Name: assessing retinal microglial phagocytic function in vivo using a flow cytometry-based assay
Uploaded: 2016-10-18T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay at JoVE.com

Salome Murinello is supported by American Diabetes Association grant #1-16-PDF-072. This work was supported by grants to Martin Friedlander from the National Institutes of Health (National Eye Institute EY11254 and EY22025) and the Lowy Medical Research Institute.

모든 동물은 스크립스 연구소에 의해 설립 된 윤리 지침에 따라 처리 하였다. 사출 용 재료 1. 준비 <ol><li> 33 G 바늘과 주사기를 소독 : C. ο 115 분해 및 오토 클레이브 멸균 인산 완충 식염수 (PBS)의 상승에 의해 주사 바늘을 준비합니다. </li><li> 10 분 - 5 상온에서 형광 표지 된 입자를 녹여. 칼슘 / 마그네슘 2+와 멸균 PBS에서 50 ㎎ / ㎖ 용액에 재구성하여 주입 입자 용?...

<ol>
	<li>Gomez-Nicola, D., Perry, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+dynamics+and+role+in+the+healthy+and+diseased+brain:+a+paradigm+of+functional+plasticity.">Microglial dynamics and role in the healthy and diseased brain: a paradigm of functional plasticity.</a> Neuroscientist. 21, 169-184 (2015).</li><li>Tremblay, M. E., Lowery, R. L., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+interactions+with+synapses+are+modulated+by+visual+experience.">Microglial interactions with synapses are modulated by visual experience.</a> PLoS Biol. 8, e1000527 (2010).</li><li>Schafer, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+sculpt+postnatal+neural+circuits+in+an+activity+and+complement-dependent+manner.">Microglia sculpt postnatal neural circuits in an activity and complement-dependent manner.</a> Neuron. 74, 691-705 (2012).</li><li>Sierra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+shape+adult+hippocampal+neurogenesis+through+apoptosis-coupled+phagocytosis.">Microglia shape adult hippocampal neurogenesis through apoptosis-coupled phagocytosis.</a> Cell Stem Cell. 7, 483-495 (2010).</li><li>Sierra, A., Abiega, O., Shahraz, A., Neumann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Janus-faced+microglia:+beneficial+and+detrimental+consequences+of+microglial+phagocytosis.">Janus-faced microglia: beneficial and detrimental consequences of microglial phagocytosis.</a> Front Cell Neurosci. 7 (6), (2013).</li><li>Chan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD33+modulates+TREM2:+convergence+of+Alzheimer+loci.">CD33 modulates TREM2: convergence of Alzheimer loci.</a> Nat Neurosci. 18, 1556-1558 (2015).</li><li>Murinello, S., Mullins, R. F., Lotery, A. J., Perry, V. H., Teeling, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fcgamma+receptor+upregulation+is+associated+with+immune+complex+inflammation+in+the+mouse+retina+and+early+age-related+macular+degeneration.">Fcgamma receptor upregulation is associated with immune complex inflammation in the mouse retina and early age-related macular degeneration.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, 247-258 (2014).</li><li>Ransohoff, R. M., Perry, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+physiology:+unique+stimuli,+specialized+responses.">Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses.</a> Annu Rev Immunol. 27, 119-145 (2009).</li><li>Derecki, N., Cronk, J., Kipnis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+of+phagocytic+function+in+primary+murine+microglia.">Assay of phagocytic function in primary murine microglia.</a> Protoc Exchange. , (2012).</li><li>Fricker, M., Oliva-Martin, M. J., Brown, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+phagocytosis+of+viable+neurons+by+microglia+activated+with+LPS+or+Abeta+is+dependent+on+calreticulin/LRP+phagocytic+signalling.">Primary phagocytosis of viable neurons by microglia activated with LPS or Abeta is dependent on calreticulin/LRP phagocytic signalling.</a> J Neuroinflammation. 9, 196 (2012).</li><li>Koenigsknecht-Talboo, J., Landreth, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+phagocytosis+induced+by+fibrillar+beta-amyloid+and+IgGs+are+differentially+regulated+by+proinflammatory+cytokines.">Microglial phagocytosis induced by fibrillar beta-amyloid and IgGs are differentially regulated by proinflammatory cytokines.</a> J Neurosci. 25, 8240-8249 (2005).</li><li>Neher, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+microglial+phagocytosis+is+sufficient+to+prevent+inflammatory+neuronal+death.">Inhibition of microglial phagocytosis is sufficient to prevent inflammatory neuronal death.</a> J Immunol. 186, 4973-4983 (2011).</li><li>Fricker, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MFG-E8+mediates+primary+phagocytosis+of+viable+neurons+during+neuroinflammation.">MFG-E8 mediates primary phagocytosis of viable neurons during neuroinflammation.</a> J Neurosci. 32, 2657-2666 (2012).</li><li>Mildner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+and+non-redundant+roles+of+microglia+and+myeloid+subsets+in+mouse+models+of+Alzheimer's+disease.">Distinct and non-redundant roles of microglia and myeloid subsets in mouse models of Alzheimer's disease.</a> J Neurosci. 31, 11159-11171 (2011).</li><li>Neher, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis+executes+delayed+neuronal+death+after+focal+brain+ischemia.">Phagocytosis executes delayed neuronal death after focal brain ischemia.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, E4098-E4107 (2013).</li><li>Perego, C., Fumagalli, S., De Simoni, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+pattern+of+expression+and+colocalization+of+microglia/macrophage+phenotype+markers+following+brain+ischemic+injury+in+mice.">Temporal pattern of expression and colocalization of microglia/macrophage phenotype markers following brain ischemic injury in mice.</a> J Neuroinflammation. 8, 174-174 (2011).</li><li>Preissler, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+microglial+phagocytosis+in+GPR34-deficient+mice.">Altered microglial phagocytosis in GPR34-deficient mice.</a> Glia. 63, 206-215 (2015).</li><li>Hughes, M. M., Field, R. H., Perry, V. H., Murray, C. L., Cunningham, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+the+degenerating+brain+are+capable+of+phagocytosis+of+beads+and+of+apoptotic+cells,+but+do+not+efficiently+remove+PrP(Sc),+even+upon+LPS+stimulation.">Microglia in the degenerating brain are capable of phagocytosis of beads and of apoptotic cells, but do not efficiently remove PrP(Sc), even upon LPS stimulation.</a> Glia. 58, 2017-2030 (2010).</li><li>Westenskow, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+flow+cytometry+to+compare+the+dynamics+of+photoreceptor+outer+segment+phagocytosis+in+iPS-derived+RPE+cells.">Using flow cytometry to compare the dynamics of photoreceptor outer segment phagocytosis in iPS-derived RPE cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 53, 6282-6290 (2012).</li><li>London, A., Benhar, I., Schwartz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retina+as+a+window+to+the+brain-from+eye+research+to+CNS+disorders.">The retina as a window to the brain-from eye research to CNS disorders.</a> Nat Rev Neurol. 9, 44-53 (2013).</li><li>Fritzenwanger, M., Jung, C., Goebel, B., Lauten, A., Figulla, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+short-term+systemic+hypoxia+on+phagocytosis,+cytokine+production,+and+transcription+factor+activation+in+peripheral+blood+cells.">Impact of short-term systemic hypoxia on phagocytosis, cytokine production, and transcription factor activation in peripheral blood cells.</a> Mediators Inflamm. , 429501 (2011).</li><li>Ragsdale, R. L., Grasso, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+spectrofluorometric+assay+for+quantitating+yeast+phagocytosis+in+cultures+of+murine+peritoneal+macrophages.">An improved spectrofluorometric assay for quantitating yeast phagocytosis in cultures of murine peritoneal macrophages.</a> J Immunol Methods. 123, 259-267 (1989).</li><li>Stokes, L., Surprenant, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+regulation+of+the+P2X4+receptor+in+alveolar+macrophages+by+phagocytosis+and+classical+activation.">Dynamic regulation of the P2X4 receptor in alveolar macrophages by phagocytosis and classical activation.</a> Eur J Immunol. 39, 986-995 (2009).</li><li>Kotani, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraoperative+modulation+of+alveolar+macrophage+function+during+isoflurane+and+propofol+anesthesia.">Intraoperative modulation of alveolar macrophage function during isoflurane and propofol anesthesia.</a> Anesthesiology. 89, 1125-1132 (1998).</li><li>Xu, X., Feng, J., Zuo, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoflurane+preconditioning+reduces+the+rat+NR8383+macrophage+injury+induced+by+lipopolysaccharide+and+interferon+gamma.">Isoflurane preconditioning reduces the rat NR8383 macrophage injury induced by lipopolysaccharide and interferon gamma.</a> Anesthesiology. 108, 643-650 (2008).</li><li>abd-el-Basset, E., Fedoroff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+bacterial+wall+lipopolysaccharide+(LPS)+on+morphology,+motility,+and+cytoskeletal+organization+of+microglia+in+cultures.">Effect of bacterial wall lipopolysaccharide (LPS) on morphology, motility, and cytoskeletal organization of microglia in cultures.</a> J Neurosci Res. 41, 222-237 (1995).</li><li>Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+protocols+for+surface+and+intracellular+antigen+analyses+of+neural+cell+types.">Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types.</a> J Vis Exp. , (2014).</li><li>Jackson, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+vulnerability+to+neurodegenerative+disease:+the+curious+case+of+Prion+Protein.">Selective vulnerability to neurodegenerative disease: the curious case of Prion Protein.</a> Dis Model Mech. 7, 21-29 (2014).</li><li>O'Koren, E. G., Mathew, R., Saban, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+mapping+reveals+that+microglia+and+recruited+monocyte-derived+macrophages+are+definitively+distinguishable+by+phenotype+in+the+retina.">Fate mapping reveals that microglia and recruited monocyte-derived macrophages are definitively distinguishable by phenotype in the retina.</a> Sci Rep. 6, 20636 (2016).</li><li>Usui, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+and+Eye+Disease.">Angiogenesis and Eye Disease.</a> Annu Rev Vision. 1, 155-184 (2015).</li></ol>

이 방법의 세 가지 중요한 단계가 있습니다 형광 표지 된 입자 (1) 유리체 강내 주입; (2) 수확 망막 조직의 제조; (3) 세포 계측 분석을 흐른다. 우리는 연구자들이 우리가 여기서 제시하는 방법을 수행하기 전에 유리체 강내 주사를 연습하는 것이 좋습니다. 알비노 마우스 (예를 BALB / c) 및 착색 된 용액 (예를 들어, 형광 표지 된 입자) 바늘로 쉽게 시각화 주사 용액에 사용될 수있다. 유...

이 방법의 전반적인 목표는 정확하게 평가하고 생체 내 미세 아교 식균 작용에 정량화하는 것입니다. 미세 아교 세포는 중추 신경계 (CNS)의 조직 거주자 대식 세포이다. 이들은 조직의 항상성의 유지를 보장하기 위해 다양한 기능을 수행한다. 이러한 면역 감시, 신경 영양 인자의 분비의 중요한 중요성, 식세포 작용 (1)을 포함한다. 소교 식세포는 관련이없는 시냅스 (시냅스 가지 치기) 및 세포 사멸 뉴런 2-4의 제거 식균 작용으로 뇌와 망막의 개발하는 동안 몇 가지 중요한 사건의 열쇠입니다. 또한, 손상 또는 사멸 신경 세포 파편 및 침입 미생물 소교 식세포는 성인 1-5 CNS 항상성 유지에 필수적인 것으로 나타났다. 마지막으로, 소교 탐식 알츠하이머 병 및 나이 관련 포함한 여러 신경 퇴행성 질환의 병인에 연루되어있다이 결함이 있거나 불충분 식세포 용량이 아밀로이드 β (Aβ) 플라크와 드루 젠, 각각 6, 7의 축적에 기여할 수 있음을 제안하고있다 황반변. 소교 함수 단단히 특히 종양 성장 인자 β 또는 세포 간 상호 작용과 같은 가용성 인자에 의해 그 미세 환경에 의해 조절된다. 미세 아교 세포가 독점적으로 각각의 수용체 CD200R 및 CX3CR1을 표현하면서 뉴런은 구조적으로, 이러한 CD200 및 CX3CL1 등 여러 가지 세포 표면 리간드를 표현한다. 이 수용체는 세포 내 부분에 면역 수용체 티로신 기반 금지 모티브 (ITIMs)를 포함한다. 이러한 수용체는 신경 염증에 기여할 수있는 미세 아교 세포의 과도한 자극을 방지하기위한 중요한 억제제. 따라서, 정상적인 생리적 조건 하에서, 뉴런 및 미세 아교 세포 간의 세포 - 세포 상호 작용은 정지 상태에서 미세 아교 세포를 유지한다. 조직 손상 동안, 그러나, 뉴런 EXP을 하향 조절할 수있다이러한 리간드 ression, 미세 아교 세포 활성에 미치는 억제 효과를 제거하는 단계를 포함한다. (식균 작용 포함) 소교 기능 따라서 밀접하게 자신의 미세 환경 (8)에 연결되어 있습니다. 그럼에도 불구하고, 현재까지, 생리 학적 맥락에서 또는 완전히 자신의 CNS의 미세 환경을 복제하는 방식으로 미세 아교 세포의 식세포 작용을 연구하는 표준화 된 시험 법이 없습니다. 여러 분석은 차 미세 아교 또는 소교 세포주 표적 세포 (예를 들면, 신경 세포 사멸) 또는 형광 표지 구슬 배양 시험관에 미세 아교 세포의 탐식 활성을 측정하기 위해 개발되었다. 목표 흡수 후 형광 현미경 영상을 사용하거나 계측법 9-12 흐름 평가된다. 이러한 분석은 약물이나 유전자 조작이 유익한 동안, 완전히 생체 내 환경에서 복잡한을 복제하는 데 실패, 소교 식균 작용에 영향을 미칠 수있는 방법의 테스트를 할 수 있습니다. 소교 식균 작용을 검사하는 간접 방법생체 내에서보고되었다 : 이들은 미세 아교 세포 및 대상 식균 작용에 대한 (예를 들어, 손상된 신경 세포 나 시냅스 요소)의 물리적 인 근접성을 평가, 식세포 작용 (예를 들어, CD68)에 관여하는 것으로 생각 분자의 염색에 의해 수행, 또는 식세포의 면역 검출로되어있다 소교 세포 내 표적 (예를 들면, Aβ) 13-17. 두 연구는 생체 내에서 미세 아교 세포의 식균 작용을 평가하기 위해보다 직접적인 방법을 사용했다. 휴즈와 동료들은 두개 내 경로 (18)를 통해 전달 구슬의 소교 흡수를 측정하는 이미징 기술을 사용했다. 시에라는 등. 정량적으로 복잡한 이미징 기술 4를 사용 사멸 세포의 미세 아교 세포의 식균 작용을 평가하는 세련된 방법을 개발했다. 그러나 이러한 방법은 조직 준비, 절편, 이미징 및 분석을위한 복잡한 프로토콜을 포함한다. 우리는 이전에 알아 감광체의 식균 작용을 평가하기 위해 유세포 분석을 사용한문화 19 망막 색소 상피 (RPE) 세포에 의한 어 세그먼트. 여기서 우리는 신속하게 생체 내 미세 아교 세포의 식균 작용의 정량적 측정으로 망막 미세 아교 세포로의 형광 표지 된 입자 흡수를 평가하기위한 프로토콜을 설명합니다. 형광 표지 된 입자 (1) 체내 전달, (2) 수확 및 망막 조직의 준비, (3) 흐름 : 우리가 여기에서 설명하는 프로토콜은 신뢰할 수있는 정량적 세 가지 중요한 단계의 바로 아래 6 시간 망막 미세 아교 식균 작용의 측정이 가능 세포 계측 분석. 우리가 개발 한 방법은 망막 소교 식균 작용을 평가하기위한 강력한 방법이며, 성공적으로 다양한 화합물 또는 유전자 조작 생리 설정이 키 소교 기능을 변경하는 방법을 테스트하기 위해 사용될 수있다. 중추 신경계의 전문 영역으로, 망막 미세 아교 세포 기능 (20)을 연구 쉽게 접근 할 수있는 모델 시스템입니다. 이 방법은 t에서 개발되었지만그는 눈에, 우리는 미세 아교 세포의 식세포 기능을 조사하는 모든 신경 과학자에 유용 할 수 있다고 생각합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Discontinued</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton&#160;syringe, 600 series</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>26702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>33 gauge, Small Hub RN NDL, 0.5 in, point style 4 - 12o</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7803-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymosan A (S. cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Z-23373</td>
			<td>Prepare immediately before injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-030-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5/45 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-35</td>
			<td>Need two</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5SF Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors - 3mm Cutting Edge</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-10</td>
			<td>Curved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neural Tissue Dissociation Kit &#8211; Postnatal Neurons</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-094-802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Polystyrene Round-bottom Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well U-bottom plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stain Buffer (BSA)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b-BV650 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>101259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ly6C-APC-Cy7</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>128025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ly6G-PE-Cy7</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>127617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>556463</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified anti-mouse CD16/32 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>101301</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing retinal microglial phagocytic function in vivo using a flow cytometry-based assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, including phagocytosis of damaged synapses or cells, debris, and/or invading pathogens. Impaired phagocytic function has been implicated in the pathogenesis of diseases such as Alzheimer's and age-related macular degeneration, where amyloid-&#946; plaque and drusen accumulate, respectively. Despite its importance, microglial phagocytosis has been challenging to assess in vivo. Here, we describe a simple, yet robust, technique for precisely monitoring and quantifying the in vivo phagocytic potential of retinal microglia. Previous methods have relied on immunohistochemical staining and imaging techniques. Our method uses flow cytometry to measure microglial uptake of fluorescently labeled particles after intravitreal delivery to the eye in live rodents. This method replaces conventional practices that involve laborious tissue sectioning, immunostaining, and imaging, allowing for more precise quantification of microglia phagocytic function in just under six hours. This procedure can also be adapted to test how various compounds alter microglial phagocytosis in physiological settings. While this technique was developed in the eye, its use is not limited to vision research.

다음은 신속하고 확실하게 유세포 분석을 (도 2)를 이용하여 생리 환경에서 포식성 망막 미세 아교 세포의 수를 정량하는 방법을 설명한다.이 방법의 탐식 능력의 화합물 및 / 또는 유전자 조작의 효과를 테스트하기 위해 적용될 수있다 미세 아교 세포 (도 3A, 3B). (- 이십일 생후 10) 또는 성체 마우스 (도 3c) 또한 젊은 사용될 수?...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay at JoVE.com

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

조직의 항상성 및 부적절한 식세포 기능의 유지 보수 병리에 연루되었습니다에 대한 소교 식균 작용은 매우 중요하다. 그러나, 생체 내에서 미세 아교 세포의 기능을 평가하는 것은 기술적으로 어려운 것이다. 우리는 정확하게 모니터링 및 생리 학적 환경에서 미세 아교 세포의 식세포 가능성을 정량화하기위한 간단하지만 강력한 기술을 개발했다.

망막 미세 아교 식세포의 기능을 평가<em&gt; 생체</em&gt;은 유동 세포 계측법 기반 분석을 사용하여

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

HIV-1 감염 CD4의 타고난 감지 평가<sup&gt; +</sup&gt;를 사용하여 형질 수지상 세포에 의한 T 세포<em&gt; 예 생체 내</em&gt; 공동 문화 시스템.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

연구

면역학 및 감염병학

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

이미지 기반 유동 세포 계측법 기술은 과립구 기능의 변화를 평가하기<em&gt; 체외</em

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte ...

Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions

흐름 NK 세포의 기능을 모니터링 분석을 기반 세포 계측법

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and ...

A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

인간 NK 세포 활동의 평가 대 한 흐름 Cytometry 기반 세포 독성 분석 실험

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

Vivo에서 예방 접종 모델을 사용 하는 항 원 특정 T-셀 Cytolytic 함수의 검색에 대 한 분석 결과

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

간단한 Cytometry 결정 체 외에서 항 체 의존의 향상 뎅기열 바이러스 Zika 바이러스 미리 혈 청을 사용 하 여 분석 결과 기반으로

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

미토 콘 드리 아와 T 세포에서는 리소좀의 다 색 흐름 Cytometry 기반 정량화

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

과일 파리, 초파리 melanogaster에 비보 먹어서 분석 결과 사용 하 여의 세포 면역 반응 평가

In all animals, innate immunity provides an immediate and robust defense against a broad spectrum of pathogens. Humoral and cellular immune responses are ...

Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain

마우스 뇌의 미세 교밀도, 형태학 및 말초 골수성 세포 침투 분석을 위해 IBA1 및 TMEM19를 사용한 면역형광 염색

This is a protocol for the dual visualization of microglia and infiltrating macrophages in mouse brain tissue. TMEM119 (which labels microglia ...

Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay

Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay

유동 세포측정 기반 분석체에 의한 플라스모듐 팔시파룸 기생충에 자연적으로 획득된 식세포증-유도 항체 측정

The protocol describes how to set up and run a flow cytometry-based phagocytosis assay of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes (IEs) opsonized by ...