenz-Mikroskopie in menschlichem Blut abgeleiteten Neutrophilen als Reaktion auf MßCD sichtbar zu machen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Neutrophil isolation, NET staining and quantification</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Flour 633 goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MPO&#945; antibody</td>
			<td>Dako</td>
			<td>A0398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3912-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marienfeld-Neubauer improved counting chamber</td>
			<td>Celeromics</td>
			<td>MF-0640010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope TCS SP5 AOBS with tandem scanner</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMI6000CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#180;s PBS 10X</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5493-1L</td>
			<td>Dilute 1:10 in water for 1X working solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dy Light 488 conjugated highly cross-absorbed</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA/Histone 1 antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB3864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>NIH</td>
			<td>1.8</td>
			<td>http://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>VWR</td>
			<td>630-1554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-&#946;-cyclodextrin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4555-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>0335.3</td>
			<td>dissolve in water, heat up to 65 &#176;C and add 1N NaOH to clear solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8139-1MG</td>
			<td>Stock 16 &#181;M, dissolved in 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymorphprep</td>
			<td>AXIS-SHIELD</td>
			<td>AN1114683</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold antifade reagent with DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P7481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P7581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI1640</td>
			<td>PAA</td>
			<td>E 15-848</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS with CaCl and Mg</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H6648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787-50ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypanblue</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15250-061</td>
			<td>0.4% solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3255.1</td>
			<td>endotoxin-free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number&#160;</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipid isolation and analysis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-propanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>33538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;l syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>701 NR 10 &#181;l</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl ether</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>346136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl acetate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7336.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Canullla 26G</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4657683</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(II)sulphatepentahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1027805000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7331.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CP ATLAS software</td>
			<td>Lazarsoftware</td>
			<td>2.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromolith HighResolution RP-18 endcapped 100-4.6 mm column</td>
			<td>Merck</td>
			<td>152022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Performance Liquid Chromatograph Chromaster</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>HITA 892-0080-30Y</td>
			<td>Paramaters are dependent on individual HPLC machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC UV Detector</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>5410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Column Oven</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>5310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Auto Sampler</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>5260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Pump</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>5160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7342.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Hexane</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7339.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>49,361,000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potters</td>
			<td>LAT Garbsen</td>
			<td>5 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CN30.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPTLC silica gel 60</td>
			<td>Merck</td>
			<td>105553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacufuge plus basic device</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22820001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar cell culture 48-well plate, flat bottom</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS3548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1198882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>1879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Tuberculin Syringe Only 1 ml</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods to study lipid alterations in neutrophils and the subsequent formation of neutrophil extracellular traps

Lipid-Analyse durch Hochleistungs-Dünnschichtchromatographie durchgeführt (HPTLC) ist ein relativ einfaches, kostengünstiges Verfahren zur Herstellung eine breite Palette von Lipiden analysiert. Die Funktion von Lipiden ( zum Beispiel in der Wirt-Pathogen - Interaktionen oder Host - Eintrag) wurde eine entscheidende Rolle bei zellulären Prozessen spielen gemeldet. Hier zeigen wir ein Verfahren Lipidzusammensetzung, um zu bestimmen, mit dem Fokus auf dem Cholesterinspiegel des primären Blut abgeleiteten Neutrophilen, durch HPTLC im Vergleich zur Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC). Ziel war es, die Rolle der Lipid / Cholesterin Veränderungen bei der Bildung von Neutrophilen extrazellulären Fallen (NETs) zu untersuchen. NET-Release wird als Abwehrmechanismus bekannt Erreger zu verhindern innerhalb des Host-Ausbreitung. Daher Blut gewonnenen humanen Neutrophilen wurden mit Methyl-β-cyclodextrin (MßCD) behandelt, um Lipidveränderungen in den Zellen zu induzieren. Mit HPTLC und HPLC haben wir gezeigt, dass MßCD Behandlung der Zellen zu Lipid führtmit einer signifikanten Verringerung des Cholesteringehalt der Zelle verbunden sind Veränderungen. Zur gleichen Zeit, MßCD Behandlung der Neutrophilen führte zur Bildung von NETs, ​​wie durch Immunfluoreszenzmikroskopie gezeigt. Zusammenfassend hier präsentieren wir eine detaillierte Methode Lipid Veränderungen in Neutrophilen und die Bildung von NETs zu studieren.

Humanblut abgeleitetes Neutrophile wurden durch Dichtegradientenzentrifugation (Abbildung 2) isoliert. Um die Wirkung von Lipid-Veränderungen auf Neutrophilen zu untersuchen, wurden die Zellen mit 10 mM MßCD behandelt, der Cholesterin aus der Zelle verarmt. Anschließend wurden die Lipide aus den Proben von Bligh und Dyer (1, linkes Feld) isoliert, wie von Brogden et al. 23. Die hergestellten Lipidproben wurden auf Kies...

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Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

Lipids sind dafür bekannt, eine wichtige Rolle bei der zellulären Funktionen spielen. Hier beschreiben wir eine Methode, um die Lipidzusammensetzung von Neutrophilen, um zu bestimmen, wobei der Schwerpunkt auf dem Cholesterinspiegel, sowohl durch HPTLC und HPLC mit einem besseren Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen der neutrophilen extrazellulären Falle Bildung zu gewinnen.

Methoden Lipidveränderungen in Neutrophilen und die anschließende Bildung von Neutrophilen Extracellular Traps zu studieren

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

Neutrophil Extracellular Traps: So erzeugen und zu visualisieren

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps NETs Isolation and Handling

Vereinfachte Menschen Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolierung und Handhabung

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role ...

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

Hoher Durchsatz Messung von extrazellulärer DNA Freisetzung und Quantitative NET Ausbildung in Human-Neutrophilen<em&gt; In Vitro</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In-vitro- Eckzahn Neutrophilenzahl extrazelluläre Trap Bildung: Dynamische und Quantitative Analyse von Fluoreszenz-Mikroskopie

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...

Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT

Automatisierte bildbasierte Quantifizierung von neutrophilen extrazellulären Fallen mit NETQUANT

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. ...

A High-throughput Assay to Assess and Quantify Neutrophil Extracellular Trap Formation

Ein High-Throughput-Assay zu beurteilen und zu quantifizieren Neutrophilenzahl extrazelluläre Trap Bildung

Neutrophil extracellular traps (NETs) are immunogenic extracellular DNA structures that can be released by neutrophils upon a wide variety of triggers. ...

Identification of Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescence Microscopy

Identifizierung von Neutrophilen extrazellulären Fallen in Paraffin-Embedded Feline Arteriellen Thrombi mittels Immunfluoreszenzmikroskopie

Neutrophil extracellular traps (NETs), composed of cell-free DNA (cfDNA) and proteins like histones and neutrophil elastase (NE), are released by ...

Morphological and Compositional Analysis of Neutrophil Extracellular Traps Induced by Microbial and Chemical Stimuli

Morphologische und kompositorische Analyse von neutrophilen extrazellulären Fallen, die durch mikrobielle und chemische Reize induziert werden

Neutrophils function as the first line of cellular defense in an innate immune response by employing diverse mechanisms, such as the formation of ...

Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA

Quantifizierung von Myeloperoxidase-DNA- und neutrophilen Elastase-DNA-Komplexen aus extrazellulären Neutrophilenfallen unter Verwendung eines modifizierten Sandwich-ELISA

Certain stimuli, such as microorganisms, cause neutrophils to release neutrophil extracellular traps (NETs), which are basically web-like structures ...

Staining and Imaging to Visualize Neutrophil Extracellular Traps

Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues

Neutrophil Extracellular Traps Imaging in Human and Mouse Tissues (Video) | JoVE

Immunfluoreszenz-Bildgebung von neutrophilen extrazellulären Fallen in menschlichen und Mausgeweben

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in ...