Name: assessing retinal microglial phagocytic function in vivo using a flow cytometry-based assay
Uploaded: 2016-10-18T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay at JoVE.com

Salome Murinello is supported by American Diabetes Association grant #1-16-PDF-072. This work was supported by grants to Martin Friedlander from the National Institutes of Health (National Eye Institute EY11254 and EY22025) and the Lowy Medical Research Institute.

सभी जानवरों को नैतिक स्क्रिप्स रिसर्च इंस्टीट्यूट द्वारा स्थापित दिशा निर्देशों के अनुसार इलाज किया गया। इंजेक्शन के लिए सामग्री की 1. तैयारी <ol><li> एक 33 जी सुई और सिरिंज जीवाणुरहित: सी ο 115 पर जुदा ...

<ol>
	<li>Gomez-Nicola, D., Perry, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+dynamics+and+role+in+the+healthy+and+diseased+brain:+a+paradigm+of+functional+plasticity.">Microglial dynamics and role in the healthy and diseased brain: a paradigm of functional plasticity.</a> Neuroscientist. 21, 169-184 (2015).</li><li>Tremblay, M. E., Lowery, R. L., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+interactions+with+synapses+are+modulated+by+visual+experience.">Microglial interactions with synapses are modulated by visual experience.</a> PLoS Biol. 8, e1000527 (2010).</li><li>Schafer, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+sculpt+postnatal+neural+circuits+in+an+activity+and+complement-dependent+manner.">Microglia sculpt postnatal neural circuits in an activity and complement-dependent manner.</a> Neuron. 74, 691-705 (2012).</li><li>Sierra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+shape+adult+hippocampal+neurogenesis+through+apoptosis-coupled+phagocytosis.">Microglia shape adult hippocampal neurogenesis through apoptosis-coupled phagocytosis.</a> Cell Stem Cell. 7, 483-495 (2010).</li><li>Sierra, A., Abiega, O., Shahraz, A., Neumann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Janus-faced+microglia:+beneficial+and+detrimental+consequences+of+microglial+phagocytosis.">Janus-faced microglia: beneficial and detrimental consequences of microglial phagocytosis.</a> Front Cell Neurosci. 7 (6), (2013).</li><li>Chan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD33+modulates+TREM2:+convergence+of+Alzheimer+loci.">CD33 modulates TREM2: convergence of Alzheimer loci.</a> Nat Neurosci. 18, 1556-1558 (2015).</li><li>Murinello, S., Mullins, R. F., Lotery, A. J., Perry, V. H., Teeling, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fcgamma+receptor+upregulation+is+associated+with+immune+complex+inflammation+in+the+mouse+retina+and+early+age-related+macular+degeneration.">Fcgamma receptor upregulation is associated with immune complex inflammation in the mouse retina and early age-related macular degeneration.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, 247-258 (2014).</li><li>Ransohoff, R. M., Perry, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+physiology:+unique+stimuli,+specialized+responses.">Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses.</a> Annu Rev Immunol. 27, 119-145 (2009).</li><li>Derecki, N., Cronk, J., Kipnis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+of+phagocytic+function+in+primary+murine+microglia.">Assay of phagocytic function in primary murine microglia.</a> Protoc Exchange. , (2012).</li><li>Fricker, M., Oliva-Martin, M. J., Brown, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+phagocytosis+of+viable+neurons+by+microglia+activated+with+LPS+or+Abeta+is+dependent+on+calreticulin/LRP+phagocytic+signalling.">Primary phagocytosis of viable neurons by microglia activated with LPS or Abeta is dependent on calreticulin/LRP phagocytic signalling.</a> J Neuroinflammation. 9, 196 (2012).</li><li>Koenigsknecht-Talboo, J., Landreth, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+phagocytosis+induced+by+fibrillar+beta-amyloid+and+IgGs+are+differentially+regulated+by+proinflammatory+cytokines.">Microglial phagocytosis induced by fibrillar beta-amyloid and IgGs are differentially regulated by proinflammatory cytokines.</a> J Neurosci. 25, 8240-8249 (2005).</li><li>Neher, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+microglial+phagocytosis+is+sufficient+to+prevent+inflammatory+neuronal+death.">Inhibition of microglial phagocytosis is sufficient to prevent inflammatory neuronal death.</a> J Immunol. 186, 4973-4983 (2011).</li><li>Fricker, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MFG-E8+mediates+primary+phagocytosis+of+viable+neurons+during+neuroinflammation.">MFG-E8 mediates primary phagocytosis of viable neurons during neuroinflammation.</a> J Neurosci. 32, 2657-2666 (2012).</li><li>Mildner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+and+non-redundant+roles+of+microglia+and+myeloid+subsets+in+mouse+models+of+Alzheimer's+disease.">Distinct and non-redundant roles of microglia and myeloid subsets in mouse models of Alzheimer's disease.</a> J Neurosci. 31, 11159-11171 (2011).</li><li>Neher, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis+executes+delayed+neuronal+death+after+focal+brain+ischemia.">Phagocytosis executes delayed neuronal death after focal brain ischemia.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, E4098-E4107 (2013).</li><li>Perego, C., Fumagalli, S., De Simoni, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+pattern+of+expression+and+colocalization+of+microglia/macrophage+phenotype+markers+following+brain+ischemic+injury+in+mice.">Temporal pattern of expression and colocalization of microglia/macrophage phenotype markers following brain ischemic injury in mice.</a> J Neuroinflammation. 8, 174-174 (2011).</li><li>Preissler, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+microglial+phagocytosis+in+GPR34-deficient+mice.">Altered microglial phagocytosis in GPR34-deficient mice.</a> Glia. 63, 206-215 (2015).</li><li>Hughes, M. M., Field, R. H., Perry, V. H., Murray, C. L., Cunningham, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+the+degenerating+brain+are+capable+of+phagocytosis+of+beads+and+of+apoptotic+cells,+but+do+not+efficiently+remove+PrP(Sc),+even+upon+LPS+stimulation.">Microglia in the degenerating brain are capable of phagocytosis of beads and of apoptotic cells, but do not efficiently remove PrP(Sc), even upon LPS stimulation.</a> Glia. 58, 2017-2030 (2010).</li><li>Westenskow, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+flow+cytometry+to+compare+the+dynamics+of+photoreceptor+outer+segment+phagocytosis+in+iPS-derived+RPE+cells.">Using flow cytometry to compare the dynamics of photoreceptor outer segment phagocytosis in iPS-derived RPE cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 53, 6282-6290 (2012).</li><li>London, A., Benhar, I., Schwartz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retina+as+a+window+to+the+brain-from+eye+research+to+CNS+disorders.">The retina as a window to the brain-from eye research to CNS disorders.</a> Nat Rev Neurol. 9, 44-53 (2013).</li><li>Fritzenwanger, M., Jung, C., Goebel, B., Lauten, A., Figulla, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+short-term+systemic+hypoxia+on+phagocytosis,+cytokine+production,+and+transcription+factor+activation+in+peripheral+blood+cells.">Impact of short-term systemic hypoxia on phagocytosis, cytokine production, and transcription factor activation in peripheral blood cells.</a> Mediators Inflamm. , 429501 (2011).</li><li>Ragsdale, R. L., Grasso, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+spectrofluorometric+assay+for+quantitating+yeast+phagocytosis+in+cultures+of+murine+peritoneal+macrophages.">An improved spectrofluorometric assay for quantitating yeast phagocytosis in cultures of murine peritoneal macrophages.</a> J Immunol Methods. 123, 259-267 (1989).</li><li>Stokes, L., Surprenant, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+regulation+of+the+P2X4+receptor+in+alveolar+macrophages+by+phagocytosis+and+classical+activation.">Dynamic regulation of the P2X4 receptor in alveolar macrophages by phagocytosis and classical activation.</a> Eur J Immunol. 39, 986-995 (2009).</li><li>Kotani, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraoperative+modulation+of+alveolar+macrophage+function+during+isoflurane+and+propofol+anesthesia.">Intraoperative modulation of alveolar macrophage function during isoflurane and propofol anesthesia.</a> Anesthesiology. 89, 1125-1132 (1998).</li><li>Xu, X., Feng, J., Zuo, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoflurane+preconditioning+reduces+the+rat+NR8383+macrophage+injury+induced+by+lipopolysaccharide+and+interferon+gamma.">Isoflurane preconditioning reduces the rat NR8383 macrophage injury induced by lipopolysaccharide and interferon gamma.</a> Anesthesiology. 108, 643-650 (2008).</li><li>abd-el-Basset, E., Fedoroff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+bacterial+wall+lipopolysaccharide+(LPS)+on+morphology,+motility,+and+cytoskeletal+organization+of+microglia+in+cultures.">Effect of bacterial wall lipopolysaccharide (LPS) on morphology, motility, and cytoskeletal organization of microglia in cultures.</a> J Neurosci Res. 41, 222-237 (1995).</li><li>Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+protocols+for+surface+and+intracellular+antigen+analyses+of+neural+cell+types.">Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types.</a> J Vis Exp. , (2014).</li><li>Jackson, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+vulnerability+to+neurodegenerative+disease:+the+curious+case+of+Prion+Protein.">Selective vulnerability to neurodegenerative disease: the curious case of Prion Protein.</a> Dis Model Mech. 7, 21-29 (2014).</li><li>O'Koren, E. G., Mathew, R., Saban, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+mapping+reveals+that+microglia+and+recruited+monocyte-derived+macrophages+are+definitively+distinguishable+by+phenotype+in+the+retina.">Fate mapping reveals that microglia and recruited monocyte-derived macrophages are definitively distinguishable by phenotype in the retina.</a> Sci Rep. 6, 20636 (2016).</li><li>Usui, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+and+Eye+Disease.">Angiogenesis and Eye Disease.</a> Annu Rev Vision. 1, 155-184 (2015).</li></ol>

इस विधि में तीन महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं: (1) fluorescently लेबल कणों की intravitreal इंजेक्शन; (2) कटाई और रेटिना ऊतक की तैयारी; और (3) प्रवाह cytometric विश्लेषण। हम अनुशंसा करते हैं कि शोधकर्ताओं ने विधि हम यहाँ मौजूद प्रदर्शन करन?...

इस विधि के समग्र लक्ष्य सही आकलन और इन विवो microglial phagocytosis में यों की है। Microglia केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) के ऊतक निवासी मैक्रोफेज हैं। वे ऊतक homeostasis के रखरखाव सुनिश्चित करने के लिए कार्यों की एक किस्म प्रदर्शन करते हैं। ये प्रतिरक्षा निगरानी, neurotrophic कारकों का स्राव और, के निर्णायक महत्व, phagocytosis 1 शामिल हैं। Microglial phagocytosis इस तरह अप्रासंगिक synapses (synaptic छंटाई) और apoptotic न्यूरॉन्स 2-4 से हटाने के phagocytosis के रूप में मस्तिष्क और रेटिना के विकास के दौरान कई महत्वपूर्ण घटनाओं में महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, क्षतिग्रस्त या apoptotic न्यूरॉन्स, सेलुलर मलबे, और हमलावर रोगाणुओं की microglial phagocytosis वयस्कता के माध्यम से 5 सीएनएस homeostasis को बनाए रखने के लिए आवश्यक होना दिखाया गया है। अंत में, microglial phagocytosis अल्जाइमर रोग और उम्र से संबंधित सहित कई neurodegenerative रोगों के रोगजनन में फंसा दिया गया हैधब्बेदार अध: पतन, जहां यह सुझाव दिया गया है कि दोषपूर्ण या अपर्याप्त phagocytic क्षमता amyloid-β (Aβ) सजीले टुकड़े हैं और drusen क्रमश: 6.7 का निर्माण हुआ योगदान कर सकते हैं। Microglial समारोह कसकर, उनके microenvironment द्वारा नियंत्रित किया जाता है, विशेष रूप से इस तरह के ट्यूमर वृद्धि कारक β या सेल सेल बातचीत के रूप में घुलनशील कारकों से। न्यूरॉन्स अनिवार्यता से ऐसे CD200 और CX3CL1 के रूप में कई कोशिका की सतह ligands, एक्सप्रेस, microglia विशेष रूप से संबंधित रिसेप्टर्स CD200R और CX3CR1 का इजहार करते हुए। इन रिसेप्टर्स उनके intracellular हिस्से में immunoreceptor tyrosine आधारित निषेध रूपांकनों (ITIMs) होते हैं। ये अवरोध करनेवाला रिसेप्टर्स microglia की अधिक उत्तेजना, जो neuroinflammation करने के लिए योगदान कर सकते हैं रोकने के लिए महत्वपूर्ण हैं। इस प्रकार, सामान्य शारीरिक शर्तों के तहत, न्यूरॉन्स और microglia के बीच सेल सेल बातचीत microglia एक मौन राज्य में रहते हैं। ऊतक चोट के दौरान, तथापि, न्यूरॉन्स नीचे विनियमित कर सकते हैं ऍक्स्पइन ligands के ression, microglia सक्रियण पर अपने निरोधात्मक प्रभाव को दूर। (Phagocytosis सहित) microglial समारोह इस प्रकार कसकर उनके microenvironment 8 से जुड़ा हुआ है। फिर भी, आज तक, वहाँ एक शारीरिक संदर्भ में या एक ही रास्ता है कि पूरी तरह से उनके सीएनएस microenvironment प्रतिकृति में microglia phagocytosis अध्ययन करने के लिए कोई मानकीकृत assays हैं। कई assays इन विट्रो, जहां प्राथमिक microglia या microglia सेल लाइनों लक्ष्य कोशिकाओं (जैसे, apoptotic न्यूरॉन्स) या fluorescently लेबल मोतियों के साथ सुसंस्कृत हैं microglia की phagocytic गतिविधि को मापने के लिए विकसित किया गया है। लक्ष्य तेज तो फ्लोरोसेंट इमेजिंग माइक्रोस्कोपी का उपयोग या प्रवाह cytometry 9-12 मूल्यांकन किया है। ये assays कैसे औषधीय या आनुवंशिक हेरफेर microglial phagocytosis जबकि जानकारीपूर्ण, पूरी तरह से विवो वातावरण में जटिल दोहराने के लिए असफल प्रभावित कर सकता है और, के परीक्षण की अनुमति। microglial phagocytosis की जांच के लिए अप्रत्यक्ष तरीकोंविवो में सूचित किया गया है: ये, phagocytic की प्रतिरक्षाऊतकरसायन पता लगाने के द्वारा phagocytosis (जैसे, CD68) में शामिल होने का सोचा अणुओं के धुंधला द्वारा पूरा कर रहे हैं microglia और लक्ष्य phagocytosis के लिए (जैसे, समझौता न्यूरॉन्स या synaptic तत्व) की शारीरिक निकटता का आकलन करने के लिए, या microglial कोशिकाओं के भीतर लक्ष्य (जैसे, Aβ) 13-17। दो अध्ययनों विवो में microglia phagocytosis आकलन करने के लिए और अधिक प्रत्यक्ष दृष्टिकोण का इस्तेमाल किया है। ह्यूजेस और उनके सहयोगियों ने इमेजिंग तकनीक का इस्तेमाल किया है intracranial मार्ग 18 के माध्यम से वितरित मोतियों की microglial तेज मापने के लिए। सिएरा एट अल। एक परिष्कृत विधि मात्रात्मक जटिल इमेजिंग तकनीक का उपयोग करते हुए 4 apoptotic कोशिकाओं की microglia phagocytosis आकलन करने के लिए विकसित की है। हालांकि, इन तरीकों ऊतक तैयारी, सेक्शनिंग, इमेजिंग, और विश्लेषण के लिए जटिल प्रोटोकॉल शामिल है। हम पहले प्रवाह cytometric विश्लेषण का इस्तेमाल किया है बाहर फोटोरिसेप्टर के phagocytosis आकलन करने के लिएएर खंडों संस्कृति 19 में रेटिना pigmented उपकला (RPE) कोशिकाओं द्वारा। यहाँ, हम एक प्रोटोकॉल तेजी से तेज की इन विवो microglia phagocytosis की एक मात्रात्मक उपाय के रूप में रेटिना microglia द्वारा fluorescently लेबल कणों का आकलन करने का वर्णन है। (1) fluorescently लेबल कणों की intravitreal वितरण, (2) फसल और रेटिना ऊतक की तैयारी, और (3) प्रवाह: प्रोटोकॉल हम यहाँ वर्णन तीन महत्वपूर्ण चरणों में छह बस के नीचे घंटों में रेटिना microglial phagocytosis की विश्वसनीय और मात्रात्मक मापन के लिए अनुमति देता है cytometric विश्लेषण। विधि हम विकसित किया है रेटिना में microglial phagocytosis आकलन करने के लिए एक मजबूत विधि है, और इसे सफलतापूर्वक कैसे विभिन्न यौगिकों या आनुवंशिक हेरफेर शारीरिक सेटिंग्स में इस कुंजी microglial समारोह में परिवर्तन का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। सीएनएस की एक विशेष क्षेत्र के रूप में, रेटिना microglia समारोह 20 अध्ययन करने के लिए एक आसानी से सुलभ मॉडल प्रणाली है। इस विधि टी में विकसित किया गया था जबकिवह आंख, हमें विश्वास है कि यह microglia phagocytic समारोह की जांच सब neuroscientists के लिए उपयोगी हो सकता है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Discontinued</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton&#160;syringe, 600 series</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>26702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>33 gauge, Small Hub RN NDL, 0.5 in, point style 4 - 12o</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7803-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymosan A (S. cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Z-23373</td>
			<td>Prepare immediately before injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-030-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5/45 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-35</td>
			<td>Need two</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5SF Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors - 3mm Cutting Edge</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-10</td>
			<td>Curved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neural Tissue Dissociation Kit &#8211; Postnatal Neurons</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-094-802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Polystyrene Round-bottom Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well U-bottom plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stain Buffer (BSA)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b-BV650 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>101259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ly6C-APC-Cy7</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>128025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ly6G-PE-Cy7</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>127617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>556463</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified anti-mouse CD16/32 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>101301</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing retinal microglial phagocytic function in vivo using a flow cytometry-based assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, including phagocytosis of damaged synapses or cells, debris, and/or invading pathogens. Impaired phagocytic function has been implicated in the pathogenesis of diseases such as Alzheimer's and age-related macular degeneration, where amyloid-&#946; plaque and drusen accumulate, respectively. Despite its importance, microglial phagocytosis has been challenging to assess in vivo. Here, we describe a simple, yet robust, technique for precisely monitoring and quantifying the in vivo phagocytic potential of retinal microglia. Previous methods have relied on immunohistochemical staining and imaging techniques. Our method uses flow cytometry to measure microglial uptake of fluorescently labeled particles after intravitreal delivery to the eye in live rodents. This method replaces conventional practices that involve laborious tissue sectioning, immunostaining, and imaging, allowing for more precise quantification of microglia phagocytic function in just under six hours. This procedure can also be adapted to test how various compounds alter microglial phagocytosis in physiological settings. While this technique was developed in the eye, its use is not limited to vision research.

यहाँ हम एक विधि का वर्णन तेजी से और मज़बूती का उपयोग कर प्रवाह cytometric विश्लेषण (चित्रा 2) एक शारीरिक सेटिंग में phagocytic रेटिना microglia की संख्या यों। इस विधि की phagocytic क्षमता पर यौगिकों और / या आन?...

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Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglial phagocytosis महत्वपूर्ण के लिए ऊतक homeostasis और अपर्याप्त phagocytic समारोह के रखरखाव विकृति में फंसा दिया गया है। हालांकि, विवो में microglia समारोह का आकलन तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है। हम ठीक निगरानी और एक शारीरिक सेटिंग में microglia की phagocytic संभावित बढ़ाता के लिए एक सरल लेकिन मजबूत तकनीक विकसित की है।

आकलन रेटिना microglial phagocytic समारोह<em&gt; Vivo</em&gt; एक से फ्लो आधारित परख का उपयोग

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

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एचआईवी -1 संक्रमित सीडी 4 की सहज सेंसिंग का आकलन<sup&gt; +</sup&gt; एक का उपयोग Plasmacytoid वृक्ष के समान कोशिकाओं द्वारा टी कोशिकाओं<em&gt; पूर्व vivo</em&gt; प्रणाली सह संस्कृति।

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

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छवि आधारित फ्लो तकनीक granulocyte फंक्शन में परिवर्तन का मूल्यांकन करने के लिए<em&gt; इन विट्रो</em

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte ...

Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions

से फ्लो आधारित एन.के. सेल कार्यों की निगरानी के लिए परख

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and ...

A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

एक प्रवाह Cytometry-आधारित Cytotoxicity परख मानव एन सेल गतिविधि के मूल्यांकन के लिए

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

Vivo में एक टीकाकरण मॉडल का उपयोग कर प्रतिजन-विशिष्ट टी-सेल Cytolytic फ़ंक्शन का पता लगाने के लिए परख

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

एक सरल प्रवाह Cytometry आधारित परख में निर्धारित करने के लिए इन विट्रो एंटीबॉडी निर्भर वृद्धि डेंगू के वायरस का उपयोग Zika वायरस स्वास्थ्य लाभ सीरम

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

बहुरंगा प्रवाह Cytometry-टी कोशिकाओं में Mitochondria और Lysosomes के ठहराव आधारित

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

फल मक्खी, Drosophila melanogasterके सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का आकलन, Vivo Phagocytosis परख में एक का उपयोग

In all animals, innate immunity provides an immediate and robust defense against a broad spectrum of pathogens. Humoral and cellular immune responses are ...

Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain

माइक्रोग्लियल घनत्व, मॉर्फोलॉजी और परिधीय माइलॉयड सेल घुसपैठ विश्लेषण माउस मस्तिष्क के लिए आईबीए1 और TMEM119 का उपयोग करके इम्यूनोफ्लोरेसी

This is a protocol for the dual visualization of microglia and infiltrating macrophages in mouse brain tissue. TMEM119 (which labels microglia ...

Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay

Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay

एक फ्लो साइटोमेट्री-आधारित परख द्वारा प्लाज्मोडियम फाल्सीपेरम परजीवी के लिए स्वाभाविक रूप से अधिग्रहीत फागोसाइटोसिस-इंड्यूरिंग एंटीबॉडी को मापने

The protocol describes how to set up and run a flow cytometry-based phagocytosis assay of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes (IEs) opsonized by ...