Name: removal of drosophila muscle tissue from larval fillets for immunofluorescence analysis of sensory neurons and epidermal cells
Uploaded: 2016-11-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells at JoVE.com

Мы благодарим Гари Лаевский за полезные дискуссии по микроскопии. Эта работа финансировалась NIH предоставляет R01GM061107 и R01GM067758 с ERG

Примечание: Процедура удаления мышц (рисунок 1) представляет собой модификацию ранее описанных способов получения личиночных галтелей. Шаги , которые предшествуют и следуют за удаление мышц изложены кратко и читатель отсылается к предыдущей работе 10, 11 для более подробн...

<ol>
	<li>Jan, Y. N., Jan, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Branching+out:+mechanisms+of+dendritic+arborization.">Branching out: mechanisms of dendritic arborization.</a> Nat Rev Neurosci. 11 (5), 316-328 (2010).</li><li>Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecules+and+mechanisms+of+dendrite+development+in+Drosophila.">Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila.</a> Development. 136 (7), 1049-1061 (2009).</li><li>Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim, M. D., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+that+regulate+establishment,+maintenance,+and+remodeling+of+dendritic+fields.">Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields.</a> Annu Rev Neurosci. 30, 399-423 (2007).</li><li>Kim, M. E., Shrestha, B. R., Blazeski, R., Mason, C. A., Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins+establish+dendrite-substrate+relationships+that+promote+dendritic+self-avoidance+and+patterning+in+Drosophila+sensory+neurons.">Integrins establish dendrite-substrate relationships that promote dendritic self-avoidance and patterning in Drosophila sensory neurons.</a> Neuron. 73 (1), 79-91 (2012).</li><li>Han, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins+regulate+repulsion-mediated+dendritic+patterning+of+Drosophila+sensory+neurons+by+restricting+dendrites+in+a+2D+space.">Integrins regulate repulsion-mediated dendritic patterning of Drosophila sensory neurons by restricting dendrites in a 2D space.</a> Neuron. 73 (1), 64-78 (2012).</li><li>Parrish, J. Z., Xu, P., Kim, C. C., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microRNA+bantam+functions+in+epithelial+cells+to+regulate+scaling+growth+of+dendrite+arbors+in+Drosophila+sensory+neurons.">The microRNA bantam functions in epithelial cells to regulate scaling growth of dendrite arbors in Drosophila sensory neurons.</a> Neuron. 63 (6), 788-802 (2009).</li><li>Jiang, N., Soba, P., Parker, E., Kim, C. C., Parrish, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microRNA+bantam+regulates+a+developmental+transition+in+epithelial+cells+that+restricts+sensory+dendrite+growth.">The microRNA bantam regulates a developmental transition in epithelial cells that restricts sensory dendrite growth.</a> Development. 141 (13), 2657-2668 (2014).</li><li>Meltzer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermis-derived+Semaphorin+promotes+dendrite+self-avoidance+by+regulating+dendrite-substrate+adhesion+in+Drosophila+sensory+neurons.">Epidermis-derived Semaphorin promotes dendrite self-avoidance by regulating dendrite-substrate adhesion in Drosophila sensory neurons.</a> Neuron. 89 (4), 741-755 (2016).</li><li>Han, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+cells+are+the+primary+phagocytes+in+the+fragmentation+and+clearance+of+degenerating+dendrites+in+Drosophila.">Epidermal cells are the primary phagocytes in the fragmentation and clearance of degenerating dendrites in Drosophila.</a> Neuron. 81 (3), 544-560 (2014).</li><li>Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+larval+NMJ+dissection.">Drosophila larval NMJ dissection.</a> J Vis Exp. (24), (2009).</li><li>Karim, M. R., Moore, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+analysis+of+Drosophila+larval+peripheral+sensory+neuron+dendrites+and+axons+using+genetic+mosaics.">Morphological analysis of Drosophila larval peripheral sensory neuron dendrites and axons using genetic mosaics.</a> J Vis Exp. (57), e3111 (2011).</li><li>Gustafsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy.">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> J Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).</li><li>Ashdown, G. W., Cope, A., Wiseman, P. W., Owen, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+flow+quantified+beyond+the+diffraction+limit+by+spatiotemporal+image+correlation+of+structured+illumination+microscopy+data.">Molecular flow quantified beyond the diffraction limit by spatiotemporal image correlation of structured illumination microscopy data.</a> Biophys J. 107 (9), L21-L23 (2014).</li><li>Zhang, W., Yan, Z., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sound+response+mediated+by+the+TRP+channels+NOMPC,+NANCHUNG,+and+INACTIVE+in+chordotonal+organs+of+Drosophila+larvae.">Sound response mediated by the TRP channels NOMPC, NANCHUNG, and INACTIVE in chordotonal organs of Drosophila larvae.</a> PNAS. 10 (33), 13612-13617 (2013).</li><li>Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+minimal+hemolymph-like+solution,+HL3.1,+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae.">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> J Neurogenet. 18 (2), 377-402 (2004).</li><li>Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+signaling+mediates+UV-induced+nociceptive+sensitization+in+Drosophila+larvae.">Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae.</a> Curr Biol. 19 (10), 799-806 (2009).</li></ol>

Здесь протокол описан для ручного удаления мышечной ткани от дрозофилы личиночной филе. Этот протокол модифицирует ранее описанных методов личиночной рассечение 10,11. После того, как личинка рассекают в силиконового эластомера блюдо, средней линии спины расположен. Один пин...

Дрозофилы личиночной дендритных разветвление (да) нейроны обеспечивают ценную модель для изучения развития нейронов из - за их аменабельности генетической манипуляции и легкость , с которой они могут быть изображаемого. Эти сенсорные нейроны играют важную роль в выявлении многочисленных путей , которые контролируют дендритов морфогенеза 1-3. Четыре класса нейронов да (класс I - IV) иннервируют личиночной эпидермис. Эти нейроны лежат между базальной мембраной и эпидермиса, с их дендриты образуя в основном двумерные массивы 4,5. Из четырех классов, класс IV - да нейроны имеют наиболее сильно разветвленные беседок и, как сенсорные нейроны других животных, разработка этих беседок требует внутренних факторов, а также сигналы от соседних тканей, в частности , эпидермис, для их развития 6-9 , Исследования с целью определения того, как такое нейронные и экстра-нейронную фактПРС управления дендритов преимущество морфогенез от способности обнаружить экспрессию белка на месте с помощью иммунофлуоресценции. Наружная кожица личинки непроницаема для антител, но это препятствие легко преодолевается подготовки личиночной филе с помощью хорошо известных методов рассечение 10,11. Тем не менее, стенки тела мышечной ткани, которая лежит только интерьер к базальной мембране представляет несколько проблем по отношению к визуализации нейронов да и эпидермальных клеток. Во-первых, мышечной ткани, что линии большинство стенки тела, сильно затемняет флуоресцентные сигналы, исходящие от нервных клеток или эпидермальной ткани. Это в значительной степени уменьшает отношение сигнала к шуму в образце. Во-вторых, многие соответствующие белки могут быть выражены в мышечной ткани, а также в нейронах или эпидермиса. Эта мышца полученный сигнал флуоресценции, вероятно, еще неясного обнаружения сигнала флуоресценции от нейроном или эпидермиса. И, наконец, достижения в области микроскопии технологий нетж разрешение изображения образцов при разрешении суб-дифракционного и может быть особенно полезно в плане определения локализации белков, которые экспрессируются в нейронах и окружающих клеток эпидермиса 12,13. Тем не менее, визуализация с помощью супер-разрешения преимуществ микроскопии от сильного сигнала к шуму и непосредственной близости от образца к покровным. В дополнение к уменьшению сигнала к шуму, личиночные стенки тела мышечные расстояния да нейронов от покровного, ограничивая тем самым улучшенное разрешение изображения, которое может быть достигнуто с помощью методов микроскопии сверхвысокого разрешения. Кроме проблем для иммунофлуоресцентного анализа, мышечной ткани представляет собой барьер для электрофизиологические записи от сенсорных нейронов в личиночной стенки тела. Поэтому его удаление преимущества нейрофизиологическую манипуляции сенсорных нейронов 14. Вот способ ручного удаления дрозофилы личиночной мышечной ткани описана. Показано, что наш протокол рermits иммунофлюоресценции визуализации белков, которые в противном случае затемняется мышечной ткани, улучшает соотношение сигнал-шум для визуализации IV класса нейронов да, и дает возможность использовать сверхвысокого разрешения микроскопии, чтобы лучше различать пространственные соотношения белков и клеточных структур в нейронов да и эпидермис.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1299">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Dumont #5 tweezers</td>
			<td style="width:304px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:151px;">72701-D</td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro Scissors, 8 cm, straight, 5 mm blades, 0.1 mm tips</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sylgard 184 silicone elastomer kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>3097358-1004</td>
			<td>for dissecting plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Austerlitz insect pins, 0.1 mm</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fostec 8375 light source</td>
			<td>Artisan Technology Group</td>
			<td>62792-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zeiss Stemi 2000</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vectashield antifade mounting medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>for confocal microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Prolong Diamond antifade mountant</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P36970</td>
			<td>for structured illumination microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro cover glass, 22x22 mm, No. 1.5</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366-227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Superfrost Plus microscope slides, 25 x 75 x 1.0 mm</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse anti-Coracle antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>C615.16</td>
			<td>supernatant, dilute 1:50</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse anti-Discs large antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>4F3</td>
			<td>supernatant, dilute 1:50</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rabbit anti-dsRed antibody</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>632496</td>
			<td>dilute 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-rabbit antibody, Alexa Fluor 568 conjugated</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11011</td>
			<td>dilute 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-mouse antibody, Alexa Fluor 488 conjugated</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11001</td>
			<td>dilute 1:500</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

removal of drosophila muscle tissue from larval fillets for immunofluorescence analysis of sensory neurons and epidermal cells

Дрозофилы личиночной дендритных разветвление (да) нейроны являются популярной моделью для исследования механизмов морфогенеза нейронов. Da нейроны развиваются в связи с эпидермальных клеток , которые они возбуждают и , следовательно , их анализ выгод от in - situ визуализации обоих neuronally и epidermally выраженных белков с помощью иммунофлюоресценции. Традиционные способы приготовления личиночной филе для иммунофлюоресценции экспериментов оставить нетронутыми мышечной ткани, которая покрывает большую часть стенки тела, представляя несколько проблем для визуализации нейронов и эпидермальные белки. Здесь мы опишем метод удаления мышечной ткани от дрозофилы личиночной филе. Этот протокол позволяет визуализации белков, которые в противном случае затемняется мышечной ткани, улучшает отношение сигнал-шум и облегчает использование сверхвысокого разрешения микроскопии для изучения развития да нейрон.

Показана полезность процедуры удаления мышц для улучшения сигнала к шуму в иммунофлюоресценции экспериментов совместно визуализировать перегородками клеммные белки челнок (Cora) и диски-большой (DLG) совместно с IV класса нейронов да меченых с мембранным маркером CD4- tdTomato. <p class="jove_content" f...

Watch this Scientific Journal Video about Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells at JoVE.com

Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells

Исследования нейронов формообразования с использованием дрозофилы личиночной разветвление дендритов (DA) нейроны выгоду от визуализации на месте нейрональных и эпидермальных белков в иммунофлюоресценции. Мы опишем процедуру, которая улучшает иммунофлуоресцентного анализ нейронов да и окружающих клеток эпидермиса путем удаления мышечной ткани от личиночной стенки тела.

Удаление<em&gt; Drosophila</em&gt; Мышечной ткани из личиночной филе для иммунофлуоресценции анализа сенсорных нейронах и эпидермальных клеток

Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons are a popular model for investigating mechanisms of neuronal morphogenesis. Da neurons develop in ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells

Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

Live-изображений PKC транслокации в Sf9 клеток и в Aplysia сенсорных нейронов

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-ячейки изображения сенсорных клеток-предшественников органов в интактных Drosophila Куколки

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

Морфологический анализ Drosophila Личинок периферийных сенсорных дендритов нейронов и аксонов с использованием генетических Мозаики

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic ...

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

Функциональный анализ из питания личинок округа в Дрозофилы</i

The serotonergic  feeding circuit in Drosophila  melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of  critical importance during the ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Всего Гора иммунного обонятельных рецепторов нейронов в<em&gt; Дрозофилы</em&gt; Антенны

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Production and Isolation of Axons from Sensory Neurons for Biochemical Analysis Using Porous Filters

Получение и выделение Аксоны от сенсорных нейронов для биохимического анализа, используя пористые фильтры

Neuronal axons use specific mechanisms to mediate extension, maintain integrity, and induce degeneration. An appropriate balance of these events is ...

Isolation and Culture of Dissociated Sensory Neurons From Chick Embryos

Выделение и культуры диссоциированных сенсорные нейроны От куриные эмбрионы

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. ...

Physiological Preparation of Hair Cells from the Sacculus of the American Bullfrog (Rana catesbeiana)

Physiological Preparation of Hair Cells from the Sacculus of the American Bullfrog Rana catesbeiana

Физиологический Получение волосковых клеток из саккулюс американского Bullfrog (<em&gt; Рана catesbeiana</em&gt;)

The study of hearing and balance rests upon insights drawn from biophysical studies of model systems. One such model, the sacculus of the American ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

рерио<em&gt; В Ситу</em&gt; Спинной мозг Подготовка к Электрофизиологическим записям из спинномозговых сенсорных и двигательных нейронов

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

Отслеживание дрозофилы личиночной поведение в ответ на Optogenetic стимуляции обонятельных нейронов

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a ...