Name: removal of drosophila muscle tissue from larval fillets for immunofluorescence analysis of sensory neurons and epidermal cells
Uploaded: 2016-11-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells at JoVE.com

Vi tackar Gary Laevsky för bra diskussioner om mikroskopi. Detta arbete har finansierats av NIH bidrag R01GM061107 och R01GM067758 till ERG

Obs: Proceduren för muskel bort (figur 1) är en modifiering av tidigare beskrivna metoder för framställning av larver filéer. De steg som föregår och följer muskel avlägsnande beskrivs kortfattat och läsaren hänvisas till tidigare arbete 10, 11 för mer detaljerade beskrivningar. 1. Dissekera Larva i kall saltlösning <ol><li> Bered en arbetsutspädning av kall HL3.1 saltlösning 15 eller kall Ca2 + -fri HL3.1 saltlösning 1...

<ol>
	<li>Jan, Y. N., Jan, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Branching+out:+mechanisms+of+dendritic+arborization.">Branching out: mechanisms of dendritic arborization.</a> Nat Rev Neurosci. 11 (5), 316-328 (2010).</li><li>Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecules+and+mechanisms+of+dendrite+development+in+Drosophila.">Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila.</a> Development. 136 (7), 1049-1061 (2009).</li><li>Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim, M. D., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+that+regulate+establishment,+maintenance,+and+remodeling+of+dendritic+fields.">Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields.</a> Annu Rev Neurosci. 30, 399-423 (2007).</li><li>Kim, M. E., Shrestha, B. R., Blazeski, R., Mason, C. A., Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins+establish+dendrite-substrate+relationships+that+promote+dendritic+self-avoidance+and+patterning+in+Drosophila+sensory+neurons.">Integrins establish dendrite-substrate relationships that promote dendritic self-avoidance and patterning in Drosophila sensory neurons.</a> Neuron. 73 (1), 79-91 (2012).</li><li>Han, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins+regulate+repulsion-mediated+dendritic+patterning+of+Drosophila+sensory+neurons+by+restricting+dendrites+in+a+2D+space.">Integrins regulate repulsion-mediated dendritic patterning of Drosophila sensory neurons by restricting dendrites in a 2D space.</a> Neuron. 73 (1), 64-78 (2012).</li><li>Parrish, J. Z., Xu, P., Kim, C. C., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microRNA+bantam+functions+in+epithelial+cells+to+regulate+scaling+growth+of+dendrite+arbors+in+Drosophila+sensory+neurons.">The microRNA bantam functions in epithelial cells to regulate scaling growth of dendrite arbors in Drosophila sensory neurons.</a> Neuron. 63 (6), 788-802 (2009).</li><li>Jiang, N., Soba, P., Parker, E., Kim, C. C., Parrish, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microRNA+bantam+regulates+a+developmental+transition+in+epithelial+cells+that+restricts+sensory+dendrite+growth.">The microRNA bantam regulates a developmental transition in epithelial cells that restricts sensory dendrite growth.</a> Development. 141 (13), 2657-2668 (2014).</li><li>Meltzer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermis-derived+Semaphorin+promotes+dendrite+self-avoidance+by+regulating+dendrite-substrate+adhesion+in+Drosophila+sensory+neurons.">Epidermis-derived Semaphorin promotes dendrite self-avoidance by regulating dendrite-substrate adhesion in Drosophila sensory neurons.</a> Neuron. 89 (4), 741-755 (2016).</li><li>Han, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+cells+are+the+primary+phagocytes+in+the+fragmentation+and+clearance+of+degenerating+dendrites+in+Drosophila.">Epidermal cells are the primary phagocytes in the fragmentation and clearance of degenerating dendrites in Drosophila.</a> Neuron. 81 (3), 544-560 (2014).</li><li>Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+larval+NMJ+dissection.">Drosophila larval NMJ dissection.</a> J Vis Exp. (24), (2009).</li><li>Karim, M. R., Moore, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+analysis+of+Drosophila+larval+peripheral+sensory+neuron+dendrites+and+axons+using+genetic+mosaics.">Morphological analysis of Drosophila larval peripheral sensory neuron dendrites and axons using genetic mosaics.</a> J Vis Exp. (57), e3111 (2011).</li><li>Gustafsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy.">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> J Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).</li><li>Ashdown, G. W., Cope, A., Wiseman, P. W., Owen, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+flow+quantified+beyond+the+diffraction+limit+by+spatiotemporal+image+correlation+of+structured+illumination+microscopy+data.">Molecular flow quantified beyond the diffraction limit by spatiotemporal image correlation of structured illumination microscopy data.</a> Biophys J. 107 (9), L21-L23 (2014).</li><li>Zhang, W., Yan, Z., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sound+response+mediated+by+the+TRP+channels+NOMPC,+NANCHUNG,+and+INACTIVE+in+chordotonal+organs+of+Drosophila+larvae.">Sound response mediated by the TRP channels NOMPC, NANCHUNG, and INACTIVE in chordotonal organs of Drosophila larvae.</a> PNAS. 10 (33), 13612-13617 (2013).</li><li>Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+minimal+hemolymph-like+solution,+HL3.1,+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae.">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> J Neurogenet. 18 (2), 377-402 (2004).</li><li>Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+signaling+mediates+UV-induced+nociceptive+sensitization+in+Drosophila+larvae.">Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae.</a> Curr Biol. 19 (10), 799-806 (2009).</li></ol>

Här ett protokoll beskrivs för manuell borttagning av muskelvävnad från Drosophila larver filéer. Detta protokoll modifierar tidigare beskrivna larver dissekering tekniker 10,11. Efter larven dissekeras i en silikonelastomer maträtt, är den dorsala mittlinjen belägen. En enda pincett stift, i dess platt möjliga orientering, noggrant in mellan muskelvävnad och epidermis, nära ryggens mittlinje. Tången försiktigt dras uppåt för att separera muskelvävnad från en fästpunkt i varje larv ...

Drosophila larver dendritiska arborization (da) neuroner ger en värdefull modell för att studera neuronal utveckling på grund av deras mottaglighet för genetisk manipulation och den lätthet med vilken de kan avbildas. Dessa sensoriska neuroner har varit avgörande för identifieringen av många vägar som styr dendrit morfogenes 1-3. Fyra klasser av DA-neuroner (klass I - IV) innerverar larver överhuden. Dessa nervceller ligger mellan basalmembranet och epidermis, med sina dendriter bildar i stort sett tvådimensionella arrayer 4,5. Av de fyra klasser, klass IV da nervceller har de höggradigt grenade hållare och, som sensoriska neuroner av andra djur, utarbetandet av dessa hållare kräver inneboende faktorer samt signaler från angränsande vävnader, särskilt epidermis, för deras utveckling 6-9 . Studier för att avgöra hur en sådan neuronal och extra-neuronal faktumorer styra dendrit morfogenes dra nytta av möjligheten att detektera proteinuttryck in situ genom immunofluorescens. Den yttre nagelband av larven är ogenomtränglig till antikroppar, men detta hinder är lätt övervinnas genom framställning av larver filéer genom väletablerade dissekering metoder 10,11. Men kroppen väggen muskler som ligger bara inre till basalmembranet presenterar flera utmaningar mot visualisering av da nervceller och hudceller. Först muskelvävnaden, vilka linjer de flesta av kroppen väggen, skymmer kraftigt fluorescerande signalerna från neuronal eller epidermal vävnad. Detta reducerar väsentligen den signal-brusförhållandet i provet. För det andra kan många relevanta proteiner uttryckas i muskelvävnaden såväl som i de neuroner eller epidermis. Denna muskel härrörande fluorescenssignal är sannolikt att ytterligare dunkla detektering av en fluorescenssignal från neuron eller epidermis. Slutligen framsteg inom mikroskopi tekniker intew tillstånd avbildning av prover på under diffraktion upplösning och kan vara särskilt användbart i kräsna lokalisering av proteiner som uttrycks i neuroner och omgivande epidermala celler 12,13. Men avbildning via super-upplösning mikroskopi nytta av en stark signal till brusförhållande och närhet av provet täck. Förutom att minska signalbrusförhållandet, larvkroppen väggmuskel avstånd DA-neuroner från täckglas, vilket därigenom begränsar den förbättrade bildupplösning som kan uppnås med superupplösning mikroskopimetoder. Förutom utmaningar för immunofluorescensanalys, presenterar muskelvävnad en barriär mot elektrofysiologiska inspelning från sensoriska neuroner i larvkroppen väggen. Dess avlägsnande gynnar därför neurofysiologisk manipulation av sensoriska neuroner 14. Här en metod för manuellt borttagande av Drosophila larv muskelvävnad beskrivs. Vi visar att våra protokoll permits immunofluorescens avbildning av proteiner som annars är dolda av muskelvävnad, förbättrar signal-brusförhållandet för visualisering av klass IV-DA-neuroner, och möjliggör användningen av superupplösning mikroskopi för att bättre särskilja rumsliga förhållanden av proteiner och cellulära strukturer i DA-neuroner och epidermis.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1299">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:413px;">Dumont #5 tweezers</td>
			<td style="width:304px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:151px;">72701-D</td>
			<td style="width:432px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro Scissors, 8 cm, straight, 5 mm blades, 0.1 mm tips</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sylgard 184 silicone elastomer kit</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>3097358-1004</td>
			<td>for dissecting plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Austerlitz insect pins, 0.1 mm</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fostec 8375 light source</td>
			<td>Artisan Technology Group</td>
			<td>62792-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zeiss Stemi 2000</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vectashield antifade mounting medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>for confocal microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Prolong Diamond antifade mountant</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P36970</td>
			<td>for structured illumination microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro cover glass, 22x22 mm, No. 1.5</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366-227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Superfrost Plus microscope slides, 25 x 75 x 1.0 mm</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse anti-Coracle antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>C615.16</td>
			<td>supernatant, dilute 1:50</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse anti-Discs large antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>4F3</td>
			<td>supernatant, dilute 1:50</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rabbit anti-dsRed antibody</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>632496</td>
			<td>dilute 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-rabbit antibody, Alexa Fluor 568 conjugated</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11011</td>
			<td>dilute 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-mouse antibody, Alexa Fluor 488 conjugated</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11001</td>
			<td>dilute 1:500</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

removal of drosophila muscle tissue from larval fillets for immunofluorescence analysis of sensory neurons and epidermal cells

Drosophila larver dendritiska arborization (da) nervceller är en populär modell för att undersöka mekanismer för neuronal morfogenes. DA-neuroner utvecklas i kommunikation med de epidermala cellerna de innerverar och därmed sina analys förmåner från in situ-visualisering av både neuronalt och epidermally uttryckta proteiner genom immunofluorescens. Traditionella metoder för att framställa larver filéer för immunofluorescens experiment lämnar intakt muskelvävnaden som täcker större delen av kroppen väggen, presenterar flera utmaningar att avbilda neuronala och epidermala proteiner. Här beskriver vi en metod för att avlägsna muskelvävnad från Drosophila larver filéer. Detta protokoll möjliggör avbildning av proteiner som annars skyms av muskelvävnad, förbättrar signal-brusförhållandet, och underlättar användningen av super-upplösning mikroskopi för att studera da neuron utveckling.

Vi visar användbarheten av förfarandet muskel borttagning för att förbättra signal-brusförhållandet i immunfluorescensexperiment att co-visualisera septate junction-proteinerna Coracle (Cora) och skivor-stor (Dlg) tillsammans med klass IV DA-neuroner märkta med membranmarkör CD4- tdTomato. Cora har tidigare använts för att identifiera områden där da neuron dendriter är omges av hudceller och är en av många identifierade epidermal faktorer som ...

Watch this Scientific Journal Video about Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells at JoVE.com

Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells

Studier av neuronala morfogenes med hjälp av Drosophila larver dendritiska arborization (da) neuroner dra nytta av in situ visualisering av neuronala och epidermala proteiner genom immunofluorescens. Vi beskriver ett förfarande som förbättrar immunofluorescensanalys av da nervceller och omgivande epidermala celler genom att ta bort muskelvävnad från larvkroppen väggen.

Borttagning av<em&gt; Drosophila</em&gt; Muskelvävnad från larver filéer för immunofluorescensanalys av sensoriska neuroner och epidermala celler

Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons are a popular model for investigating mechanisms of neuronal morphogenesis. Da neurons develop in ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells

Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

Live-avbildning av PKC translokation hos Sf9 celler och i Aplysia sensoriska neuroner

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell imaging av sensoriska celler orgel Precursor i intakt Drosophila Puppor

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

Morfologisk analys av Drosophila Larvernas Perifera sensoriska neuron dendriter och Axoner med genetiska mosaiker

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic ...

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

Funktionell analys av Larv Feeding Circuit i Drosophila</i

The serotonergic  feeding circuit in Drosophila  melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of  critical importance during the ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Hela Mount immunomärkning av luktreceptor nervceller i<em&gt; Drosophila</em&gt; Antenn

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Production and Isolation of Axons from Sensory Neurons for Biochemical Analysis Using Porous Filters

Produktion och isolering av Axoner från sensoriska neuroner för biokemisk analys med porösa filter

Neuronal axons use specific mechanisms to mediate extension, maintain integrity, and induce degeneration. An appropriate balance of these events is ...

Isolation and Culture of Dissociated Sensory Neurons From Chick Embryos

Isolering och odling av dissocierade sensoriska neuroner från kycklingembryon

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. ...

Physiological Preparation of Hair Cells from the Sacculus of the American Bullfrog (Rana catesbeiana)

Physiological Preparation of Hair Cells from the Sacculus of the American Bullfrog Rana catesbeiana

Fysiologiska Framställning av hårcellerna från säcken av den amerikanska Bullfrog (<em&gt; Ranacatesbeiana</em&gt;)

The study of hearing and balance rests upon insights drawn from biophysical studies of model systems. One such model, the sacculus of the American ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

zebrafisk<em&gt; In Situ</em&gt; Spinal Cord Förberedelse för elektrofysiologiska inspelningar från Spinal sensoriska och motoriska nervceller

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

Spåra Drosophila Larval beteende som svar på Optogenetic stimulering av lukt nervceller

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a ...