Name: assessing retinal microglial phagocytic function in vivo using a flow cytometry-based assay
Uploaded: 2016-10-18T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay at JoVE.com

Salome Murinello is supported by American Diabetes Association grant #1-16-PDF-072. This work was supported by grants to Martin Friedlander from the National Institutes of Health (National Eye Institute EY11254 and EY22025) and the Lowy Medical Research Institute.

Tous les animaux ont été traités en conformité avec les lignes directrices éthiques établies par l&#39;Institut de recherche Scripps. 1. Préparation du matériel pour injection <ol><li> Stériliser une aiguille de 33 G et la seringue: démonter et autoclave à 115 ο C. Préparer des aiguilles d&#39;injection par l&#39;augmentation dans une solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS). </li><li> Décongeler les particules marquées par fluorescence à température ambiante pendant 5...

<ol>
	<li>Gomez-Nicola, D., Perry, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+dynamics+and+role+in+the+healthy+and+diseased+brain:+a+paradigm+of+functional+plasticity.">Microglial dynamics and role in the healthy and diseased brain: a paradigm of functional plasticity.</a> Neuroscientist. 21, 169-184 (2015).</li><li>Tremblay, M. E., Lowery, R. L., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+interactions+with+synapses+are+modulated+by+visual+experience.">Microglial interactions with synapses are modulated by visual experience.</a> PLoS Biol. 8, e1000527 (2010).</li><li>Schafer, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+sculpt+postnatal+neural+circuits+in+an+activity+and+complement-dependent+manner.">Microglia sculpt postnatal neural circuits in an activity and complement-dependent manner.</a> Neuron. 74, 691-705 (2012).</li><li>Sierra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+shape+adult+hippocampal+neurogenesis+through+apoptosis-coupled+phagocytosis.">Microglia shape adult hippocampal neurogenesis through apoptosis-coupled phagocytosis.</a> Cell Stem Cell. 7, 483-495 (2010).</li><li>Sierra, A., Abiega, O., Shahraz, A., Neumann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Janus-faced+microglia:+beneficial+and+detrimental+consequences+of+microglial+phagocytosis.">Janus-faced microglia: beneficial and detrimental consequences of microglial phagocytosis.</a> Front Cell Neurosci. 7 (6), (2013).</li><li>Chan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD33+modulates+TREM2:+convergence+of+Alzheimer+loci.">CD33 modulates TREM2: convergence of Alzheimer loci.</a> Nat Neurosci. 18, 1556-1558 (2015).</li><li>Murinello, S., Mullins, R. F., Lotery, A. J., Perry, V. H., Teeling, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fcgamma+receptor+upregulation+is+associated+with+immune+complex+inflammation+in+the+mouse+retina+and+early+age-related+macular+degeneration.">Fcgamma receptor upregulation is associated with immune complex inflammation in the mouse retina and early age-related macular degeneration.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, 247-258 (2014).</li><li>Ransohoff, R. M., Perry, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+physiology:+unique+stimuli,+specialized+responses.">Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses.</a> Annu Rev Immunol. 27, 119-145 (2009).</li><li>Derecki, N., Cronk, J., Kipnis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+of+phagocytic+function+in+primary+murine+microglia.">Assay of phagocytic function in primary murine microglia.</a> Protoc Exchange. , (2012).</li><li>Fricker, M., Oliva-Martin, M. J., Brown, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+phagocytosis+of+viable+neurons+by+microglia+activated+with+LPS+or+Abeta+is+dependent+on+calreticulin/LRP+phagocytic+signalling.">Primary phagocytosis of viable neurons by microglia activated with LPS or Abeta is dependent on calreticulin/LRP phagocytic signalling.</a> J Neuroinflammation. 9, 196 (2012).</li><li>Koenigsknecht-Talboo, J., Landreth, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+phagocytosis+induced+by+fibrillar+beta-amyloid+and+IgGs+are+differentially+regulated+by+proinflammatory+cytokines.">Microglial phagocytosis induced by fibrillar beta-amyloid and IgGs are differentially regulated by proinflammatory cytokines.</a> J Neurosci. 25, 8240-8249 (2005).</li><li>Neher, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+microglial+phagocytosis+is+sufficient+to+prevent+inflammatory+neuronal+death.">Inhibition of microglial phagocytosis is sufficient to prevent inflammatory neuronal death.</a> J Immunol. 186, 4973-4983 (2011).</li><li>Fricker, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MFG-E8+mediates+primary+phagocytosis+of+viable+neurons+during+neuroinflammation.">MFG-E8 mediates primary phagocytosis of viable neurons during neuroinflammation.</a> J Neurosci. 32, 2657-2666 (2012).</li><li>Mildner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+and+non-redundant+roles+of+microglia+and+myeloid+subsets+in+mouse+models+of+Alzheimer's+disease.">Distinct and non-redundant roles of microglia and myeloid subsets in mouse models of Alzheimer's disease.</a> J Neurosci. 31, 11159-11171 (2011).</li><li>Neher, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis+executes+delayed+neuronal+death+after+focal+brain+ischemia.">Phagocytosis executes delayed neuronal death after focal brain ischemia.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, E4098-E4107 (2013).</li><li>Perego, C., Fumagalli, S., De Simoni, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+pattern+of+expression+and+colocalization+of+microglia/macrophage+phenotype+markers+following+brain+ischemic+injury+in+mice.">Temporal pattern of expression and colocalization of microglia/macrophage phenotype markers following brain ischemic injury in mice.</a> J Neuroinflammation. 8, 174-174 (2011).</li><li>Preissler, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+microglial+phagocytosis+in+GPR34-deficient+mice.">Altered microglial phagocytosis in GPR34-deficient mice.</a> Glia. 63, 206-215 (2015).</li><li>Hughes, M. M., Field, R. H., Perry, V. H., Murray, C. L., Cunningham, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+the+degenerating+brain+are+capable+of+phagocytosis+of+beads+and+of+apoptotic+cells,+but+do+not+efficiently+remove+PrP(Sc),+even+upon+LPS+stimulation.">Microglia in the degenerating brain are capable of phagocytosis of beads and of apoptotic cells, but do not efficiently remove PrP(Sc), even upon LPS stimulation.</a> Glia. 58, 2017-2030 (2010).</li><li>Westenskow, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+flow+cytometry+to+compare+the+dynamics+of+photoreceptor+outer+segment+phagocytosis+in+iPS-derived+RPE+cells.">Using flow cytometry to compare the dynamics of photoreceptor outer segment phagocytosis in iPS-derived RPE cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 53, 6282-6290 (2012).</li><li>London, A., Benhar, I., Schwartz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retina+as+a+window+to+the+brain-from+eye+research+to+CNS+disorders.">The retina as a window to the brain-from eye research to CNS disorders.</a> Nat Rev Neurol. 9, 44-53 (2013).</li><li>Fritzenwanger, M., Jung, C., Goebel, B., Lauten, A., Figulla, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+short-term+systemic+hypoxia+on+phagocytosis,+cytokine+production,+and+transcription+factor+activation+in+peripheral+blood+cells.">Impact of short-term systemic hypoxia on phagocytosis, cytokine production, and transcription factor activation in peripheral blood cells.</a> Mediators Inflamm. , 429501 (2011).</li><li>Ragsdale, R. L., Grasso, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+spectrofluorometric+assay+for+quantitating+yeast+phagocytosis+in+cultures+of+murine+peritoneal+macrophages.">An improved spectrofluorometric assay for quantitating yeast phagocytosis in cultures of murine peritoneal macrophages.</a> J Immunol Methods. 123, 259-267 (1989).</li><li>Stokes, L., Surprenant, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+regulation+of+the+P2X4+receptor+in+alveolar+macrophages+by+phagocytosis+and+classical+activation.">Dynamic regulation of the P2X4 receptor in alveolar macrophages by phagocytosis and classical activation.</a> Eur J Immunol. 39, 986-995 (2009).</li><li>Kotani, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraoperative+modulation+of+alveolar+macrophage+function+during+isoflurane+and+propofol+anesthesia.">Intraoperative modulation of alveolar macrophage function during isoflurane and propofol anesthesia.</a> Anesthesiology. 89, 1125-1132 (1998).</li><li>Xu, X., Feng, J., Zuo, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoflurane+preconditioning+reduces+the+rat+NR8383+macrophage+injury+induced+by+lipopolysaccharide+and+interferon+gamma.">Isoflurane preconditioning reduces the rat NR8383 macrophage injury induced by lipopolysaccharide and interferon gamma.</a> Anesthesiology. 108, 643-650 (2008).</li><li>abd-el-Basset, E., Fedoroff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+bacterial+wall+lipopolysaccharide+(LPS)+on+morphology,+motility,+and+cytoskeletal+organization+of+microglia+in+cultures.">Effect of bacterial wall lipopolysaccharide (LPS) on morphology, motility, and cytoskeletal organization of microglia in cultures.</a> J Neurosci Res. 41, 222-237 (1995).</li><li>Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+protocols+for+surface+and+intracellular+antigen+analyses+of+neural+cell+types.">Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types.</a> J Vis Exp. , (2014).</li><li>Jackson, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+vulnerability+to+neurodegenerative+disease:+the+curious+case+of+Prion+Protein.">Selective vulnerability to neurodegenerative disease: the curious case of Prion Protein.</a> Dis Model Mech. 7, 21-29 (2014).</li><li>O'Koren, E. G., Mathew, R., Saban, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+mapping+reveals+that+microglia+and+recruited+monocyte-derived+macrophages+are+definitively+distinguishable+by+phenotype+in+the+retina.">Fate mapping reveals that microglia and recruited monocyte-derived macrophages are definitively distinguishable by phenotype in the retina.</a> Sci Rep. 6, 20636 (2016).</li><li>Usui, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+and+Eye+Disease.">Angiogenesis and Eye Disease.</a> Annu Rev Vision. 1, 155-184 (2015).</li></ol>

Il y a trois étapes critiques dans cette méthode: (1) l&#39;injection intravitréenne de particules marquées par fluorescence; (2) la récolte et la préparation du tissu rétinien; et (3) l&#39;écoulement analyse cytométrique. Nous recommandons que les chercheurs pratiquent des injections intravitréennes avant d&#39;effectuer la méthode que nous présentons ici. Souris albinos (par exemple, BALB / c) et une solution de couleur (par exemple, des particules marquées par fluorescence) peuvent êt...

L&#39;objectif global de cette méthode est d&#39;évaluer et de quantifier en phagocytose microgliale vivo avec précision. Les microglies sont les macrophages du système nerveux central (SNC) résidentes du tissu. Ils effectuent une variété de fonctions pour assurer le maintien de l&#39;homéostasie tissulaire. Ceux - ci comprennent la surveillance immunitaire, la sécrétion de facteurs neurotrophiques et, d&#39; une importance cruciale, la phagocytose 1. Phagocytose microgliale est la clé de plusieurs événements importants au cours du développement du cerveau et de la rétine, comme la phagocytose des synapses non pertinentes (élagage synaptique) et l&#39; élimination des neurones apoptotiques 2-4. En outre, la phagocytose microgliale de neurones endommagés ou apoptotiques, des débris cellulaires et des microbes envahisseurs a été révélée indispensable au maintien de l&#39; homéostasie du système nerveux central jusqu&#39;à l&#39; âge adulte 5. Enfin, la phagocytose microgliale a été impliquée dans la pathogenèse de plusieurs maladies neurodégénératives, dont la maladie d&#39;Alzheimer et liée à l&#39;âgela dégénérescence maculaire, où il a été suggéré que la capacité de phagocytose défectueuse ou insuffisante peut contribuer à l&#39;accumulation de l&#39; amyloïde ß (Aß) , des plaques et des druses, respectivement 6,7. fonction de la microglie est étroitement régulée par leur micro-environnement, notamment par des facteurs solubles tels que le facteur β de croissance tumorale ou les interactions cellule-cellule. Les neurones expriment constitutivement plusieurs ligands de surface cellulaire, tels que le CD200 et CX3CL1, tandis que les microglies expriment exclusivement les récepteurs respectifs CD200R et CX3CR1. Ces récepteurs contiennent immunorécepteur motifs d&#39;inhibition à base de tyrosine (ITIM) dans leur partie intracellulaire. Ces récepteurs inhibiteurs sont essentiels pour empêcher la sur-stimulation de la microglie, ce qui peut contribuer à une neuroinflammation. Ainsi, dans des conditions physiologiques normales, les interactions cellule-cellule entre les neurones et les microglies garder microglie dans un état de repos. Pendant une lésion tissulaire, cependant, les neurones peuvent réguler vers le bas expression de ces ligands, en supprimant leur effet inhibiteur sur la microglie activation. Fonction microglial (y compris la phagocytose) est donc étroitement liée à leur microenvironnement 8. Néanmoins, à ce jour, il n&#39;y a pas des tests standardisés pour étudier la microglie phagocytose dans un contexte physiologique ou d&#39;une manière qui reproduit pleinement leur microenvironnement CNS. Plusieurs dosages ont été développés pour mesurer l&#39; activité phagocytaire des microglies in vitro, où les cellules microgliales primaires ou de lignées de cellules microgliales sont cultivées avec des cellules cibles (par exemple, les neurones apoptotiques) ou des billes marquées par fluorescence. L&#39; absorption de la cible est alors déterminée en utilisant la microscopie à imagerie de fluorescence ou cytométrie de flux 12/09. Ces essais permettent de tester comment la manipulation pharmacologique ou génétique peut affecter la phagocytose microgliale et, tandis que d&#39; information, ne parviennent pas à répliquer totalement le complexe dans un environnement in vivo. Les méthodes indirectes pour l&#39;examen de la phagocytose microglialein vivo ont été rapportés: ceux - ci sont réalisés par coloration des molécules censées être impliquées dans la phagocytose (par exemple, CD68), l&#39; évaluation de la proximité physique des microglies et des cibles pour la phagocytose (par exemple, des neurones compromis ou éléments synaptiques), soit par détection immunohistochimique de phagocytose cibles dans les cellules microgliales (par exemple, Aß) 13-17. Deux études ont utilisé des approches plus directes pour évaluer la microglie phagocytose in vivo. Hughes et ses collègues ont utilisé des techniques d&#39;imagerie pour mesurer l&#39; absorption de la microglie de perles livrées par voie intracrânienne 18. Sierra et al. A développé une méthode raffinée pour évaluer quantitativement la microglie phagocytose des cellules apoptotiques en utilisant des techniques d&#39;imagerie complexes 4. Cependant, ces procédés impliquent des protocoles compliqués pour la préparation des tissus, le sectionnement, l&#39;imagerie et l&#39;analyse. Nous avons déjà utilisé une analyse de cytométrie de flux pour évaluer la phagocytose du photorécepteur surer segments de cellules rétiniennes épithélium pigmentaire (RPE) dans la culture 19. Ici, nous décrivons un protocole pour évaluer rapidement l&#39; absorption de particules marquées par fluorescence par microglie rétiniennes comme une mesure quantitative de la microglie in vivo phagocytose. Le protocole que nous décrivons ici permet une mesure fiable et quantitative de la phagocytose microgliale rétinienne dans un peu moins de six heures en trois étapes essentielles: (1) la livraison de intravitréenne de particules marquées par fluorescence, (2) la récolte et la préparation du tissu rétinien, et (3) Flux l&#39;analyse cytométrique. La méthode que nous avons mis au point une méthode robuste pour évaluer la phagocytose microgliale dans la rétine, et il peut être utilisé avec succès pour tester la façon dont divers composés ou manipulation génétique modifient cette fonction clé dans la microglie paramètres physiologiques. En tant que domaine spécialisé de la CNS, la rétine est un système modèle facilement accessible pour étudier la fonction de microglies 20. Bien que cette méthode a été développée en til oeil, nous croyons qu&#39;il peut être utile pour tous les neuroscientifiques enquête fonction microglie phagocytaire.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Discontinued</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton&#160;syringe, 600 series</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>26702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>33 gauge, Small Hub RN NDL, 0.5 in, point style 4 - 12o</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7803-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymosan A (S. cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Z-23373</td>
			<td>Prepare immediately before injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-030-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5/45 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-35</td>
			<td>Need two</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5SF Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors - 3mm Cutting Edge</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-10</td>
			<td>Curved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neural Tissue Dissociation Kit &#8211; Postnatal Neurons</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-094-802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Polystyrene Round-bottom Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well U-bottom plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stain Buffer (BSA)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b-BV650 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>101259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ly6C-APC-Cy7</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>128025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ly6G-PE-Cy7</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>127617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>556463</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified anti-mouse CD16/32 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>101301</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing retinal microglial phagocytic function in vivo using a flow cytometry-based assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, including phagocytosis of damaged synapses or cells, debris, and/or invading pathogens. Impaired phagocytic function has been implicated in the pathogenesis of diseases such as Alzheimer's and age-related macular degeneration, where amyloid-&#946; plaque and drusen accumulate, respectively. Despite its importance, microglial phagocytosis has been challenging to assess in vivo. Here, we describe a simple, yet robust, technique for precisely monitoring and quantifying the in vivo phagocytic potential of retinal microglia. Previous methods have relied on immunohistochemical staining and imaging techniques. Our method uses flow cytometry to measure microglial uptake of fluorescently labeled particles after intravitreal delivery to the eye in live rodents. This method replaces conventional practices that involve laborious tissue sectioning, immunostaining, and imaging, allowing for more precise quantification of microglia phagocytic function in just under six hours. This procedure can also be adapted to test how various compounds alter microglial phagocytosis in physiological settings. While this technique was developed in the eye, its use is not limited to vision research.

Ici , nous décrivons une méthode pour quantifier rapidement et de façon fiable le nombre de microglie de la rétine phagocytaires dans un milieu physiologique , en utilisant une analyse par cytométrie de flux (Figure 2). Cette méthode peut être adaptée pour tester l&#39;effet des composés et / ou la manipulation génétique de la capacité phagocytaire microglie (figures 3A, 3B). Il peut également être utilisé chez les jeunes (10 - 20...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay at JoVE.com

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

phagocytose microgliale est essentiel pour le maintien de l&#39;homéostasie tissulaire et la fonction phagocytaire insuffisante a été impliquée dans la pathologie. Cependant, l&#39; évaluation de la fonction microglies in vivo est techniquement difficile. Nous avons mis au point une technique simple mais robuste pour surveiller et quantifier le potentiel phagocytaire de la microglie dans un cadre physiologique précisément.

Évaluation Retinal microglial phagocytaire Fonction<em&gt; In Vivo</em&gt; L&#39;utilisation d&#39;un test basé sur la cytométrie de flux

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

L&#39;évaluation de l&#39;Innate détection du VIH-1 CD4 infectés<sup&gt; +</sup&gt; Cellules T par les cellules dendritiques plasmacytoïdes Utilisation d&#39;un<em&gt; Ex vivo</em&gt; Système de co-culture.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Recherche

Immunologie et infection

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

Basée sur l&#39;image de cytométrie en flux Technique pour évaluer les changements de granulocytes Fonction<em&gt; In Vitro</em

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte ...

Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions

Cytométrie de flux à base de test pour la surveillance des cellules NK Fonctions

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and ...

A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

Un test de cytotoxicité axée sur la cytométrie de flux pour l’évaluation de l’activité des cellules NK humaine

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Test pour la détection de cellules T spécifiques de l’antigène fonction cytolytique en utilisant un modèle de Vaccination

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

Un Simple écoulement Cytometry Based Assay pour déterminer In Vitro anticorps dépendant amélioration du Virus de la Dengue à l’aide de sérum de Convalescent Virus Zika

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

Multicolor Flow Cytometry-basé Quantification des mitochondries et des Lysosomes dans les cellules T

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

Évaluation de la réponse immunitaire cellulaire de la drosophile, Drosophila melanogaster, à l’aide d’un test In Vivo la phagocytose

In all animals, innate immunity provides an immediate and robust defense against a broad spectrum of pathogens. Humoral and cellular immune responses are ...

Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain

Cellule d'immunofluorescence utilisant IBA1 et TMEM119 pour la densité microgliale, la morphologie et l'analyse périphérique d'infiltration de cellules myéloïdes dans le cerveau de souris

This is a protocol for the dual visualization of microglia and infiltrating macrophages in mouse brain tissue. TMEM119 (which labels microglia ...

Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay

Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay

Mesure des anticorps naturels acquis de phagocytose induisant des parasites de plasmodium falciparum par un essai basé sur la cytométrie de flux

The protocol describes how to set up and run a flow cytometry-based phagocytosis assay of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes (IEs) opsonized by ...