Name: removal of drosophila muscle tissue from larval fillets for immunofluorescence analysis of sensory neurons and epidermal cells
Uploaded: 2016-11-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells at JoVE.com

Ringraziamo Gary Laevsky per le discussioni utili su microscopia. Questo lavoro è stato finanziato dal NIH concede R01GM061107 e R01GM067758 di ERG

Nota: La procedura per la rimozione muscolare (Figura 1) è una modifica di metodi precedentemente descritti per la preparazione di filetti larvale. Le fasi che precedono e seguono la rimozione del muscolo sono descritti brevemente e si rinvia al precedente lavoro 10, 11 per una descrizione più dettagliata. 1. Dissect Larva a Saline freddo <ol><li> Preparare una diluizione di lavoro di freddo HL3.1 salina 15 o Ca 2+ freddo -free HL3.1 sali...

<ol>
	<li>Jan, Y. N., Jan, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Branching+out:+mechanisms+of+dendritic+arborization.">Branching out: mechanisms of dendritic arborization.</a> Nat Rev Neurosci. 11 (5), 316-328 (2010).</li><li>Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecules+and+mechanisms+of+dendrite+development+in+Drosophila.">Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila.</a> Development. 136 (7), 1049-1061 (2009).</li><li>Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim, M. D., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+that+regulate+establishment,+maintenance,+and+remodeling+of+dendritic+fields.">Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields.</a> Annu Rev Neurosci. 30, 399-423 (2007).</li><li>Kim, M. E., Shrestha, B. R., Blazeski, R., Mason, C. A., Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins+establish+dendrite-substrate+relationships+that+promote+dendritic+self-avoidance+and+patterning+in+Drosophila+sensory+neurons.">Integrins establish dendrite-substrate relationships that promote dendritic self-avoidance and patterning in Drosophila sensory neurons.</a> Neuron. 73 (1), 79-91 (2012).</li><li>Han, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins+regulate+repulsion-mediated+dendritic+patterning+of+Drosophila+sensory+neurons+by+restricting+dendrites+in+a+2D+space.">Integrins regulate repulsion-mediated dendritic patterning of Drosophila sensory neurons by restricting dendrites in a 2D space.</a> Neuron. 73 (1), 64-78 (2012).</li><li>Parrish, J. Z., Xu, P., Kim, C. C., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microRNA+bantam+functions+in+epithelial+cells+to+regulate+scaling+growth+of+dendrite+arbors+in+Drosophila+sensory+neurons.">The microRNA bantam functions in epithelial cells to regulate scaling growth of dendrite arbors in Drosophila sensory neurons.</a> Neuron. 63 (6), 788-802 (2009).</li><li>Jiang, N., Soba, P., Parker, E., Kim, C. C., Parrish, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microRNA+bantam+regulates+a+developmental+transition+in+epithelial+cells+that+restricts+sensory+dendrite+growth.">The microRNA bantam regulates a developmental transition in epithelial cells that restricts sensory dendrite growth.</a> Development. 141 (13), 2657-2668 (2014).</li><li>Meltzer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermis-derived+Semaphorin+promotes+dendrite+self-avoidance+by+regulating+dendrite-substrate+adhesion+in+Drosophila+sensory+neurons.">Epidermis-derived Semaphorin promotes dendrite self-avoidance by regulating dendrite-substrate adhesion in Drosophila sensory neurons.</a> Neuron. 89 (4), 741-755 (2016).</li><li>Han, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+cells+are+the+primary+phagocytes+in+the+fragmentation+and+clearance+of+degenerating+dendrites+in+Drosophila.">Epidermal cells are the primary phagocytes in the fragmentation and clearance of degenerating dendrites in Drosophila.</a> Neuron. 81 (3), 544-560 (2014).</li><li>Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+larval+NMJ+dissection.">Drosophila larval NMJ dissection.</a> J Vis Exp. (24), (2009).</li><li>Karim, M. R., Moore, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+analysis+of+Drosophila+larval+peripheral+sensory+neuron+dendrites+and+axons+using+genetic+mosaics.">Morphological analysis of Drosophila larval peripheral sensory neuron dendrites and axons using genetic mosaics.</a> J Vis Exp. (57), e3111 (2011).</li><li>Gustafsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy.">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> J Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).</li><li>Ashdown, G. W., Cope, A., Wiseman, P. W., Owen, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+flow+quantified+beyond+the+diffraction+limit+by+spatiotemporal+image+correlation+of+structured+illumination+microscopy+data.">Molecular flow quantified beyond the diffraction limit by spatiotemporal image correlation of structured illumination microscopy data.</a> Biophys J. 107 (9), L21-L23 (2014).</li><li>Zhang, W., Yan, Z., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sound+response+mediated+by+the+TRP+channels+NOMPC,+NANCHUNG,+and+INACTIVE+in+chordotonal+organs+of+Drosophila+larvae.">Sound response mediated by the TRP channels NOMPC, NANCHUNG, and INACTIVE in chordotonal organs of Drosophila larvae.</a> PNAS. 10 (33), 13612-13617 (2013).</li><li>Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+minimal+hemolymph-like+solution,+HL3.1,+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae.">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> J Neurogenet. 18 (2), 377-402 (2004).</li><li>Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+signaling+mediates+UV-induced+nociceptive+sensitization+in+Drosophila+larvae.">Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae.</a> Curr Biol. 19 (10), 799-806 (2009).</li></ol>

Qui un protocollo è descritto per la rimozione manuale del tessuto muscolare da Drosophila filetti larvale. Questo protocollo modifica precedentemente descritto tecniche di dissezione larvali 10,11. Dopo la larva è sezionato in un piatto elastomero siliconico, la linea mediana dorsale si trova. Una singola pinza polo, nella sua più piatto possibile orientamento, è attentamente inserito tra il tessuto muscolare e l&#39;epidermide, vicino alla linea mediana dorsale. Le pinze sono delicatamente tira...

Larvali arborizzazione dendritica (DA) neuroni Drosophila forniscono un modello valido per lo studio dello sviluppo neuronale a causa della loro riconducibilità alla manipolazione genetica e la facilità con cui possono essere esposte. Questi neuroni sensoriali sono state fondamentali per l&#39;identificazione di numerosi sentieri che controllano dendrite morfogenesi 1-3. Quattro classi di Da neuroni (classe I - IV) innervare l&#39;epidermide larvali. Questi neuroni si trovano tra la membrana basale e l&#39;epidermide, con i loro dendriti formazione di matrici sostanzialmente bidimensionali 4,5. Dei quattro classi, la classe IV DA neuroni hanno le pergole più altamente ramificata e, come i neuroni sensoriali di altri animali, l&#39;elaborazione di questi pergole richiede fattori intrinseci come pure spunti da tessuti vicini, in particolare l&#39;epidermide, per il loro sviluppo 6-9 . Gli studi per determinare come tale neuronale e infatti extra-neuronaleors controllare beneficio morfogenesi dei dendriti dalla capacità di rilevare l&#39;espressione della proteina in situ mediante immunofluorescenza. La cuticola esterno della larva è impenetrabile agli anticorpi, ma questo impedimento è facilmente superabile dalla preparazione di filetti larvale attraverso metodi dissezione consolidati 10,11. Tuttavia, il tessuto muscolare parete del corpo che si trova appena interno alla membrana basale presenta varie sfide verso visualizzazione DA neuroni e cellule epidermiche. Innanzitutto, il tessuto muscolare, quali linee maggior parte della parete del corpo, oscura notevolmente segnali fluorescenti provenienti da tessuto neuronale o epidermico. Questo riduce notevolmente il rapporto segnale-rumore nel campione. Secondo, molte proteine ​​rilevanti possono essere espressi nel tessuto muscolare e nei neuroni o dell&#39;epidermide. Questo segnale di fluorescenza muscolare derivato probabilmente ancora rilevamento oscura di un segnale di fluorescenza dal neurone o epidermide. Infine, i progressi nelle tecnologie di microscopia nol&#39;imaging permesso w di campioni con risoluzione sub-diffrazione e può essere particolarmente utile nel discernere la localizzazione delle proteine che vengono espresse in neuroni e cellule epidermiche circostanti 12,13. Tuttavia, l&#39;imaging via super-risoluzione benefici microscopia da un forte rapporto segnale-rumore e la vicinanza del campione al vetrino. Oltre a ridurre il rapporto segnale rumore, la parete del corpo larvali distanze muscolari DA neuroni dal vetrino, limitando così la risoluzione dell&#39;immagine migliorata che può essere ottenuto con metodi di microscopia super-risoluzione. Oltre le sfide per l&#39;analisi di immunofluorescenza, tessuto muscolare presenta una barriera alla registrazione elettrofisiologica da neuroni sensoriali nella parete del corpo larvale. La sua rimozione beneficia pertanto manipolazione neurofisiologica dei neuroni sensoriali 14. Qui un metodo per la rimozione manuale di Drosophila tessuto muscolare larvale è descritto. Abbiamo dimostrato che il nostro protocollo permits immagini immunofluorescenza di proteine ​​che sono altrimenti oscurata da tessuto muscolare, migliora il rapporto segnale-rumore per la visualizzazione di classe IV DA neuroni, e consente l&#39;utilizzo della microscopia super-risoluzione per discriminare meglio relazioni spaziali di proteine ​​e strutture cellulari in DA neuroni e l&#39;epidermide.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1299">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Dumont #5 tweezers</td>
			<td style="width:304px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:151px;">72701-D</td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro Scissors, 8 cm, straight, 5 mm blades, 0.1 mm tips</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sylgard 184 silicone elastomer kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>3097358-1004</td>
			<td>for dissecting plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Austerlitz insect pins, 0.1 mm</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fostec 8375 light source</td>
			<td>Artisan Technology Group</td>
			<td>62792-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zeiss Stemi 2000</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vectashield antifade mounting medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>for confocal microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Prolong Diamond antifade mountant</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P36970</td>
			<td>for structured illumination microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro cover glass, 22x22 mm, No. 1.5</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366-227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Superfrost Plus microscope slides, 25 x 75 x 1.0 mm</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse anti-Coracle antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>C615.16</td>
			<td>supernatant, dilute 1:50</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse anti-Discs large antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>4F3</td>
			<td>supernatant, dilute 1:50</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rabbit anti-dsRed antibody</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>632496</td>
			<td>dilute 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-rabbit antibody, Alexa Fluor 568 conjugated</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11011</td>
			<td>dilute 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-mouse antibody, Alexa Fluor 488 conjugated</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11001</td>
			<td>dilute 1:500</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

removal of drosophila muscle tissue from larval fillets for immunofluorescence analysis of sensory neurons and epidermal cells

Larvali arborizzazione dendritica (DA) neuroni Drosophila sono un modello popolare per lo studio dei meccanismi di morfogenesi neuronale. Da neuroni sviluppano in comunicazione con le cellule epidermiche che innervano e quindi le loro prestazioni di analisi da in situ visualizzazione di entrambe le proteine neuronally e epidermally espresse mediante immunofluorescenza. I metodi tradizionali di preparazione di filetti larvale per esperimenti di immunofluorescenza lasciano intatto il tessuto muscolare che copre la maggior parte della parete del corpo, che presenta diverse sfide per l&#39;imaging neuronale e epidermiche proteine. Qui si descrive un metodo per la rimozione di tessuto muscolare dalla Drosophila filetti larvale. Questo protocollo permette l&#39;imaging di proteine ​​che sono altrimenti oscurata da tessuto muscolare, migliora il rapporto segnale rumore, e facilita l&#39;utilizzo della microscopia super-risoluzione per studiare da sviluppo neurone.

Dimostriamo l&#39;utilità della procedura di rimozione del muscolo per migliorare rapporto segnale-rumore in esperimenti di immunofluorescenza di co-visualizzare le proteine ​​di derivazione settate Coracle (Cora) e dischi-grandi dimensioni (DLG) insieme con classe IV DA neuroni marcati con il marcatore di membrana CD4- tdTomato. Cora è stato utilizzato in precedenza per identificare tratti dove DA dendriti dei neuroni sono racchiusi da cellule epidermi...

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Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells

Studi di morfogenesi neuronale utilizzando Drosophila larvale arborizzazione dendritiche (bis) i neuroni beneficiano di visualizzazione situ delle proteine neuronali e epidermiche mediante immunofluorescenza. Descriviamo una procedura che migliora l&#39;analisi di immunofluorescenza di DA neuroni e cellule epidermiche circostanti, rimuovendo il tessuto muscolare dalla parete del corpo larvale.

Rimozione di<em&gt; Drosophila</em&gt; Tessuto muscolare da larvali Filetti per l&#39;analisi di immunofluorescenza dei neuroni sensoriali e cellule epidermiche

Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons are a popular model for investigating mechanisms of neuronal morphogenesis. Da neurons develop in ...

Research

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Neuroscience

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