Name: assessing retinal microglial phagocytic function in vivo using a flow cytometry-based assay
Uploaded: 2016-10-18T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay at JoVE.com

Salome Murinello is supported by American Diabetes Association grant #1-16-PDF-072. This work was supported by grants to Martin Friedlander from the National Institutes of Health (National Eye Institute EY11254 and EY22025) and the Lowy Medical Research Institute.

Todos os animais foram tratados de acordo com as diretrizes éticas estabelecidas pelo Instituto de Pesquisa Scripps. 1. Preparação de materiais para Injection <ol><li> Esterilizar uma agulha de 33 G e seringa: desmontar e autoclave a 115 ο C. Prepare agulhas para injecção pelo aumento em fosfato salino estéril (PBS). </li><li> Descongelar partículas marcadas por fluorescência à temperatura ambiente durante 5 - 10 min. Preparar a solução de partículas para injecção através da reconsti...

<ol>
	<li>Gomez-Nicola, D., Perry, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+dynamics+and+role+in+the+healthy+and+diseased+brain:+a+paradigm+of+functional+plasticity.">Microglial dynamics and role in the healthy and diseased brain: a paradigm of functional plasticity.</a> Neuroscientist. 21, 169-184 (2015).</li><li>Tremblay, M. E., Lowery, R. L., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+interactions+with+synapses+are+modulated+by+visual+experience.">Microglial interactions with synapses are modulated by visual experience.</a> PLoS Biol. 8, e1000527 (2010).</li><li>Schafer, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+sculpt+postnatal+neural+circuits+in+an+activity+and+complement-dependent+manner.">Microglia sculpt postnatal neural circuits in an activity and complement-dependent manner.</a> Neuron. 74, 691-705 (2012).</li><li>Sierra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+shape+adult+hippocampal+neurogenesis+through+apoptosis-coupled+phagocytosis.">Microglia shape adult hippocampal neurogenesis through apoptosis-coupled phagocytosis.</a> Cell Stem Cell. 7, 483-495 (2010).</li><li>Sierra, A., Abiega, O., Shahraz, A., Neumann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Janus-faced+microglia:+beneficial+and+detrimental+consequences+of+microglial+phagocytosis.">Janus-faced microglia: beneficial and detrimental consequences of microglial phagocytosis.</a> Front Cell Neurosci. 7 (6), (2013).</li><li>Chan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD33+modulates+TREM2:+convergence+of+Alzheimer+loci.">CD33 modulates TREM2: convergence of Alzheimer loci.</a> Nat Neurosci. 18, 1556-1558 (2015).</li><li>Murinello, S., Mullins, R. F., Lotery, A. J., Perry, V. H., Teeling, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fcgamma+receptor+upregulation+is+associated+with+immune+complex+inflammation+in+the+mouse+retina+and+early+age-related+macular+degeneration.">Fcgamma receptor upregulation is associated with immune complex inflammation in the mouse retina and early age-related macular degeneration.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, 247-258 (2014).</li><li>Ransohoff, R. M., Perry, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+physiology:+unique+stimuli,+specialized+responses.">Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses.</a> Annu Rev Immunol. 27, 119-145 (2009).</li><li>Derecki, N., Cronk, J., Kipnis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+of+phagocytic+function+in+primary+murine+microglia.">Assay of phagocytic function in primary murine microglia.</a> Protoc Exchange. , (2012).</li><li>Fricker, M., Oliva-Martin, M. J., Brown, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+phagocytosis+of+viable+neurons+by+microglia+activated+with+LPS+or+Abeta+is+dependent+on+calreticulin/LRP+phagocytic+signalling.">Primary phagocytosis of viable neurons by microglia activated with LPS or Abeta is dependent on calreticulin/LRP phagocytic signalling.</a> J Neuroinflammation. 9, 196 (2012).</li><li>Koenigsknecht-Talboo, J., Landreth, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+phagocytosis+induced+by+fibrillar+beta-amyloid+and+IgGs+are+differentially+regulated+by+proinflammatory+cytokines.">Microglial phagocytosis induced by fibrillar beta-amyloid and IgGs are differentially regulated by proinflammatory cytokines.</a> J Neurosci. 25, 8240-8249 (2005).</li><li>Neher, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+microglial+phagocytosis+is+sufficient+to+prevent+inflammatory+neuronal+death.">Inhibition of microglial phagocytosis is sufficient to prevent inflammatory neuronal death.</a> J Immunol. 186, 4973-4983 (2011).</li><li>Fricker, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MFG-E8+mediates+primary+phagocytosis+of+viable+neurons+during+neuroinflammation.">MFG-E8 mediates primary phagocytosis of viable neurons during neuroinflammation.</a> J Neurosci. 32, 2657-2666 (2012).</li><li>Mildner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+and+non-redundant+roles+of+microglia+and+myeloid+subsets+in+mouse+models+of+Alzheimer's+disease.">Distinct and non-redundant roles of microglia and myeloid subsets in mouse models of Alzheimer's disease.</a> J Neurosci. 31, 11159-11171 (2011).</li><li>Neher, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis+executes+delayed+neuronal+death+after+focal+brain+ischemia.">Phagocytosis executes delayed neuronal death after focal brain ischemia.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, E4098-E4107 (2013).</li><li>Perego, C., Fumagalli, S., De Simoni, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+pattern+of+expression+and+colocalization+of+microglia/macrophage+phenotype+markers+following+brain+ischemic+injury+in+mice.">Temporal pattern of expression and colocalization of microglia/macrophage phenotype markers following brain ischemic injury in mice.</a> J Neuroinflammation. 8, 174-174 (2011).</li><li>Preissler, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+microglial+phagocytosis+in+GPR34-deficient+mice.">Altered microglial phagocytosis in GPR34-deficient mice.</a> Glia. 63, 206-215 (2015).</li><li>Hughes, M. M., Field, R. H., Perry, V. H., Murray, C. L., Cunningham, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+the+degenerating+brain+are+capable+of+phagocytosis+of+beads+and+of+apoptotic+cells,+but+do+not+efficiently+remove+PrP(Sc),+even+upon+LPS+stimulation.">Microglia in the degenerating brain are capable of phagocytosis of beads and of apoptotic cells, but do not efficiently remove PrP(Sc), even upon LPS stimulation.</a> Glia. 58, 2017-2030 (2010).</li><li>Westenskow, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+flow+cytometry+to+compare+the+dynamics+of+photoreceptor+outer+segment+phagocytosis+in+iPS-derived+RPE+cells.">Using flow cytometry to compare the dynamics of photoreceptor outer segment phagocytosis in iPS-derived RPE cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 53, 6282-6290 (2012).</li><li>London, A., Benhar, I., Schwartz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retina+as+a+window+to+the+brain-from+eye+research+to+CNS+disorders.">The retina as a window to the brain-from eye research to CNS disorders.</a> Nat Rev Neurol. 9, 44-53 (2013).</li><li>Fritzenwanger, M., Jung, C., Goebel, B., Lauten, A., Figulla, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+short-term+systemic+hypoxia+on+phagocytosis,+cytokine+production,+and+transcription+factor+activation+in+peripheral+blood+cells.">Impact of short-term systemic hypoxia on phagocytosis, cytokine production, and transcription factor activation in peripheral blood cells.</a> Mediators Inflamm. , 429501 (2011).</li><li>Ragsdale, R. L., Grasso, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+spectrofluorometric+assay+for+quantitating+yeast+phagocytosis+in+cultures+of+murine+peritoneal+macrophages.">An improved spectrofluorometric assay for quantitating yeast phagocytosis in cultures of murine peritoneal macrophages.</a> J Immunol Methods. 123, 259-267 (1989).</li><li>Stokes, L., Surprenant, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+regulation+of+the+P2X4+receptor+in+alveolar+macrophages+by+phagocytosis+and+classical+activation.">Dynamic regulation of the P2X4 receptor in alveolar macrophages by phagocytosis and classical activation.</a> Eur J Immunol. 39, 986-995 (2009).</li><li>Kotani, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraoperative+modulation+of+alveolar+macrophage+function+during+isoflurane+and+propofol+anesthesia.">Intraoperative modulation of alveolar macrophage function during isoflurane and propofol anesthesia.</a> Anesthesiology. 89, 1125-1132 (1998).</li><li>Xu, X., Feng, J., Zuo, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoflurane+preconditioning+reduces+the+rat+NR8383+macrophage+injury+induced+by+lipopolysaccharide+and+interferon+gamma.">Isoflurane preconditioning reduces the rat NR8383 macrophage injury induced by lipopolysaccharide and interferon gamma.</a> Anesthesiology. 108, 643-650 (2008).</li><li>abd-el-Basset, E., Fedoroff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+bacterial+wall+lipopolysaccharide+(LPS)+on+morphology,+motility,+and+cytoskeletal+organization+of+microglia+in+cultures.">Effect of bacterial wall lipopolysaccharide (LPS) on morphology, motility, and cytoskeletal organization of microglia in cultures.</a> J Neurosci Res. 41, 222-237 (1995).</li><li>Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+protocols+for+surface+and+intracellular+antigen+analyses+of+neural+cell+types.">Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types.</a> J Vis Exp. , (2014).</li><li>Jackson, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+vulnerability+to+neurodegenerative+disease:+the+curious+case+of+Prion+Protein.">Selective vulnerability to neurodegenerative disease: the curious case of Prion Protein.</a> Dis Model Mech. 7, 21-29 (2014).</li><li>O'Koren, E. G., Mathew, R., Saban, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+mapping+reveals+that+microglia+and+recruited+monocyte-derived+macrophages+are+definitively+distinguishable+by+phenotype+in+the+retina.">Fate mapping reveals that microglia and recruited monocyte-derived macrophages are definitively distinguishable by phenotype in the retina.</a> Sci Rep. 6, 20636 (2016).</li><li>Usui, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+and+Eye+Disease.">Angiogenesis and Eye Disease.</a> Annu Rev Vision. 1, 155-184 (2015).</li></ol>

Existem três passos críticos neste método: (1) injecção intravítrea de partículas marcado por fluorescência; (2) a colheita e preparação do tecido da retina; e (3) análise de citometria de fluxo. Recomendamos que os pesquisadores praticar injeções intravítreas antes de realizar o método que aqui apresentamos. Murganhos albinos (por exemplo, murganhos BALB / C) e uma solução de cor (por exemplo, partículas marcadas por fluorescência) pode ser utilizado para facilitar a visualização ...

O objetivo geral deste método consiste em avaliar com precisão e quantificar na fagocitose microglial vivo. Microglia são os macrófagos residentes de tecido do sistema nervoso central (SNC). Eles desempenham uma variedade de funções para assegurar a manutenção da homeostase dos tecidos. Estes incluem a vigilância imunológica, a secreção de fatores neurotróficos e, de importância fundamental, fagocitose 1. Fagocitose microglial é fundamental em diversos eventos importantes durante o desenvolvimento do cérebro e da retina, tais como fagocitose de sinapses irrelevantes (poda sináptica) e remoção dos neurónios apoptóticas 2-4. Além disso, a fagocitose da microglia de neurónios danificados ou apoptóticas, detritos celulares, e os micróbios invasores foi demonstrado ser essencial para a manutenção da homeostase do SNC através da idade adulta 5. Finalmente, a fagocitose da microglia tem sido implicada na patogénese de várias doenças neurodegenerativas, incluindo doença de Alzheimer e Age-Relateddegeneração macular, onde tem sido sugerido que a capacidade fagocítica defeituoso ou insuficiente, podem contribuir para a acumulação de amilóide-p placas e drusas (Ap), respectivamente 6,7. função da microglia é fortemente regulada por seu microambiente, nomeadamente por factores solúveis, tais como o factor de crescimento tumoral-β ou interacções célula-célula. Os neurónios expressam constitutivamente vários ligandos da superfície celular, tais como CD200 e CX3CL1, enquanto microglia expressam exclusivamente os respectivos receptores CD200R e CX3CR1. Esses receptores contêm imunor motivos de inibição baseada em tirosina (ITIMs) em sua porção intracelular. Estes receptores são críticos inibidor para prevenir a sobre-estimulação da microglia, que pode contribuir para neuroinflamaï¿½o. Deste modo, sob condições fisiológicas normais, a interacções célula-célula entre neurónios e microglia microglia manter num estado de repouso. Durante lesão tecidual, no entanto, os neurônios podem infra-regular expression destes ligandos, removendo o seu efeito inibidor na activação da microglia. Função da microglia (incluindo fagocitose) é, portanto, fortemente ligado ao seu microambiente 8. No entanto, até à data, não existem testes padronizados para estudar a fagocitose da microglia num contexto fisiológico ou de uma maneira que replica totalmente o seu microambiente do SNC. Vários ensaios foram desenvolvidos para medir a actividade fagocítica de microglia in vitro, em que a microglia primárias ou linhas de células da microglia foram cultivadas com células alvo (por exemplo, neurónios apoptóticos) ou esferas marcadas com fluorescência. Captação alvo é então avaliada por microscopia de imagem fluorescente ou citometria de fluxo 9-12. Estes ensaios permitir o teste de como a manipulação genética ou farmacológica pode afectar a fagocitose da microglia e, ao mesmo tempo informativo, não conseguem replicar completamente o complexo no ambiente in vivo. Métodos indiretos para examinar a fagocitose microglialin vivo foram relatados: estes são realizadas através de coloração de moléculas que se pensa estarem envolvidos na fagocitose (por exemplo, CD68), avaliando a proximidade física da microglia e alvos para a fagocitose (por exemplo, neurónios comprometidos ou elementos sináptica), ou por detecção imuno-histoquímica de fagocítica alvos dentro das células microgliais (por exemplo, Ap) 13-17. Dois estudos usaram abordagens mais diretas para avaliar microglia fagocitose in vivo. Hughes e seus colegas usaram técnicas de imagem para medir o aporte de microglial de contas entregues por via intracraniana 18. Sierra et ai. Desenvolveram um método aperfeiçoado para avaliar quantitativamente a fagocitose da microglia de células apoptóticas, utilizando técnicas de imagem complexas 4. No entanto, estes métodos envolvem protocolos complicados para a preparação do tecido, corte, de imagem e análise. Temos anteriormente utilizada a análise de citometria de fluxo para avaliar a fagocitose de fotorreceptor para forasegmentos de er por células da retina epitélio pigmentado (RPE) em cultura 19. Aqui, descrevemos um protocolo para avaliar a absorção rápida de marcação fluorescente partículas por microglia da retina como uma medida quantitativa da in vivo microglia fagocitose. O protocolo aqui descrito permite a medição fiável e quantitativa da fagocitose da microglia da retina em pouco menos de seis horas em três passos críticos: (1) a entrega intravítrea de partículas marcado por fluorescência, (2) da colheita e da preparação de tecido retiniano, e (3) o fluxo A análise de citometria. O método que desenvolvemos é um método robusto para avaliar a fagocitose da microglia na retina, e pode ser utilizado com sucesso para testar como vários compostos ou manipulação genética alterar esta função chave na microglia configurações fisiológicas. Como uma área especializada do sistema nervoso central, a retina é um sistema modelo facilmente acessível para estudar a função microglia 20. Enquanto este método foi desenvolvido no tele olho, acreditamos que ele pode ser útil para todos os neurocientistas que investigam função microglia fagocítica.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Discontinued</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton&#160;syringe, 600 series</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>26702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>33 gauge, Small Hub RN NDL, 0.5 in, point style 4 - 12o</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7803-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymosan A (S. cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Z-23373</td>
			<td>Prepare immediately before injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-030-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5/45 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-35</td>
			<td>Need two</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5SF Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors - 3mm Cutting Edge</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-10</td>
			<td>Curved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neural Tissue Dissociation Kit &#8211; Postnatal Neurons</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-094-802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Polystyrene Round-bottom Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well U-bottom plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stain Buffer (BSA)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b-BV650 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>101259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ly6C-APC-Cy7</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>128025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ly6G-PE-Cy7</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>127617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>556463</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified anti-mouse CD16/32 Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>101301</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing retinal microglial phagocytic function in vivo using a flow cytometry-based assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, including phagocytosis of damaged synapses or cells, debris, and/or invading pathogens. Impaired phagocytic function has been implicated in the pathogenesis of diseases such as Alzheimer's and age-related macular degeneration, where amyloid-&#946; plaque and drusen accumulate, respectively. Despite its importance, microglial phagocytosis has been challenging to assess in vivo. Here, we describe a simple, yet robust, technique for precisely monitoring and quantifying the in vivo phagocytic potential of retinal microglia. Previous methods have relied on immunohistochemical staining and imaging techniques. Our method uses flow cytometry to measure microglial uptake of fluorescently labeled particles after intravitreal delivery to the eye in live rodents. This method replaces conventional practices that involve laborious tissue sectioning, immunostaining, and imaging, allowing for more precise quantification of microglia phagocytic function in just under six hours. This procedure can also be adapted to test how various compounds alter microglial phagocytosis in physiological settings. While this technique was developed in the eye, its use is not limited to vision research.

Descrevemos aqui um método para rapidamente e de forma fiável quantificar o número de microglia da retina fagocíticas num ambiente fisiológico utilizando análise de citometria de fluxo (Figura 2). Este método pode ser adaptado para testar o efeito dos compostos e / ou manipulação genética sobre a capacidade fagocítica de microglia (Figuras 3A, 3B). Ele também pode ser usado em jovens (10 - 20 dias pós-parto) ou ratinhos adultos <str...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay at JoVE.com

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

fagocitose microglial é crítica para a manutenção da homeostase do tecido e da função fagocítica inadequada tem sido implicada na patologia. No entanto, a avaliação da função microglia in vivo é tecnicamente desafiador. Nós desenvolvemos uma técnica simples, mas robusta para monitorar com precisão e quantificar o potencial fagocítica da microglia em um ambiente fisiológico.

Avaliando Retinal microglia fagocítica Função<em&gt; In Vivo</em&gt; Usando um ensaio baseado em citometria de fluxo

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Avaliando a inata Sensing de HIV-1 CD4 Infected<sup&gt; +</sup&gt; As células T por células dendríticas plasmocitóides Usando um<em&gt; Ex vivo</em&gt; Co-cultura do sistema.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Imunologia e Infecção

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

Baseada em imagem Técnica de Citometria de Fluxo para avaliar as mudanças na função de granulócitos<em&gt; In Vitro</em

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte ...

Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions

Ensaio de citometria de fluxo baseada para a monitorização das funções das células NK

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and ...

A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

Um ensaio de citotoxicidade baseados em citometria de fluxo para a avaliação da atividade das células NK humana

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

Na Vivo Ensaio para detecção de células T antígeno-específicas função citolítica usando um modelo de vacinação

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

A citometria de fluxo simples com base em ensaio para determinar In Vitro anticorpo dependente do realce do vírus da Dengue, usando soro convalescente vírus Zika

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

Quantificação de baseados em citometria de fluxo multicolor de mitocôndrias e lisossomos em células T

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

Avaliar a resposta imune celular de mosca da fruta, Drosophila melanogaster, usando um ensaio de fagocitose em Vivo

In all animals, innate immunity provides an immediate and robust defense against a broad spectrum of pathogens. Humoral and cellular immune responses are ...

Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain

Imunofluorescência Manchausando IBA1 e TMEM119 para densidade microglial, morfologia e análise periférica de infiltração de células mieloides no cérebro do rato

This is a protocol for the dual visualization of microglia and infiltrating macrophages in mouse brain tissue. TMEM119 (which labels microglia ...

Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay

Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay

Medindo anticorpos indutores de fagocitose naturalmente adquiridos para parasitas plasmodium falciparum por um ensaio baseado em citometria de fluxo

The protocol describes how to set up and run a flow cytometry-based phagocytosis assay of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes (IEs) opsonized by ...