Name: methods to study lipid alterations in neutrophils and the subsequent formation of neutrophil extracellular traps
Uploaded: 2017-03-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps at JoVE.com

この作品は、アカデミーのfürTiergesundheit（AFT）の交わりとアリアンノイマンに与えられる大学獣医学部の、ハノーバー、ドイツの博士課程、「動物と人獣共通感染症」からフェローシップによってサポートされていました。

このプロトコルでは、末梢血の採取は、地域、人間研究倫理委員会によって承認されました。すべての被験者は、彼らの書面によるインフォームドコンセントを提供しました。 密度勾配遠心分離によりヒト血液由来の好中球の単離<ol><li> ヒト血液由来の好中球の単離 <ol><li>層血の〜20mLの火炎近くナトリウムジアトリゾエート/デキストラン溶液20mLへと混合?...

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	<li>Riethmuller, J., Riehle, A., Grassme, H., Gulbins, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+rafts+in+host-pathogen+interactions.">Membrane rafts in host-pathogen interactions.</a> Biochim Biophys Acta. 1758 (12), 2139-2147 (2006).</li><li>Shahbazian, H., Atrian, A., Yazdanpanah, L., Lashkarara, G. 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V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lectin-induced+activation+of+plasma+membrane+NADPH+oxidase+in+cholesterol-depleted+human+neutrophils.">Lectin-induced activation of plasma membrane NADPH oxidase in cholesterol-depleted human neutrophils.</a> Arch Biochem Biophys. 516 (2), 173-181 (2011).</li><li>Masoud, R., Bizouarn, T., Hou&#233;e-Levin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol:+A+modulator+of+the+phagocyte+NADPH+oxidase+activity+-+A+cell-free+study.">Cholesterol: A modulator of the phagocyte NADPH oxidase activity - A cell-free study.</a> Redox Biol. 3, 16-24 (2014).</li><li>Knight, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptidylarginine+deiminase+inhibition+is+immunomodulatory+and+vasculoprotective+in+murine+lupus.">Peptidylarginine deiminase inhibition is immunomodulatory and vasculoprotective in murine lupus.</a> J Clin Invest. 123 (7), 2981-2993 (2013).</li><li>Reichel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harbour+seal+(Phoca+vitulina)+PMN+and+monocytes+release+extracellular+traps+to+capture+the+apicomplexan+parasite+Toxoplasma+gondii.">Harbour seal (Phoca vitulina) PMN and monocytes release extracellular traps to capture the apicomplexan parasite Toxoplasma gondii.</a> Dev Comp Immunol. 50 (2), 106-115 (2015).</li><li>Chuammitri, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chicken+heterophil+extracellular+traps+(HETs):+novel+defense+mechanism+of+chicken+heterophils.">Chicken heterophil extracellular traps (HETs): novel defense mechanism of chicken heterophils.</a> Vet Immunol Immunopathol. 129, 126-131 (2009).</li><li>Palic, D., Ostojic, J., Andreasen, C. 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ここで説明する方法は、HPTLCによってコレステロール、又はHPLCのような特定の脂質を分析すると（ノイマンら15参照 ）のNETの形成に対する薬理脂質変化の効果を調べるために使用することができます。 HPTLCは、多数のサンプル中の脂質の広い範囲を分析するため、比較的費用効果がありかつ簡単な方法です。この方法は、上皮細胞における抗生?...

<html>脂質は、細胞の恒常性、細胞死、宿主-病原体相互作用、およびサイトカイン放出1に重要な役割を果たしていることが示されています。時間が経つにつれて、細胞応答では、特に、ステロイドコレステロールを宿主 - 病原体相互作用または炎症中の脂質の影響に関するについて関心と知識が増加している、といくつかの出版物は、特定の脂質の中心的役割を確認します。 3-ヒドロキシ-3-メチル - 補酵素-Aレダクターゼ（HMG-CoAの還元）を遮断することによってコレステロール生合成の阻害剤として使用されるスタチン、と薬理学的治療は、インターロイキンの血清レベルを低下させることによって抗炎症剤として作用することができます6およびC反応性タンパク質2。コレステロール及びスフィンゴ糖脂質に富む構造は、ホスト3、4、5へのゲートウェイとして、そのような細菌やウイルスなどのいくつかの病原体で使用することができますクラス= &quot;外部参照&quot;&gt; 6。スフィンゴ脂質（ 例えば、スフィンゴミエリン）は、その病原7を促進するために病原体によって使用されることが示されています。細胞を入力するためのマクロファージにおける、マイコバクテリアの使用コレステロールに富むドメイン。コレステロールの枯渇は、マイコバクテリアの取り込み8を阻害します。さらに、（また、ウサギ熱としても知られる）、 野兎病菌、野兎病の原因で人畜共通感染剤9とマクロファージの感染は、コレステロールは、膜10から除去されたときに廃止された感染症につながりました。同様に、脂質リッチ構造を介して大腸菌による宿主細胞の浸潤は、コレステロール依存4であることが実証されました。また、上皮細胞のネズミチフス菌感染実験は、コレステロールを細胞11への病原体の進入のために必須であることを実証しました。コレステロール枯渇inhibiteサルモネラ11のD摂取。さらに、Gilk らによる最近の研究。コレステロールはコクシエラのburnetti 12の取り込みに重要な役割を果たしていることを実証しました。また、トゥオンら 。 25-ヒドロキシコレステロールは、リポ多糖（LPS）による食作用において重要な役割を果たしていることが見出されたマクロファージを刺激さ13。マクロファージは、薬理学的コレステロール14を枯渇させる処理した場合、食作用が低下しました。したがって、コレステロールおよび他の脂質は、彼らの枯渇は、いくつかの病原体10、11、12からの侵入の危険性を減らすことができるため、感染症や炎症に重要な役割を果たしているようです。 最近、我々は脂質の変化、細胞からのコレステロールの特に枯渇は、好中球extracellulaの形成を誘導することを示すことができましたヒト血液由来の好中球15のRトラップ（のNET）。 2004年のNETの発見以来、彼らは細菌の取り込みに重要な役割を果たしていることが示され、これにより感染16、17の広がりを妨げるでてきました。ネットは、ヒストン、プロテアーゼ、及び抗菌ペプチド16に関連付けられているDNA骨格から成ります。好中球によるのNETの放出は、病原体18,19及びホルボールミリステートアセテート（PMA）またはスタチン16、20などの化学物質の侵入によって誘導することができます。しかし、詳細な細胞メカニズム、特にこの過程における脂質の役割は、まだ完全には明らかではありません。脂質の分析は、このようなのNETのリリースなどの細胞プロセスとの相互作用の多種多様に関与するメカニズムのより良い理解につながることができます。 CholesteROLとスフィンゴミエリンは、彼らが、安定性を追加し、タンパク質輸送およびイベント21のシグナル伝達に関与するタンパク質のクラスタリングを促進する細胞膜と脂質マイクロドメインの重要な構成要素です。このような環状オリゴ糖のメチルβシクロデキストリン（MβCD）などの特定の脂質、両親媒性の薬剤、の機構的役割を調べるために、細胞の脂質組成を変化させるためにインビトロ 15 中のコレステロールを減少させるために使用することができます。ここでは、MβCDに応じて、好中球の脂質組成を分析するためにHPTLCを使用する方法を提示します。 HPLCは、好中球集団でのコレステロールのレベルを確認するために使用されました。さらに、我々は、MβCDに応答してヒト血液由来の好中球に免疫蛍光顕微鏡によってのNETの形成を視覚化する方法を記載します。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Neutrophil isolation, NET staining and quantification</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Flour 633 goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-21070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MPO&#945; antibody</td>
			<td>Dako</td>
			<td>A0398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3912-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marienfeld-Neubauer improved counting chamber</td>
			<td>Celeromics</td>
			<td>MF-0640010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope TCS SP5 AOBS with tandem scanner</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMI6000CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#180;s PBS 10X</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5493-1L</td>
			<td>Dilute 1:10 in water for 1X working solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dy Light 488 conjugated highly cross-absorbed</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA/Histone 1 antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB3864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>NIH</td>
			<td>1.8</td>
			<td>http://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>VWR</td>
			<td>630-1554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-&#946;-cyclodextrin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4555-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>0335.3</td>
			<td>dissolve in water, heat up to 65 &#176;C and add 1N NaOH to clear solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8139-1MG</td>
			<td>Stock 16 &#181;M, dissolved in 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymorphprep</td>
			<td>AXIS-SHIELD</td>
			<td>AN1114683</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold antifade reagent with DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P7481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P7581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI1640</td>
			<td>PAA</td>
			<td>E 15-848</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS with CaCl and Mg</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H6648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787-50ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypanblue</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15250-061</td>
			<td>0.4% solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3255.1</td>
			<td>endotoxin-free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number&#160;</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipid isolation and analysis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-propanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>33538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;l syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>701 NR 10 &#181;l</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl ether</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>346136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl acetate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7336.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Canullla 26G</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4657683</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(II)sulphatepentahydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1027805000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7331.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CP ATLAS software</td>
			<td>Lazarsoftware</td>
			<td>2.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromolith HighResolution RP-18 endcapped 100-4.6 mm column</td>
			<td>Merck</td>
			<td>152022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Performance Liquid Chromatograph Chromaster</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>HITA 892-0080-30Y</td>
			<td>Paramaters are dependent on individual HPLC machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC UV Detector</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>5410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Column Oven</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>5310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Auto Sampler</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>5260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Pump</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>5160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7342.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Hexane</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7339.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>49,361,000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potters</td>
			<td>LAT Garbsen</td>
			<td>5 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CN30.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPTLC silica gel 60</td>
			<td>Merck</td>
			<td>105553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacufuge plus basic device</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22820001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar cell culture 48-well plate, flat bottom</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS3548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1198882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>1879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Tuberculin Syringe Only 1 ml</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods to study lipid alterations in neutrophils and the subsequent formation of neutrophil extracellular traps

高性能薄層クロマトグラフィー（HPTLC）によって実行される脂質分析は、脂質の広い範囲を分析する比較的単純な、費用対効果の高い方法です。 （宿主-病原体相互作用またはホストエントリで、例えば ）脂質の機能は、細胞プロセスに重要な役割を果たしていることが報告されています。ここで、我々は、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）と比較してHPTLCによる一次血液由来の好中球のコレステロールレベルを中心とし、脂質組成を決定するための方法を示します。目的は、好中球細胞外トラップ（のNET）の形成における脂質/コレステロールの変化の役割を調査することでした。 NETのリリースは、ホスト内の広がりから病原体を防ぐために、ホストの防御機構として知られています。したがって、血液由来のヒト好中球は、細胞中の脂質変化を誘導するメチルβシクロデキストリン（MβCD）で処理しました。 HPTLC及びHPLCを使用して、我々は、細胞のMβCD処置は脂質につながることが示されています細胞のコレステロール含有量の大幅な削減に関連付けられている変更。免疫蛍光顕微鏡によって示されるように、同時に、好中球のMβCD処置は、ネットの形成につながりました。要約すると、ここでは、脂質の好中球の変化や網の形成を研究するための詳細な方法を提示します。

ヒト血液由来の好中球密度勾配遠心分離（ 図2）によって単離しました。好中球上の脂質変化の効果を調べるために、細胞は、細胞からのコレステロールを枯渇10mMのMβCDで処理しました。ブログデンらによって記載されているように、続いて、脂質は、ブライ-ダイアー（ 図1、左パネル）によって試料から単離しました。 <sup clas...

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Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

脂質は細胞機能に重要な役割を果たしていることが知られています。ここでは、好中球細胞外トラップ形成の基礎となるメカニズムのより良い理解を得るために、HPTLC及びHPLCの両方を使用することにより、コレステロールレベルに重点を置いて、好中球の脂質組成を決定するための方法について説明します。

脂質好中球の変化と好中球細胞外トラップのその後の形成を研究する方法

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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好中球細胞外トラップ：それらを生成して可視化する方法

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

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簡体ヒト好中球細胞外トラップ（のNET）の単離と取扱い

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ヒト好中球における細胞外DNAのリリースおよび定量NET形成のハイスループット測定<em&gt;インビトロ</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

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蛍光免疫顕微鏡を用いたパラフィン組み込みネコリン動脈血栓における好中球外細胞トラップの同定

Neutrophil extracellular traps (NETs), composed of cell-free DNA (cfDNA) and proteins like histones and neutrophil elastase (NE), are released by ...

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微生物・化学刺激による好中球細胞外トラップの形態・組成解析

Neutrophils function as the first line of cellular defense in an innate immune response by employing diverse mechanisms, such as the formation of ...

Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA

改変サンドイッチELISAを用いた好中球細胞外トラップからのミエロペルオキシダーゼ-DNAおよび好中球エラスターゼ-DNA複合体の定量(英語)

Certain stimuli, such as microorganisms, cause neutrophils to release neutrophil extracellular traps (NETs), which are basically web-like structures ...

Staining and Imaging to Visualize Neutrophil Extracellular Traps

Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues

Neutrophil Extracellular Traps Imaging in Human and Mouse Tissues (Video) | JoVE

ヒトおよびマウス組織における好中球細胞外トラップの免疫蛍光イメージング

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in ...