Name: characterization of multi-subunit protein complexes of human mxa using non-denaturing polyacrylamide gel-electrophoresis
Uploaded: 2016-10-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterization of Multi-subunit Protein Complexes of Human MxA Using Non-denaturing Polyacrylamide Gel-electrophoresis at JoVE.com

This work was funded by a Grant from the Swiss National Science foundation (Grant nr. 31003A_143834) to JP.

नोट: इस प्रोटोकॉल पहले प्रकाशित गैर अप्राकृतिकरण पृष्ठ प्रोटोकॉल 12 पर आधारित है। कि अध्ययन में, MXA प्रोटीन की oligomeric राज्य या तो वेरो कोशिकाओं MXA overexpressing या IFN-α उत्तेजित A549 कोशिकाओं अंतर्जात MXA व्यक्त का उप?...

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	<li>Baisamy, L., Jurisch, N., Diviani, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leucine+zipper-mediated+homo-oligomerization+regulates+the+Rho-GEF+activity+of+AKAP-Lbc.">Leucine zipper-mediated homo-oligomerization regulates the Rho-GEF activity of AKAP-Lbc.</a> J Biol Chem. 280, 15405-15412 (2005).</li><li>Chen, C. P., Posy, S., Ben-Shaul, A., Shapiro, L., Honig, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+of+cell-cell+adhesion+by+classical+cadherins:+Critical+role+for+low-affinity+dimerization+through+beta-strand+swapping.">Specificity of cell-cell adhesion by classical cadherins: Critical role for low-affinity dimerization through beta-strand swapping.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 8531-8536 (2005).</li><li>Jackson-Fisher, A. J., Chitikila, C., Mitra, M., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+TBP+dimerization+in+preventing+unregulated+gene+expression.">A role for TBP dimerization in preventing unregulated gene expression.</a> Mol Cell. 3, 717-727 (1999).</li><li>Torshin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activating+oligomerization+as+intermediate+level+of+signal+transduction:+analysis+of+protein-protein+contacts+and+active+sites+in+several+glycolytic+enzymes.">Activating oligomerization as intermediate level of signal transduction: analysis of protein-protein contacts and active sites in several glycolytic enzymes.</a> Front Biosci. 4, 557-570 (1999).</li><li>Goodsell, D. S., Olson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+symmetry+and+protein+function.">Structural symmetry and protein function.</a> Annu Rev Biophys Biomol Struct. 29, 105-153 (2000).</li><li>Flydal, M. I., Martinez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenylalanine+hydroxylase:+function,+structure,+and+regulation.">Phenylalanine hydroxylase: function, structure, and regulation.</a> IUBMB Life. 65, 341-349 (2013).</li><li>Haller, O., Kochs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+MxA+protein:+an+interferon-induced+dynamin-like+GTPase+with+broad+antiviral+activity.">Human MxA protein: an interferon-induced dynamin-like GTPase with broad antiviral activity.</a> J Interferon Cytokine Res. 31, 79-87 (2011).</li><li>Haller, O., Staeheli, P., Schwemmle, M., Kochs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mx+GTPases:+dynamin-like+antiviral+machines+of+innate+immunity.">Mx GTPases: dynamin-like antiviral machines of innate immunity.</a> Trends Microbiol. 23, 154-163 (2015).</li><li>Di Paolo, C., Hefti, H. P., Meli, M., Landis, H., Pavlovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intramolecular+backfolding+of+the+carboxyl-terminal+end+of+MxA+protein+is+a+prerequisite+for+its+oligomerization.">Intramolecular backfolding of the carboxyl-terminal end of MxA protein is a prerequisite for its oligomerization.</a> J Biol Chem. 274, 32071-32078 (1999).</li><li>Janzen, C., Kochs, G., Haller, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+monomeric+GTPase-negative+MxA+mutant+with+antiviral+activity.">A monomeric GTPase-negative MxA mutant with antiviral activity.</a> J Virol. 74, 8202-8206 (2000).</li><li>Gao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+myxovirus+resistance+protein+a+reveals+intra-+and+intermolecular+domain+interactions+required+for+the+antiviral+function.">Structure of myxovirus resistance protein a reveals intra- and intermolecular domain interactions required for the antiviral function.</a> Immunity. 35, 514-525 (2011).</li><li>Nigg, P. E., Pavlovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomerization+and+GTP-binding+Requirements+of+MxA+for+Viral+Target+Recognition+and+Antiviral+Activity+against+Influenza+A+Virus.">Oligomerization and GTP-binding Requirements of MxA for Viral Target Recognition and Antiviral Activity against Influenza A Virus.</a> J Biol Chem. 290, 29893-29906 (2015).</li><li>Gao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+oligomerization+in+the+stalk+region+of+dynamin-like+MxA.">Structural basis of oligomerization in the stalk region of dynamin-like MxA.</a> Nature. 465, 502-506 (2010).</li><li>Ghosh, I., Hamilton, A. D., Regan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiparallel+leucine+zipper-directed+protein+reassembly:+Application+to+the+green+fluorescent+protein.">Antiparallel leucine zipper-directed protein reassembly: Application to the green fluorescent protein.</a> J Am Chem Soc. 122, 5658-5659 (2000).</li><li>Patching, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+plasmon+resonance+spectroscopy+for+characterisation+of+membrane+protein-ligand+interactions+and+its+potential+for+drug+discovery.">Surface plasmon resonance spectroscopy for characterisation of membrane protein-ligand interactions and its potential for drug discovery.</a> Biochim Biophys Acta. 1838, 43-55 (2014).</li><li>Kenworthy, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+protein-protein+interactions+using+fluorescence+resonance+energy+transfer+microscopy.">Imaging protein-protein interactions using fluorescence resonance energy transfer microscopy.</a> Methods. 24, 289-296 (2001).</li><li>Wyatt, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-Scattering+and+the+Absolute+Characterization+of+Macromolecules.">Light-Scattering and the Absolute Characterization of Macromolecules.</a> Analytica Chimica Acta. 272 (93), 1-40 (1993).</li><li>Howlett, G. J., Minton, A. P., Rivas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+ultracentrifugation+for+the+study+of+protein+association+and+assembly.">Analytical ultracentrifugation for the study of protein association and assembly.</a> Curr Opin Chem Biol. 10, 430-436 (2006).</li><li>Fiala, G. J., Schamel, W. W., Blumenthal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+polyacrylamide+gel+electrophoresis+(BN-PAGE)+for+analysis+of+multiprotein+complexes+from+cellular+lysates.">Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates.</a> J Vis Exp. , (2011).</li><li>Zou, H., Li, Y., Liu, X., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+APAF-1.cytochrome+c+multimeric+complex+is+a+functional+apoptosome+that+activates+procaspase-9.">An APAF-1.cytochrome c multimeric complex is a functional apoptosome that activates procaspase-9.</a> J Biol Chem. 274, 11549-11556 (1999).</li><li>Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+molecular+masses+and+oligomeric+states+of+protein+complexes+by+blue+native+electrophoresis+and+isolation+of+membrane+protein+complexes+by+two-dimensional+native+electrophoresis.">Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis.</a> Anal Biochem. 217, 220-230 (1994).</li><li>Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nondenaturing+polyacrylamide+gel+electrophoresis+of+proteins.">Nondenaturing polyacrylamide gel electrophoresis of proteins.</a> Methods Mol Biol. 32, 17-22 (1994).</li><li>Stoscheck, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+protein.">Quantitation of protein.</a> Methods Enzymol. 182, 50-68 (1990).</li><li>Wisskirchen, C., Ludersdorfer, T. H., Muller, D. A., Moritz, E., Pavlovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-induced+antiviral+protein+MxA+interacts+with+the+cellular+RNA+helicases+UAP56+and+URH49.">Interferon-induced antiviral protein MxA interacts with the cellular RNA helicases UAP56 and URH49.</a> J Biol Chem. 286, 34743-34751 (2011).</li><li>Stertz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-induced,+antiviral+human+MxA+protein+localizes+to+a+distinct+subcompartment+of+the+smooth+endoplasmic+reticulum.">Interferon-induced, antiviral human MxA protein localizes to a distinct subcompartment of the smooth endoplasmic reticulum.</a> J Interferon Cytokine Res. 26, 650-660 (2006).</li><li>Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proteins,+lipids+and+detergents:+not+just+a+soap+opera.">Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera.</a> Biochim Biophys Acta. 1666, 105-117 (2004).</li><li>Kochs, G., Haener, M., Aebi, U., Haller, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembly+of+human+MxA+GTPase+into+highly+ordered+dynamin-like+oligomers.">Self-assembly of human MxA GTPase into highly ordered dynamin-like oligomers.</a> J Biol Chem. 277, 14172-14176 (2002).</li><li>Kochs, G., Haller, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GTP-bound+human+MxA+protein+interacts+with+the+nucleocapsids+of+Thogoto+virus+(Orthomyxoviridae).">GTP-bound human MxA protein interacts with the nucleocapsids of Thogoto virus (Orthomyxoviridae).</a> J Biol Chem. 274, 4370-4376 (1999).</li><li>Reichelt, M., Stertz, S., Krijnse-Locker, J., Haller, O., Kochs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Missorting+of+LaCrosse+virus+nucleocapsid+protein+by+the+interferon-induced+MxA+GTPase+involves+smooth+ER+membranes.">Missorting of LaCrosse virus nucleocapsid protein by the interferon-induced MxA GTPase involves smooth ER membranes.</a> Traffic. 5, 772-784 (2004).</li><li>Wisskirchen, C., Ludersdorfer, T. H., Muller, D. A., Moritz, E., Pavlovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+RNA+helicase+UAP56+is+required+for+prevention+of+double-stranded+RNA+formation+during+influenza+A+virus+infection.">The cellular RNA helicase UAP56 is required for prevention of double-stranded RNA formation during influenza A virus infection.</a> J Virol. 85, 8646-8655 (2011).</li></ol>

Here we describe a simple method that allows the rapid determination of the oligomeric state of proteins expressed in mammalian cells by non-denaturing PAGE followed by Western blot analysis. The major advantage of this approach is that the oligomeric state of a given protein can be determined from whole cell lysates without prior protein purification. This may be important for proteins that oligomerize or exert their function in association with auxiliary factors. In addition, the proteins are still in their native stat...

एक प्रोटीन की संरचना चतुर्धातुक कई सेलुलर प्रक्रियाओं में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। संकेत दे रास्ते, जीन अभिव्यक्ति, और एंजाइम सक्रियण / छोड़ना सभी प्रोटीन परिसरों 1-4 की उचित विधानसभा पर भरोसा करते हैं। इस प्रक्रिया को भी होमो या असमलैंगिक oligomerization के रूप में जाना अपरिवर्तनीय सहसंयोजक या प्रतिवर्ती इलेक्ट्रोस्टैटिक और हाइड्रोफोबिक प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत के कारण है। Oligomerization न केवल जीनोम आकार में वृद्धि के बिना अलग सेलुलर प्रक्रियाओं diversifies, लेकिन प्रोटीन स्थिर परिसरों कि विकृतीकरण और गिरावट 5 के प्रति अधिक प्रतिरोधी रहे हैं का निर्माण करने के लिए भी एक रणनीति है। oligomerization में दोष प्रोटीन के समारोह पर प्रभाव पड़ता है और रोगों के विकास के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, एंजाइम फेनिलएलनिन hydroxylase एक tetrameric जटिल रूपों। प्रोटीन परिसर के भीतर कुछ उत्परिवर्तन टेट्रामर गठन को कमजोर और रोग phenylketonuria 6 के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। 7 प्रेरित एक इंटरफेरॉन (IFN) है। यह dynamin-जैसे बड़े GTPases की superfamily के अंतर्गत आता है और क्षमता विट्रो 8 में बड़े oligomeric संरचनाओं फार्म है। Oligomerization तेजी से गिरावट 9,10 से MXA की रक्षा करने के लिए सुझाव दिया गया है। कई अनुसंधान समूहों द्वारा तीव्र प्रयासों के बावजूद कार्रवाई की आणविक तंत्र काफी हद तक मायावी बनी हुई है और इसकी एंटीवायरल समारोह के लिए MXA की oligomerization राज्य की भूमिका बहस 9,11,12 के अधीन है। इस संबंध में, गाओ और सहकर्मियों एक मॉडल जहां MXA बड़े अंगूठी की तरह oligomeric संरचनाओं 11 के रूप में वायरल nucleoproteins के साथ बातचीत के द्वारा अपने एंटीवायरल गतिविधि डालती का प्रस्ताव रखा। हालांकि, हाल ही में, हम दिखा दिया कि MXA dimers एंटीवायरल गतिविधि प्रदर्शन और इन्फ्लूएंजा ए वायरस 12 के nucleoprotein के साथ बातचीत। बीMXA की क्रिस्टल संरचना पर ased, गाओ और सहकर्मियों इंटरफेस क्षेत्रों है कि इन विट्रो में अपनी oligomerization और उसके एंटीवायरल समारोह 11,13 के लिए महत्वपूर्ण हैं में कई अमीनो एसिड के अवशेष की पहचान की। इसलिए, ताकि स्पष्ट करने के लिए जो MXA की oligomeric राज्य एंटीवायरल गतिविधि डालती में, हम एक सरल प्रोटोकॉल तेजी से MXA इंटरफेस के रूप में अच्छी तरह से मानव कोशिकाओं में व्यक्त के रूप में अंतर्जात MXA IFNα उत्तेजना के बाद व्यक्त म्यूटेंट के oligmeric स्थिति का निर्धारण करने के लिए स्थापित करने की मांग की। हालांकि कई तकनीकों है कि आमतौर पर इस तरह के विभाजन हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन के रूप में प्रोटीन के बीच बातचीत की जांच करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं देखते हैं (विभाजन GFP) पूरक परख 14, सतह plasmon अनुनाद 15 और Förster प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) 16, वे प्रदान नहीं करते एक oligomeric प्रोटीन जटिल की सटीक stoichiometry की जानकारी। इस विशेष पहलू की जांच के लिए, तकनीक जैसेबहु कोण प्रकाश बिखरने (MALS) 17 और विश्लेषणात्मक ultracentrifugation 18 बहुत उपयोगी होते हैं। आमतौर पर, प्रोटीन इन तरीकों का उपयोग कर विश्लेषण शुद्ध प्रोटीन होते हैं। Oligomerization प्रक्रियाओं को भी अन्य सेलुलर कारकों पर निर्भर हो सकता है। इन कारकों में अज्ञात हैं, विश्लेषण और अधिक कठिन है। साथ ही, कुछ प्रोटीन ई में व्यक्त करने के लिए मुश्किल हो जाता है कोलाई और शुद्ध करने के लिए। इसलिए, इन तरीकों सेलुलर वातावरण में प्रोटीन oligomerization विश्लेषण करने के लिए इष्टतम पसंद नहीं कर रहे हैं। इसके अलावा, इन तकनीकों के महंगे उपकरण है जो आसानी से उपलब्ध नहीं हैं की आवश्यकता होती है। गैर denaturing जेल वैद्युतकणसंचलन (पृष्ठ), आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी या रासायनिक crosslinking पारंपरिक सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस) -PAGE के द्वारा पीछा सेल lysates 2,19,20 से oligomers के गठन के लक्षण वर्णन के लिए उपयोगी उपकरण हैं। इन तरीकों में विशेष उपकरणों की आवश्यकता नहीं है और आसानी से पीई हो सकता हैएक मानक प्रयोगशाला में rformed। हम शुरू में विभिन्न रासायनिक पार से जोड़ने प्रोटोकॉल है कि invariantly गैर विशिष्ट एकत्रीकरण और MXA की वर्षा करने के लिए नेतृत्व का मूल्यांकन किया। इसलिए, हम अगले गैर अप्राकृतिकरण पृष्ठ प्रोटोकॉल का परीक्षण किया। गैर अप्राकृतिकरण पृष्ठ एसडीएस के उपयोग को शामिल नहीं किया है, प्रोटीन के प्रवास के उनके पैतृक आरोप पर निर्भर करता है। ब्लू-देशी पृष्ठ एक समग्र नकारात्मक चार्ज, एसडीएस के समान के साथ प्रोटीन लोड करने के लिए coomassie खूब ब्लू G250 उपयोग करता है, लेकिन प्रोटीन 21 denature नहीं है। दुर्भाग्य से, उच्च लवण और द्विसंयोजक फैटायनों (जैसे 2 मिलीग्राम +) है कि अक्सर सेल बफ़र्स में शामिल किए गए हैं की उपस्थिति में खूब ब्लू अवक्षेप coomassie। इस्तेमाल किया बफ़र्स पर निर्भर करता है, यह एक उपाय है oligomeric प्रोटीन परिसर पर असर पड़ सकता है की आगे अनुकूलन के बिना नमूना विश्लेषण करने के लिए मुश्किल हो सकता है। यहाँ हम एक सरल एक पहले प्रकाशित विधि 22 के oligomerization निर्धारित करने के आधार पर प्रोटोकॉल प्रस्तुतमानव MXA प्रोटीन गैर अप्राकृतिकरण पृष्ठ का उपयोग सेलुलर lysates से निकाली गई।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="782">
	<tbody>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:244px;">Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Units, 10K MWCO, 0.5 mL</td>
			<td style="width:140px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">69570</td>
			<td style="width:268px;">Pre-equilibrate in dialysis buffer ( if Glycerol removal is desired) 
			Can be self-made according to Fiala et al. 2011</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:244px;">4&#8211;15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well,</td>
			<td style="width:140px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:131px;">456-1083</td>
			<td style="width:268px;">Pre-run in running buffer to adjust buffer system</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:244px;">cOmplete, Mini, EDTA-free</td>
			<td style="width:140px;">Roche&#160;</td>
			<td style="width:131px;">11836170001</td>
			<td>use 1 tablet per 50 ml</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:244px;">PBS, pH 7.4&#160; bottle a 500ml Gibco</td>
			<td style="width:140px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:244px;">Ponceau S solution</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">P7170</td>
			<td style="width:268px;">toxic! wear gloves and protect eyes!</td>
		</tr>
		<tr height="54">
			<td height="54" style="height:54px;width:244px;">NativeMark Unstained Protein Standard&#160; 50ul</td>
			<td style="width:140px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:131px;">P/N 57030</td>
			<td>load 5 ul/well</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:244px;">A549 cells</td>
			<td style="width:140px;">ATCC</td>
			<td style="width:131px;">ATCC CCL185</td>
			<td>Grow in growth medium (see Table 1)</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:244px;">Vero cells</td>
			<td style="width:140px;">ATCC</td>
			<td style="width:131px;">ATCC CCL81</td>
			<td>Grow in growth medium (see Table 1)</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:244px;">anti-Mx1 antibody</td>
			<td style="width:140px;">Novus Biologicals</td>
			<td style="width:131px;">H00004599_D01P</td>
			<td>Use at a 1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:244px;">ECL Anti-rabbit IgG, Horseradish Peroxidase linked whole antibody (from donkey)</td>
			<td style="width:140px;">GE-Healthcare</td>
			<td style="width:131px;">NA934V</td>
			<td>Use at a 1:10000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:244px;">0.5% Trypsin-EDTA (1x)&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Life Technologies</td>
			<td style="width:140px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:131px;">15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Iodoacetamide&#160;&#160; 5g</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">I-6125</td>
			<td>stock&#160; 100mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Bromphenolblue</td>
			<td style="width:140px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0126-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">DMEM +4.5g/l Gluc,+L-Glut,+Pyruvate life technologies</td>
			<td style="width:140px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">41966-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">Pen&#160; Strep 100 x&#160;&#160;&#160;&#160; 100ml&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; life technologies</td>
			<td style="width:140px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">15140 - 130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">Glutamax 100xStock, 100ml&#160;&#160;&#160;&#160; life technologies</td>
			<td style="width:140px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">350500-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">Fetal Bovine Serum, Dialyzed , US Origin 500ml Gibco Lot:42G9552K</td>
			<td style="width:140px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Cellulose filter paper</td>
			<td style="width:140px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:131px;">1703965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">PVDV blotting&#160; membrane</td>
			<td style="width:140px;">GE-Healthcare</td>
			<td style="width:131px;">10600022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td>
			<td style="width:140px;">Biosolve</td>
			<td style="width:131px;">0020092391BS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">sodium fluoride (NaF)</td>
			<td style="width:140px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">S-7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">NP-40</td>
			<td style="width:140px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:131px;">492015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">cOmplete, Mini, EDTA-free</td>
			<td style="width:140px;">Roche&#160;</td>
			<td style="width:131px;">11836170001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Tween 20</td>
			<td style="width:140px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:131px;">6555204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">CHAPS 10% solution</td>
			<td style="width:140px;">Amresco</td>
			<td style="width:131px;">N907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">DL-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:140px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">43819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Glycine</td>
			<td style="width:140px;">Biosolve</td>
			<td style="width:131px;">0007132391BS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">sodium orthovanadate (Na3VO4)</td>
			<td style="width:140px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">450243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Glycerol</td>
			<td style="width:140px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">G7757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">b-Glycerophospate</td>
			<td style="width:140px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">G9422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Milk powder</td>
			<td style="width:140px;">Migros/Switzerland</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Methanol</td>
			<td style="width:140px;">Millipore</td>
			<td style="width:131px;">1.06009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">sodium cloride (NaCl)</td>
			<td style="width:140px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">71380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:244px;">magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td style="width:140px;">Amresco</td>
			<td style="width:131px;">288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Sodium dodecyl sulphate (SDS)</td>
			<td style="width:140px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">L4509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td style="width:140px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">S-8045</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization of multi-subunit protein complexes of human mxa using non-denaturing polyacrylamide gel-electrophoresis

The formation of oligomeric complexes is a crucial prerequisite for the proper structure and function of many proteins. The interferon-induced antiviral effector protein MxA exerts a broad antiviral activity against many viruses. MxA is a dynamin-like GTPase and has the capacity to form oligomeric structures of higher order. However, whether oligomerization of MxA is required for its antiviral activity is an issue of debate. We describe here a simple protocol to assess the oligomeric state of endogenously or ectopically expressed MxA in the cytoplasmic fraction of human cell lines by non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) in combination with Western blot analysis. A critical step of the protocol is the choice of detergents to prevent aggregation and/or precipitation of proteins particularly associated with cellular membranes such as MxA, without interfering with its enzymatic activity. Another crucial aspect of the protocol is the irreversible protection of the free thiol groups of cysteine residues by iodoacetamide to prevent artificial interactions of the protein. This protocol is suitable for a simple assessment of the oligomeric state of MxA and furthermore allows a direct correlation of the antiviral activity of MxA interface mutants with their respective oligomeric states.

Using non-denaturing PAGE, we analyzed the oligomeric state of the human wild type MxA, the dimeric interface mutants MxA(R640A) and MxA(L617D) as well as the monomeric interface mutant MxA(M527D) from cell lysates 12. Cells were lysed in a buffer containing 1% octylphenoxypolyethoxyethanol (NP-40) and iodoacetamide to ensure protein solubilization and protection of free thiol groups (see Figure 1). As described before, salt and small metabolites were removed by dialysis 19. Protein...

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Characterization of Multi-subunit Protein Complexes of Human MxA Using Non-denaturing Polyacrylamide Gel-electrophoresis

This article describes a simple and rapid protocol to evaluate the oligomeric state of the dynamin-like GTPase MxA protein from lysates of human cells using a combination of non-denaturing PAGE with western blot analysis.

मानव MXA की बहु सबयूनिट प्रोटीन परिसरों की विशेषता गैर denaturing polyacrylamide जेल-वैद्युतकणसंचलन का उपयोग

The formation of oligomeric complexes is a crucial prerequisite for the proper structure and function of many proteins. The interferon-induced antiviral ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution

Oligonucleotide निर्देशित क्षालन का उपयोग कोशिकाओं से आत्मीय आरएनए प्रोटीन परिसरों का अलगाव

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

कोशिकाओं से मिलकर प्रोटीन परिसरों की आत्मीयता शुद्धि

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

ब्लू मूल निवासी पृष्ठ और प्रोटीन सहसंबंध रूपरेखा द्वारा समानता शुद्ध प्रोटीन परिसरों का समाधान करना

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

निलंबन सेल संस्कृतियों में डीएनए नुकसान-प्रेरित प्रोटीन परिसरों का पता लगाने और विज़ुअलाइज़ेशन निकटता के बंधन परख का उपयोग करना

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

प्रोटीन-आरएनए परिसरों की बढ़ी हुई जांच के लिए क्षैतिज जेल वैद्युतकणसंचलन

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

डीएनए पोलीमरेज़ गतिविधि परख का उपयोग कर के पास अवरक्त फ्लोरोसेंट लेबल डीएनए visualized द्वारा Acrylamide जेल ट्रो

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

Use of Two Dimensional Semi-denaturing Detergent Agarose Gel Electrophoresis to Confirm Size Heterogeneity of Amyloid or Amyloid-like Fibers

दो आयामी अर्द्ध denaturing डिटर्जेंट Agarose जेल ट्रो का उपयोग Amyloid या Amyloid फाइबर की तरह आकार विविधता की पुष्टि करने के लिए

Amyloid or amyloid-like fibers have been associated with many human diseases, and are now being discovered to be important for many signaling pathways. ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 में 1: प्रोटीन और प्रोटीन-Metabolite परिसरों के समानांतर विश्लेषण के लिए एक कदम संबध शुद्धि

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Analysis of AtHIRD11 Intrinsic Disorder and Binding Towards Metal Ions by Capillary Gel Electrophoresis and Affinity Capillary Electrophoresis

AtHIRD11 आंतरिक विकार का विश्लेषण और धातु आयनों की ओर बाध्यकारी केशिका जेल ट्रो और अपनत्व केशिका ट्रो

Plants are strongly dependent on their environment. In order to adjust to stressful changes (e.g., drought and high salinity), higher plants evolve ...

Analyzing Dynamic Protein Complexes Assembled On and Released From Biolayer Interferometry Biosensor Using Mass Spectrometry and Electron Microscopy

गतिशील प्रोटीन परिसरों का विश्लेषण पर इकट्ठे हुए और बायोमास स्पेक्ट्रोमेट्री और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर परत Interferometry से जारी

In vivo, proteins are often part of large macromolecular complexes where binding specificity and dynamics ultimately dictate functional outputs. In this ...