Name: a method for measuring rna n6-methyladenosine modifications in cells and tissues
Uploaded: 2016-12-05T13:00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues at JoVE.com

C.Y.W. received support from the National Health Research Institute (NHRI-EX101-9925SC), the National Science Council (101-2314-B-182-100-MY3, 101-2314-B-182A-009), and Chang Gung Memorial Hospital (CMRPG3B1643, CMRPG3D1002, CMRPG3D0581, CMRPG380091, and CMRPG3C1763).

OBS: Den totala RNA-m 6 En nivå innehåller rRNA, mRNA och andra små RNA. Eftersom ribosomalt RNA har rikligt m 6 A modifieringar, mätning av m 6 A nivåer kommer att behöva överväga detta faktum. 1. RNA-isolering <ol><li> Använda ribonukleas sanering lösning (sprutas på pappershanddukar), torka av pipetter och labbbänkytor. Våta pappershanddukar med nukleasfritt vatten och torka av pipetter och labbbänkytor igen. </li><li> RNA-extraktion <ol><li> Total RNA Isolation <ol><li> Med användning av en överliggande omrörare, homogenisera 50-100 mg vävnad eller 5-10 x 10 6 celler i 1 ml RNA isolering lösning som hölls vid 4 ° C. OBS: Mer vävnad (100-150 mg) kan krävas för fettvävnadsprover från möss på grund av de lägre RNA koncentrationer däri. Prover kommer från mus hjärta, lever, skelettmuskel, lunga, hjärna, och makrofager har använts tidigare fyra. </li><li> Icubate provhomogenat under 5 min vid rumstemperatur. </li><li> Tillsätt 100 | il av en-brom-3-klorpropan (BCP) per 1 mL prov homogenat. Skaka rören kraftigt i 15 sekunder och fortsätt att isolera totalt RNA enligt tillverkarens anvisningar 24. </li></ol></li><li> Polyadenylerad mRNA Rening från isolerat Total RNA <ol><li> Rena polyadenylerade mRNA med hjälp av tillgängliga kit eller protokoll. <ol><li> Skaka noggrant för att återsuspendera var och en av följande lösningar: 2x bindande lösning, oligo (DT) polystyrenpärlor, och tvättlösningen. Säkerställa att den oligo (dT) pärlor varm till rumstemperatur före användning. </li><li> Överföra 120 mikroliter av elueringslösning per beredning till ett rör och värm till 70 ° C i ett värmeblock. </li><li> Pipettera upp till 500 | j, g av totalt RNA till ett mikrocentrifugrör. Med nukleasfritt vatten, justera volymen till 250 mikroliter. </li><li> Tillsätt 250 | il av 2x bindningslösningen till totalt RNA sålution och vortex en kort stund för att blanda innehållet. </li><li> Tillsätt 15 mikroliter av oligo (dT) pärlor och vortexa grundligt för att blanda. </li><li> Inkubera blandningen vid 70 ° C under 3 min. </li><li> Avlägsna provet från värmeblocket och låt den stå vid rumstemperatur under 10 min. </li><li> Centrifugera vid 15.000 xg under 2 min. </li><li> Försiktigt bort supernatanten och lämnar efter sig cirka 50 mikroliter. </li><li> Tillsätt 500 pl tvättlösning för att återsuspendera pelleten genom pipettering. </li><li> Pipett suspensionen i en spinnfilter / provrör set. </li><li> Centrifugera vid 15.000 xg under 2 min. Avlägsna kolonnen från uppsamlingsröret och kassera genomströmning. Återgå kolumnen till provröret. </li><li> Pipett 500 mikroliter av tvättlösning på spinnfilter. </li><li> Centrifugera vid 15.000 x g under 2 minuter. </li><li> Överföra spin filter till en färsk uppsamlingsrör. </li><li> Pipettera 50 | il av elueringslösning upphettadestill 70 ° C på mitten av spinnfiltret. </li><li> Inkubera under 2-5 min vid 70 ° C. Centrifugera vid 15.000 xg i 1 min. </li><li> Pipettera en ytterligare 50 mikroliter av elueringslösning upphettades till 70 ° C på mitten av spinnfiltret. </li><li> Upprepa steg 1.2.2.1.18. </li></ol></li><li> Tillsätt 100 | ig / ml glykogen, 0,1 volym av 3 M natriumacetatbuffert (pH 5,2), och 2,5 volymer absolut etanol. Fällning natten vid -80 ° C. </li><li> Centrifugera vid 15.000 xg under 25 min vid 4 ° C. Kassera supernatanten. </li><li> Tvätta pelleten med 1 ml 75% etanol. Centrifugera vid 15.000 xg under 15 min vid 4 ° C. Försiktigt bort etanolen. </li><li> Torka i luft under 3-5 min. </li><li> Tillsätt 10 mikroliter av nukleasfritt vatten för att lösa upp pelleten. </li><li> Förvara vid -70 ° C. </li></ol></li></ol></li><li> RNA Kval och kvantifiering <ol><li> Användning av en spektrofotometer, fastställa vilken RNA-koncentration genom noting av absorbansen vid 260 nm och 280 nm. A 260 / A 280 Förhållandet bör vara 1,8-2,2. </li><li> Kontrollera RNA-provet kvalitet med hjälp 0,8% agarosgelelektrofores 25. OBS: Den intakta eukaryota totalt RNA bör visa intensiva 28S och 18S rRNA-banden. Förhållandet mellan 28S mot 18S rRNA bandintensitet för en bra RNA preparat är ~ 2. </li></ol></li></ol> 2. Gelelektrofores och överföring OBS: De buffertberedningsprotokoll ges i tabell 1. <ol><li> Formaldehyd Gel Preparation (1%) <ol><li> Skölj alla elektrofores utrustning med dietylpyrokarbonat (DEPC) vatten. </li><li> Smält 2,5 g agaros i 215 ml DEPC vatten helt i en mikrovågsugn. </li><li> Lägg 12,5 ml 10x 3- (N- morfolino) propansulfonsyra (MOPS) buffert och 22,5 ml 37% formaldehyd. </li><li> Häll den i elektroforesapparaten med en 1,5 mm tjock kam. </li><li> Eliminera bubblor eller tryck tfåll till kanterna av gelén med en ren kam. </li><li> Tillåt gelén stelna vid rumstemperatur. </li></ol></li><li> prov~~POS=TRUNC <ol><li> Blanda 1-10 pg av total RNA och 11,3 mikroliter provbuffert. </li><li> Blanda 2 mikrogram av RNA-markör (1 mikrogram / mikroliter) med 11,3 mikroliter av provbufferten. </li><li> Lägg nukleasfritt vatten till proverna från 2.2.1 och 2.2.2 till en total volym av 16 mikroliter. </li><li> Värm vid 60 ° C under 5 min, och sedan kyla på is. </li><li> Blanda 16 mikroliter av provet från 2.2.3 med fyra mikroliter av spårning färgämne, som innehåller 0,1 pg / pL etidiumbromid på is. VARNING: Etidiumbromid är möjligen teratogent och giftig vid inandning. Läs etidiumbromid säkerhetsdatablad. </li></ol></li><li> Elektrofores <ol><li> Tillsätt 200 ml av 10x MOPS buffert till 1800 ml DDH 2 O för att göra en 1x MOPS löpbufferten. </li><li> Använd 1x MOPS löpbufferten att skölja brunnarna i gelen. </li><li> Pre-run than gel vid 20 V under 5 min. </li><li> Ladda de RNA-prover i brunnarna hos gelén. </li><li> Täck med folie för att undvika ljusexponering. Kördes vid 35 V under cirka 17 timmar (över natten) </li><li> Undersök och fotografera gel under en UV-ljus. </li></ol></li><li> Överföring <ol><li> Skär gel för att avlägsna den oanvända delen. </li><li> Förbereda 500 ml 10x SSC-buffert (250 ml 20x SSC-buffert och 250 ml DEPC vatten). </li><li> Tvätta gelén två gånger med 10x SSC-buffert under 20 min med skakning vid 50 rpm. </li><li> Skär en filterpappersarket tillräckligt stor för att fungera som en veke papper, som absorberar överföringsbuffert från överföringsbrickan (Figur 1). </li><li> Klipp 4 bitar av filterpapper för att i samma storlek som gelén. </li><li> Skära ett ark av positivt laddade nylonmembran till samma storlek som gelén. </li><li> Markera ett hack på gelén och membranet som en markör för att säkerställa rätt orientering. </li><li> Blötlägg membranet i 2 x SSC-buffert under 15 min. </li><li> Häll 500 ml of 10x SSC-buffert i överföringsbrickan. </li><li> Lägga stora filterpappersarket tvärs över glasplatta och väta filterpappret med överföringsbuffert. </li><li> Rulla ut eventuella bubblor med en pipett. </li><li> Blötlägg 2 bitar av pre-cut filterpapper i överföringsbuffert och placera dem i mitten av filterpapper från steg 2.4.5. Avlägsna eventuella bubblor. </li><li> Lade sig på filterpapper gel ovansidan. </li><li> Lägga membranet på toppen av gelén. Rikta in skårorna av gelén och membranet. </li><li> Placera 2 st pre-cut filterpapper ovanpå membranet och väta filterpapper med överföringsbuffert. </li><li> Avlägsna eventuella bubblor mellan skikten. </li><li> Tillämpa plastfolie runt gelén för att säkerställa att de handdukar endast suga upp buffert som passerar genom gelén och membranet. </li><li> Stapla pappershanddukar ovanpå filterpapperet. </li><li> Placera en överdimensionerad glasplatta på toppen av handdukar. </li><li> Placera en vikt på toppen av stacken. </li><li>Hålla över natten för att göra det möjligt för RNA för att överföra från gelén till membranet. </li></ol></li></ol> 3. Detektion av N 6 -methyladenosine <ol><li> membran Tvärbindning <ol><li> Hålla membranet fuktig i 2 x SSC-buffert. </li><li> Placera 2 ark av filterpapper nedsänkt med 10x SSC-buffert i UV tvärbindningsmedel. </li><li> Placera membranet ovanpå filterpapperet, med RNA-adsorberade vänd uppåt. </li><li> Välj &quot;autocrosslink läge&quot; (120.000 μJ) och tryck på &quot;Start&quot; -knappen för att starta bestrålningen. </li><li> Undersök membranet och gelén med en UV-gel bildfångaren för att bekräfta RNA överföring från gelén till membranet. </li></ol></li><li> Immunblotting <ol><li> Blockera membranet i 5% fettfri mjölk i Tris-buffrad saltlösning med Tween 20 (TBST) buffert vid rumstemperatur under 1 timme. </li><li> Tvätta tre gånger med TBST-buffert under 15 min. </li><li> Inkubera membranet över natten i m 6 A (&lt;em&gt; N 6 -methyladenosine) antikroppslösning (1: 1000 i 5% fettfri mjölk TBST-buffert) vid 4 ° C. </li><li> Tvätta membranet tre gånger med TBST-buffert under 15 min. </li><li> Inkubera membranet i HRP-konjugerad åsne-anti-kanin-antikropp-lösning (1: 2000 i 5% fettfri mjölk TBST-buffert) under 1 h vid rumstemperatur. </li><li> Tvätta membranet tre gånger med TBST-buffert under 15 min. </li><li> Applicera den förstärkta kemiluminiscerande substrat (0,125 ml per cm 2 av membran). </li><li> Fånga kemiluminescensen med de optimala inställningarna för den digitala imager, enligt tillverkarens instruktioner 26. </li></ol></li><li> m 6 En Kvantifiering <ol><li> Mäta den relativa m 6 En kemiluminiscent intensitet med hjälp av ImageJ programvara. <ol><li> Under ImageJ programvara menyn, välj &quot;File&quot; för att öppna den aktuella filen. </li><li> Välj &quot;Rektangel&quot; verktyg från ImageJ och rita en ram runtsignalerna. </li><li> Om ribosomalt RNA är inte i fokus för experimenten, undvika 18S och 28S ribosomalt RNA m 6 A band för beräkningen. </li><li> Klicka på &quot;Command&quot; och &quot;1&quot; för att bekräfta den valda körfält. </li><li> Tryck på &quot;Command&quot; och &quot;3&quot; för att visa den valda tomten. </li><li> Klicka på &quot;Straight&quot; verktyg och dra linjer för att skilja den segmenterade området. </li><li> Klicka på &quot;Wand&quot; verktyg för att registrera mätningarna. </li><li> Exportera data. </li><li> Normalisera nivåer av m 6 A med 18S ribosomala RNA-band från etidiumbromidfärgning. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Thammana, P., Held, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylation+of+16S+RNA+during+ribosome+assembly+in+vitro.">Methylation of 16S RNA during ribosome assembly in vitro.</a> Nature. 251 (5477), 682-686 (1974).</li><li>Meyer, K. D., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+epitranscriptome:+N6-methyladenosine+and+gene+expression+control.">The dynamic epitranscriptome: N6-methyladenosine and gene expression control.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (5), 313-326 (2014).</li><li>Niu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N6-methyl-adenosine+(m6A)+in+RNA:+an+old+modification+with+a+novel+epigenetic+function.">N6-methyl-adenosine (m6A) in RNA: an old modification with a novel epigenetic function.</a> Genomics Proteomics Bioinformatics. 11 (1), 8-17 (2013).</li><li>Wang, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+FTO+in+adipose+tissue+decreases+Angptl4+translation+and+alters+triglyceride+metabolism.">Loss of FTO in adipose tissue decreases Angptl4 translation and alters triglyceride metabolism.</a> Sci Signal. 8 (407), 127 (2015).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N6-methyladenosine-dependent+regulation+of+messenger+RNA+stability.">N6-methyladenosine-dependent regulation of messenger RNA stability.</a> Nature. 505 (7481), 117-120 (2014).</li><li>Berulava, T., Rahmann, S., Rademacher, K., Klein-Hitpass, L., Horsthemke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N6-adenosine+methylation+in+MiRNAs.">N6-adenosine methylation in MiRNAs.</a> PLoS One. 10 (2), 0118438 (2015).</li><li>Deng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+occurrence+of+N6-methyladenosine+in+bacterial+mRNA.">Widespread occurrence of N6-methyladenosine in bacterial mRNA.</a> Nucleic Acids Res. 43 (13), 6557-6567 (2015).</li><li>Dominissini, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+N-methyladenosine+methylome+in+eukaryotic+messenger+RNA.">The dynamic N-methyladenosine methylome in eukaryotic messenger RNA.</a> Nature. , (2016).</li><li>Fustin, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-methylation-dependent+RNA+processing+controls+the+speed+of+the+circadian+clock.">RNA-methylation-dependent RNA processing controls the speed of the circadian clock.</a> Cell. 155 (4), 793-806 (2013).</li><li>Geula, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells.+m6A+mRNA+methylation+facilitates+resolution+of+naive+pluripotency+toward+differentiation.">Stem cells. m6A mRNA methylation facilitates resolution of naive pluripotency toward differentiation.</a> Science. 347 (6225), 1002-1006 (2015).</li><li>Wang, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FTO+modulates+fibrogenic+responses+in+obstructive+nephropathy.">FTO modulates fibrogenic responses in obstructive nephropathy.</a> Sci Rep. , (2016).</li><li>Jia, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N6-methyladenosine+in+nuclear+RNA+is+a+major+substrate+of+the+obesity-associated+FTO.">N6-methyladenosine in nuclear RNA is a major substrate of the obesity-associated FTO.</a> Nat Chem Biol. 7 (12), 885-887 (2011).</li><li>Du, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+association+study+of+the+m6A+genes+with+major+depressive+disorder+in+Chinese+Han+population.">An association study of the m6A genes with major depressive disorder in Chinese Han population.</a> J Affect Disord. 183, 279-286 (2015).</li><li>Wang, C. Y., Yeh, J. K., Shie, S. S., Hsieh, I. C., Wen, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythm+of+RNA+N6-methyladenosine+and+the+role+of+cryptochrome.">Circadian rhythm of RNA N6-methyladenosine and the role of cryptochrome.</a> Biochem Biophys Res Commun. 465 (1), 88-94 (2015).</li><li>Wang, C. Y., Shie, S. S., Hsieh, I. C., Tsai, M. L., Wen, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FTO+modulates+circadian+rhythms+and+inhibits+the+CLOCK-BMAL1-induced+transcription.">FTO modulates circadian rhythms and inhibits the CLOCK-BMAL1-induced transcription.</a> Biochem Biophys Res Commun. 464 (3), 826-832 (2015).</li><li>Heyn, H., Esteller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Adenine+Code+for+DNA:+A+Second+Life+for+N6-Methyladenine.">An Adenine Code for DNA: A Second Life for N6-Methyladenine.</a> Cell. 161 (4), 710-713 (2015).</li><li>Xiao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+m(6)A+Reader+YTHDC1+Regulates+mRNA+Splicing.">Nuclear m(6)A Reader YTHDC1 Regulates mRNA Splicing.</a> Mol Cell. 61 (4), 507-519 (2016).</li><li>Meyer, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+analysis+of+mRNA+methylation+reveals+enrichment+in+3'+UTRs+and+near+stop+codons.">Comprehensive analysis of mRNA methylation reveals enrichment in 3' UTRs and near stop codons.</a> Cell. 149 (7), 1635-1646 (2012).</li><li>Horowitz, S., Horowitz, A., Nilsen, T. W., Munns, T. W., Rottman, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+N6-methyladenosine+residues+in+bovine+prolactin+mRNA.">Mapping of N6-methyladenosine residues in bovine prolactin mRNA.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (18), 5667-5671 (1984).</li><li>Resnick, R. J., Noreen, D., Munns, T. W., Perdue, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+N6-methyladenosine+in+expression+of+Rous+sarcoma+virus+RNA:+analyses+utilizing+immunoglobulin+specific+for+N6-methyladenosine.">Role of N6-methyladenosine in expression of Rous sarcoma virus RNA: analyses utilizing immunoglobulin specific for N6-methyladenosine.</a> Prog Nucleic Acid Res Mol Biol. 29, 214-218 (1983).</li><li>Golovina, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+site-specific+detection+of+m6A+nucleoside+presence+in+RNA+based+on+high-resolution+melting+(HRM)+analysis.">Method for site-specific detection of m6A nucleoside presence in RNA based on high-resolution melting (HRM) analysis.</a> Nucleic Acids Res. 42 (4), 27 (2014).</li><li>Dominissini, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topology+of+the+human+and+mouse+m6A+RNA+methylomes+revealed+by+m6A-seq.">Topology of the human and mouse m6A RNA methylomes revealed by m6A-seq.</a> Nature. 485 (7397), 201-206 (2012).</li><li>Linder, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-nucleotide-resolution+mapping+of+m6A+and+m6Am+throughout+the+transcriptome.">Single-nucleotide-resolution mapping of m6A and m6Am throughout the transcriptome.</a> Nat Methods. 12 (8), 767-772 (2015).</li><li>Fu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Quantification+of+Methylated+Cytidine+and+Adenosine+in+Cellular+and+Tissue+RNA+by+Nano-Flow+Liquid+Chromatography-Tandem+Mass+Spectrometry+Coupled+with+the+Stable+Isotope-Dilution+Method.">Simultaneous Quantification of Methylated Cytidine and Adenosine in Cellular and Tissue RNA by Nano-Flow Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Coupled with the Stable Isotope-Dilution Method.</a> Anal Chem. 87 (15), 7653-7659 (2015).</li><li>Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nondenaturing+agarose+gel+electrophoresis+of+RNA.">Nondenaturing agarose gel electrophoresis of RNA.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010 (6), 5445 (2010).</li><li>Wang, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FTO+modulates+fibrogenic+responses+in+obstructive+nephropathy.">FTO modulates fibrogenic responses in obstructive nephropathy.</a> Sci Rep. 6, 18874 (2016).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+mapping+reveals+reversible+and+dynamic+N-methyladenosine+methylome.">Transcriptome-wide mapping reveals reversible and dynamic N-methyladenosine methylome.</a> Nat Chem Biol. , (2016).</li><li>Sanschagrin, S., Yergeau, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+sequencing+of+16S+ribosomal+RNA+gene+amplicons.">Next-generation sequencing of 16S ribosomal RNA gene amplicons.</a> J Vis Exp. (90), (2014).</li><li>Kukutla, P., Steritz, M., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+ribosomal+RNA+for+mosquito+gut+metagenomic+RNA-seq.">Depletion of ribosomal RNA for mosquito gut metagenomic RNA-seq.</a> J Vis Exp. (74), (2013).</li><li>Mishima, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immuno-Northern+Blotting:+Detection+of+RNA+Modifications+by+Using+Antibodies+against+Modified+Nucleosides.">Immuno-Northern Blotting: Detection of RNA Modifications by Using Antibodies against Modified Nucleosides.</a> PLoS One. 10 (11), 0143756 (2015).</li><li>Klungland, A., Dahl, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+RNA+modifications+in+disease.">Dynamic RNA modifications in disease.</a> Curr Opin Genet Dev. 26, 47-52 (2014).</li></ol>

Författarna har ingenting att lämna ut.

Modifications of RNA have important roles in cellular function and physiology. The current understanding of the regulation, function, and homeostasis of these modifications is still being explored and expanded8. Therefore, a precise and gold-standard method to evaluate the modifications of RNA is needed. The modified northern blotting method provides precise quantification of RNA modifications and clear delineation of the modifications in diverse RNAs. Although the method requires at least 3 days, it can be standardized and can be used in various experimental designs. Moreover, with different antibodies, it can detect different RNA modifications27.
It is important to separate different RNAs when analyzing RNA modifications. Ribosomal RNA comprises a large portion of the total amount of RNA28,29. The results from analyzing RNA modifications only in total RNA will represent mostly the changes of rRNA. Methylation and other such modifications of rRNA could potentially mask the changes in other RNAs. With the procedure of gel separation, the modifications of mRNA and other small RNAs can be more accurately analyzed.
Transcriptome-wide mapping with m6A immunoprecipitation and sequencing provides detailed insight into the modification of each type of RNA22. It provides information on the specific RNAs and a resolution of around 80-120 bp. Although m6A-Seq can compare the modifications between different experimental conditions, the selection of proper standards and controls for such experiments is difficult18. Immunoprecipitation is difficult to reproduce, often giving significant variations amongst repeats. Moreover, m6A-Seq requires the fragmentation of RNA samples before immunoprecipitation and sequencing30. The fragmentation process could potentially induce undue influences on the original RNA modifications. If the experiment does not need the specific gene's information but requires different conditions for comparison, the current method provides better visualization and control for diverse experimental setups. 
Modification of RNA is an important step in regulating transcriptional control31. However, the homeostasis and the regulatory mechanisms of various RNA modifications under diverse physiological realms are still unclear. Using the present modified northern blotting method, different RNA modifications can be quantified and compared. Furthermore, the changes and regulations of RNA modifications can be investigated in greater detail. In the future, it could also be possible to combine the experimental data from both the classical northern blotting and the modified northern blotting protocols, providing greater insights into RNA biology.
The most important factor determining the success of the modified northern blotting protocol is the integrity of the RNA sample. RNAs with some amount of degradation may yield good classical northern blotting results, but this could potentially have significant impact on the modified northern blotting results. The modifications of RNA in different tissues or cell lines could also vary significantly. It is important to test the suitable RNA sample loads for different tissues before performing the final experiments.
As blotting procedures have been traditionally named after Dr. Southern and different geographical directions, we propose the name "northeastern" blotting for the current technique.

Dynamic and reversible RNA modifications have important roles in RNA homeostasis. Four decades ago, N6-methyladenosine (m6A) modifications were found to be abundant in eukaryotic transcriptomes1. They have diverse functions in messenger RNA (mRNA), ribosomal RNA (rRNA), small nucleolar RNA, transfer RNA, and microRNA2. The m6A modifications of mRNA influence their splicing3, translation4, degradation5, and localization2. Moreover, they affect ribosome biogenesis and microRNA function6. The evolutionary conservation of m6A modifications of RNA is noted in unicellular bacteria to multi-cellular humans7. Delineation of the roles of m6A modifications is currently under extensive exploration. The efforts are expected to provide new insights into transcription control. Recent studies reveal that other chemical modifications of mRNA8 also play critical roles in RNA metabolism. 
Circadian rhythms9, stem cell pluripotency10, triglyceride metabolism4, fibrosis11, obesity12, and major depression13 are a few examples of processes where m6A modifications are known to control outcomes. Many circadian clock gene transcripts have m6A sites14. Modulation of m6A methylase or demethylase elicits circadian period changes15. Mettl3, an m6A transferase, is a regulator for stem cell pluripotency. A deficiency of Mettl3 leads to early embryonic lethality and aberrant lineage priming at the post-implantation stage10. A deficiency of fat mass- and obesity-associated (FTO), an m6A demethylase, in adipocytes affects fatty acid mobilization and body weight through posttranscriptional regulation of Angptl44. These studies reveal that m6A not only controls mRNA processing, but also plays critical roles in embryological development and patho-physiology. The function of m6A modifications holds implications for therapeutic considerations in the future.
Several methods are available to measure m6A modifications of RNA16-18. Traditionally, thin layer chromatography (TLC) and high-performance liquid chromatography (HPLC) are used to study the distribution of m6A in several RNAs19,20. Mass spectrometry is a sensitive tool for the detection of m6A modifications in RNA. However, the RNA needs to be excised by RNase into short fragments before analysis by mass spectrometry21. Methyl-RNA immunoprecipitation and sequencing (m6A-Seq)22 immunoprecipitates fragmented RNAs with m6A-specific antibodies and performs parallel RNA sequencing. This method generates transcriptome-wide m6A landscapes. High-resolution mapping of m6A individual-nucleotide-resolution cross-linking and immunoprecipitation (miCLIP) further maps m6A modifications at a single-nucleotide resolution23. Both methods provide details of m6A modification across the whole transcriptome, with specific genes' information. However, quantifications and standardization in both methods are difficult if experiments require the comparison of multiple conditions. Moreover, fragmentations of RNA for m6A-Seq alter the original RNA structure, which may affect native m6A levels. To detect global m6A modifications of RNA and their changes under different experimental conditions, we report a method that employs a modified northern blotting protocol. This method resolves RNA by molecular weight, using gel electrophoresis18. This procedure provides better standardization and quantifications for experiments that involve multiple conditions or samples. It also provides specific m6A modification information for different RNAs, whether rRNA, mRNA, or microRNA.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="598">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RNaseZap solution</td>
			<td style="width:96px;">Ambion</td>
			<td style="width:119px;">AM9782</td>
			<td style="width:167px;">Protocol 1.1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TRI Reagent solution</td>
			<td style="width:96px;">Ambion</td>
			<td style="width:119px;">AM9738</td>
			<td>Protocol 1.2.1.1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">1-Bromo-3-chloropropane (BCP)</td>
			<td style="width:96px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">B9673</td>
			<td>Protocol 1.2.1.3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethanol</td>
			<td style="width:96px;">JTbaker</td>
			<td style="width:119px;">8006</td>
			<td>Protocol 1.2.1.3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:96px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">I9516</td>
			<td>Protocol 1.2.1.3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GenElute mRNA Miniprep Kit</td>
			<td style="width:96px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">MRN70</td>
			<td>Protocol 1.2.2.1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glycogen</td>
			<td style="width:96px;">Ambion</td>
			<td style="width:119px;">AM9510</td>
			<td>Protocol 1.2.2.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium acetate</td>
			<td style="width:96px;">Fluka</td>
			<td style="width:119px;">71183</td>
			<td>Protocol 1.2.2.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nuclease-free water</td>
			<td style="width:96px;">Ambion</td>
			<td style="width:119px;">AM9930</td>
			<td>Protocol 1.2.2.6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DEPC</td>
			<td style="width:96px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D5758</td>
			<td>Protocol 2.1.1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Agarose</td>
			<td style="width:96px;">JT Baker</td>
			<td style="width:119px;">A426</td>
			<td>Protocol 2.1.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MOPS</td>
			<td style="width:96px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M1254</td>
			<td>Protocol 2.1.3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">37% formaldehyde Solution</td>
			<td style="width:96px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">F8775</td>
			<td>Protocol 2.1.3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EDTA, Disodium Salt</td>
			<td style="width:96px;">JT Baker</td>
			<td style="width:119px;">8993</td>
			<td>Protocol 2.1.3 10X MOPS buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">formamide</td>
			<td style="width:96px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">F7503</td>
			<td>Protocol 2.2.1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RNA Millennium Marker</td>
			<td style="width:96px;">Ambion</td>
			<td style="width:119px;">AM7150</td>
			<td>Protocol 2.2.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethidium Bromide</td>
			<td style="width:96px;">Amresco</td>
			<td style="width:119px;">X328</td>
			<td>Protocol 2.2.5</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ficoll 400</td>
			<td style="width:96px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">17-0300-10</td>
			<td>Protocol 2.2.5 tracking dye</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bromophenol blue</td>
			<td style="width:96px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">114391</td>
			<td>Protocol 2.2.5 tracking dye</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Xylene Cyanol</td>
			<td style="width:96px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">X4126</td>
			<td>Protocol 2.2.5 tracking dye</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:96px;">JT Baker</td>
			<td style="width:119px;">3624</td>
			<td>Protocol 2.4.2 20X SSC buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trisodium citrate</td>
			<td style="width:96px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S1804</td>
			<td>Protocol 2.4.2 20X SSC buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">filter paper</td>
			<td style="width:96px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">RPN6101M</td>
			<td>Protocol 2.4.4</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">GE Hybond-N+ membrane</td>
			<td style="width:96px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">RPN303B</td>
			<td>Protocol 2.4.6</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Stratalinker UV Crosslinker 2400</td>
			<td style="width:96px;">Stratagene</td>
			<td style="width:119px;">400075</td>
			<td>Protocol 3.1.2</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Gel Catcher 1500</td>
			<td style="width:96px;">ANT Technology</td>
			<td style="width:119px;">Gel Catcher 1500</td>
			<td>Protocol 3.1.5</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anti-m6A (N6-methyladenosine)</td>
			<td style="width:96px;">Synaptic Systems</td>
			<td style="width:119px;">202003</td>
			<td>Protocol 3.2.3</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Amersham ECL Anti-Rabbit IgG, HRP-linkd whole Ab</td>
			<td style="width:96px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">NA934</td>
			<td>Protocol 3.2.5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ChemiDoc MP System</td>
			<td style="width:96px;">BIO-RAD</td>
			<td style="width:119px;">1708280</td>
			<td>Protocol 3.2.8</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method for measuring rna n6-methyladenosine modifications in cells and tissues

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies have revealed that these reversible RNA modifications affect RNA splicing, translation, degradation, and localization. Multiple physiological processes, like circadian rhythms, stem cell pluripotency, fibrosis, triglyceride metabolism, and obesity are also controlled by m6A modifications. Immunoprecipitation/sequencing, mass spectrometry, and modified northern blotting are some of the methods commonly employed to measure m6A modifications. Herein, we present a northeastern blotting technique for measuring m6A modifications. The current protocol provides good size separation of RNA, better accommodation and standardization for various experimental designs, and clear delineation of m6A modifications in various sources of RNA. While m6A modifications are known to have a crucial impact on human physiology relating to circadian rhythms and obesity, their roles in other (patho)physiological states are unclear. Therefore, investigations on m6A modifications have immense possibility to provide key insights into molecular physiology.

Efter 14 dagar i normal ljus-mörker cirkadiska fasen ades vildtyp möss placeras i konstant mörker. De RNA från levern samplas med 4 timmars intervall och studerade med modifierad Northern blotting. Metyleringen av rRNA, mRNA, och små RNA tydligt detekteras (figur 2). Jämförelsen mellan olika dygnsrytm gånger (CT) exakt kan beräknas med 18S rRNA-standarden. Det var stark dygnsrytm svängning m 6 A nivåer i rRNA, mRNA, och små RNA. För att undvika interferensen erbjudna av rRNA kan polyadenylerade RNAs renas, såsom i steg 1.2.2. Efter rening, kan den rRNA i stor utsträckning elimineras för att möjliggöra bättre visualisering av andra RNA (figur 3). <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/54672/54672fig1.jpg" /> <stron<html> g&gt; Figur 1: Montera blot överföringsenheten. Kapillären överföringsenheten för blotting av RNA till membranet visas. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54672/54672fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> <img alt="figur 2" src="/files/ftp_upload/54672/54672fig2.jpg" /> Figur 2: dygnsrytmen av de m 6 A nivåer i C57BL / 6J-möss. Denna figur visar den m 6 En blöt av totalt RNA från lever av vildtyp möss avlivades på den första dagen i den mörka-mörka fasen efter 14 dagar av en normal ljus-mörker-fasen vid 4 timmars intervall. Kvantifieringen utfördes med användning av m 6 En bild densitetsskillnad mellan 18S och 28S rRNA. M 6 Ett överflöd normaliserades till 18S rRNA-bandet från den formaldehydgel längst ner.et = &quot;_ blank&quot;&gt; Klicka här för att se en större version av denna siffra. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54672/54672fig3.jpg" /> Figur 3: m 6 A blottar med eller utan rRNA. Representativ m 6 A blottar av totalt RNA och polyadenylerad RNA från lever av vildtyp möss visas. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54672/54672fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 1 </td><td colspan="3"> 10x MOPS-buffert (pH 7,0, skydda mot ljus) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> MOPS </td><td> 41,85 </td><td> g </td><td> 0,2 M </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> Natriumacetat </td><td> 4,1 </td><td> g </td><td>0,05 M </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> EDTA, dinatriumsalt </td><td> 3,7 </td><td> g </td><td> 0,01 M </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> DEPC vatten </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> Total </td><td> 1 </td><td> L </td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> Rör om vid rumstemperatur </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2 </td><td colspan="3"> 20x SSC-buffert (pH 7,0) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> Natriumklorid </td><td> 175,3 </td><td> g </td><td> 3 M </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> trinatriumcitrat </td><td> 88,3 </td><td> g </td><td> 0,3 M </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> DEPC vatten </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> Total </td><td> 1 </td><td> L </td><td></td&gt; </tr><tr><td></td><td colspan="3"> Rör om vid rumstemperatur, sedan autoklavera </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 3 </td><td colspan="3"> spårnings Dye </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> 10x MOPS-buffert </td><td> 500 </td><td> mikroliter </td><td> 1x </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> Ficoll 400 </td><td> 0,75 </td><td> g </td><td> 15% </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> bromfenolblått </td><td> 0,01 </td><td> g </td><td> 0,2% </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> xylencyanol </td><td> 0,01 </td><td> g </td><td> 0,2% </td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> DEPC vatten </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> Total </td><td> 5 </td><td> ml </td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> Förvara vid -20 ° C </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 4 </td><td colspan="3"> DEPC vatten </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> Späd uppgick vid 1: 1000 av DEPC i DDH 2 O </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> Rör om över natt vid rumstemperatur, sedan autoklavera </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 5 </td><td colspan="3"> Provbuffert (skydda från ljus) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> 10x MOPS-buffert </td><td> 200 </td><td> mikroliter </td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> 37% formaldehyd </td><td> 270 </td><td> mikroliter </td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> formamid </td><td> 660 </td><td> mikroliter </td><td></td></tr><tr><td></td><td colspan="3"> Förvara vid -20 ° C </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody&gt; </table> Tabell 1: Buffertar och lösningar.

Watch this Scientific Journal Video about A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues at JoVE.com

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

En modifierad Northern blotting metod för att mäta N 6 -methyladenosine (m 6 A) förändringar i RNA beskrivs. Den nuvarande metoden kan detektera ändringar i olika RNA och kontroller under olika experimentell design.

En metod för mätning av RNA<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -methyladenosine Ändringar i celler och vävnader

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

En effektiv metod för isolering av högrenat RNA från frön för användning i kvantitativ transkriptom analys

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

A Method for Measuring Metabolism in Sorted Subpopulations of Complex Cell Communities Using Stable Isotope Tracing

En metod för att mäta Metabolism i Sorterade subpopulationer av komplexa cell gemenskapernas Använda stabila isotopen Tracing

Mammalian cell types exhibit specialized metabolism, and there is ample evidence that various co-existing cell types engage in metabolic cooperation. ...

Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications

Isolering av intermediära filamentproteiner från flera musvävnader för att studera åldringsrelaterade posttranslationella modifieringar

Intermediate filaments (IFs), together with actin filaments and microtubules, form the cytoskeleton &#8211; a critical structural element of every cell. ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Provberedning för Mass Spectrometry-baserade identifiering av RNA-bindande regioner

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

En kolorimetrisk metod för att mäta järnhalten i växter

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

Toeprinting analys av översättning inledande komplexa bildande på däggdjur mRNA

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Dissipativa Microgravimetry att studera bindande dynamiken i den fosfolipid bindande proteinet Annexin A2 till Solid-stödda Lipid lipidmonolager med en kvarts Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

Mäta och tolka syre förbrukning helt flyga Head segment

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

Fluorescent Visualization of Mango-tagged RNA in Polyacrylamide Gels via a Poststaining Method

Fluorescerande visualisering av mango-Tagged RNA i polyakrylamidgeler via en Efterfärgnings metod

Native and denaturing polyacrylamide gels are routinely used to characterize ribonucleoprotein (RNP) complex mobility and to measure RNA size, ...

Quantification of Coenzyme A in Cells and Tissues

Kvantifiering av coenzym A i celler och vävnader

Emerging research has revealed that the cellular coenzyme A (CoA) supply can become limiting with a detrimental impact on growth, metabolism and survival. ...