Name: perturbations of circulating mirnas in irritable bowel syndrome detected using a multiplexed high-throughput gene expression platform
Uploaded: 2016-11-30T13:00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Perturbations of Circulating miRNAs in Irritable Bowel Syndrome Detected Using a Multiplexed High-throughput Gene Expression Platform at JoVE.com

The authors acknowledge funding from the U.S. Department of Health and Human Services, the National Institutes of Health, the National Institute of Nursing Research, and the Division of Intramural Research to Wendy A. Henderson, 1ZIANR000018-01-06; the Intramural Research Training Awards to Nicolaas H. Fourie, Ralph M. Peace, Sarah K. Abey, and Leeanne B. Sherwin; and special support from the Burroughs Wellcome Fund to Howard Hughes-NIH Research Scholar Ralph M. Peace.
The opinions expressed herein and the interpretation and reporting of these data are the responsibility of the author(s) and should not be seen as an official recommendation, interpretation, or policy of the National Institutes of Health or the United States Government.

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	<li>Aerssens, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+Mucosal+Immunity+Identified+in+the+Colon+of+Patients+With+Irritable+Bowel+Syndrome.">Alterations in Mucosal Immunity Identified in the Colon of Patients With Irritable Bowel Syndrome.</a> Clin Gastroenterol Hepatol. 6, 194-205 (2008).</li><li>Akbar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+capsaicin+receptor+TRPV1-expressing+sensory+fibres+in+irritable+bowel+syndrome+and+their+correlation+with+abdominal+pain.">Increased capsaicin receptor TRPV1-expressing sensory fibres in irritable bowel syndrome and their correlation with abdominal pain.</a> Gut. 57, 923-929 (2008).</li><li>Fourie, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+circulating+miR-150+and+miR-342-3p+in+patients+with+irritable+bowel+syndrome.">Elevated circulating miR-150 and miR-342-3p in patients with irritable bowel syndrome.</a> Exp Mol Pathol. 96, 422-425 (2014).</li><li>Zhou, Q., Souba, W. W., Croce, C. M., Verne, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-29a+Regulates+Intestinal+Membrane+Permeability+in+Patients+with+Irritable+Bowel+Syndrome.">MicroRNA-29a Regulates Intestinal Membrane Permeability in Patients with Irritable Bowel Syndrome.</a> Gut. 59, 775-784 (2010).</li><li>Zhou, Q., Verne, G. 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W.A.H., S.K.A, N.H.F., and R.M.P. hold a US patent (no. PCT/US14/38638) for a circulating miRNA signature of IBS emanating from the research described herein.

प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम विशेष रूप से miRNA परख के लिए, यह unpurified lysates (इन mRNA और प्रोटीन assays में इस्तेमाल किया जा सकता है) का उपयोग नहीं करने के रूप में अभिकर्मकों lysates के साथ प्रयोग के लिए अनुकूलित नहीं किया गया है महत्वपूर्ण है, और नमूना तैयार प्रतिक्रियाओं हिचकते होने की संभावना है। इसके अतिरिक्त, दूषित पदार्थों को सेल और आरएनए शुद्धि चरणों (जैसे, guanidinium यौगिकों, इथेनॉल, और फिनोल) से खत्म किया बंधाव और नमूना शुद्धि प्रतिक्रियाओं को बाधित कर सकते हैं। अच्छी गुणवत्ता वाले आरएनए इसलिए संवेदनशीलता और miRNA परख की सटीकता के लिए महत्वपूर्ण है। एक गर्म ढक्कन के साथ एक thermocycler का उपयोग उचित तापमान नियंत्रण सभी प्रतिक्रिया कदम के प्रदर्शन का अनुकूलन करने के लिए सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है। कदम 3.5.1 के दौरान यह आदेश ligase के अलावा के दौरान तापमान बनाए रखने के लिए thermocycler से स्ट्रिप्स दूर करने के लिए महत्वपूर्ण नहीं है। स्ट्रिप्स हटाने ligase जोड़ने के लिएप्रतिक्रिया समझौता होगा। जब संकरण चरणों का प्रदर्शन, यह जब ट्यूबों में अभिकर्मकों मिश्रण जोरदार झटकों, pipetting, या flicking से बचने के लिए, के रूप में इस संवाददाता जांच कतरनी सकता है महत्वपूर्ण है। इष्टतम प्रदर्शन और स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए, यह अच्छी तरह से कोमल flicking द्वारा नलियों में अभिकर्मकों मिश्रण करने के लिए महत्वपूर्ण है। हमेशा मिश्रण के बाद प्रतिक्रियाओं नीचे स्पिन, और एक नया पिपेट हर बार एक अभिकर्मक सटीक pipetting सुनिश्चित करने के लिए और आकस्मिक पार संक्रमण से बचने के लिए तिरस्कृत है टिप का उपयोग करें। संशोधन और समस्या निवारण कोड सेट ब्याज की केवल लक्ष्य शामिल करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। इस तरह, लागत जब आगे की जांच या एक जैव हस्ताक्षर मान्य बड़ा नमूना सेट के परीक्षण के लिए अनुमति देने के लिए संतुलित किया जा सकता है। कस्टम जांच के जीन या एक ला कार्टे मेनू से उपलब्ध नहीं लक्ष्यों के लिए तैयार किया जा सकता। कम से प्रचुर मात्रा में लक्ष्य या कम एकाग्रता शाही सेना के लिए संवेदनशीलता हो सकता हैएक लंबे समय तक संकरण समय और / या उच्च संकल्प डिजिटल गिनती का उपयोग करके के लिए अनुमति से छेड़छाड़। हमारे अध्ययन में हम पूरे रक्त से कुल शाही सेना के साथ पूर्वनिर्धारित लक्ष्य 800 miRNA पैनल का इस्तेमाल किया; हालांकि, assays अगर एक अधिक लक्षित दृष्टिकोण की जरूरत है कम miRNAs शामिल करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। 24 नमूनों की कुल एक ही दिन में तैयार किया जा सकता है, 12 के दो सेट में कंपित, क्योंकि दो कारतूस आराम से रोबोट तैयार करने का स्टेशन पर पोस्ट-संकरण प्रसंस्करण के माध्यम से पारित किया जा सकता है और डिजिटल विश्लेषक पर imaged अगले दिन। 12 के बैच में नमूने के कंपित प्रसंस्करण संकरण समय मानकीकृत करने के लिए महत्वपूर्ण है। कारतूस कि imaged किया गया है को बचाया और 4 ओ सी rescanned जा करने में संग्रहीत डेटा विश्लेषण का सुझाव है कि एक उच्च संकल्प स्कैन दुर्लभ miRNAs का पता लगाने में सुधार हो सकता है, तो हो सकता है। दुर्लभ अणुओं का पता लगाने के भी लंबे समय तक के लिए नमूने hybridizing द्वारा सुधार किया जा सकता है, हालांकि, लंबे समय तक संकरण resul सकता हैoversaturation में टी और केवल परिणामों में सुधार हो सकता है, तो शुरू शाही सेना सांद्रता (बाह्य पुटिका व्युत्पन्न आरएनए के रूप में) कम कर रहे हैं। मंच की संवेदनशीलता और सटीक अपेक्षाकृत कम बहुतायत miRNAs मज़बूती से गिना जा करने की अनुमति। तकनीक की सीमाएं वर्णित जीन अभिव्यक्ति परख मंच केवल सरणी प्रति 800 लक्ष्यों पर निर्भर रह सकते हैं। इसलिए यह पूरी miRNA-transcriptome / पूरे transcriptome की पढ़ाई के लिए अनुकूल नहीं है। केवल जाना जाता है, का वर्णन किया है, और निर्दिष्ट लक्ष्य मंच का उपयोग कर पता लगाया जा सकता है, तो यह नया आणविक प्रजातियों की खोज के लिए अनुकूल नहीं है। ऐसे RNASeq या अन्य परंपरागत माइक्रोएरे तरीके के रूप में अन्य तरीकों, अधिक पूरे transcriptome खोजपूर्ण अध्ययन के लिए उपयुक्त हैं। मौजूदा / वैकल्पिक तरीके के लिए सम्मान के साथ तकनीक का महत्व IBS के लक्षणों का एक संयोजन के द्वारा होती है, principally पेट दर्द सहित; आंत अतिसंवेदनशीलता; और इस तरह बार-बार दस्त, कब्ज, या दोनों के संयोजन के रूप 9,10 आंत्र आदतों में परिवर्तन। IBS लक्षण कोई ज्ञात जैविक कारण है, और रोगियों को चिकित्सकीय महत्वपूर्ण सूजन, जठरांत्र ऊतकों, या प्रणालीगत मार्कर 9-12 की histopathological perturbations के साथ मौजूद नहीं है। शोध बताते हैं कि आईबीएस में जैविक अनियंत्रण, सूक्ष्म उपनैदानिक, और विषम है, आम विषयों में सूजन और प्रतिरक्षा समारोह में 10 के आसपास उभर रहा है। इसलिए, हम प्रयोगकर्ता से शुरू की भिन्नता को नियंत्रित करने और एक मंच है कि मज़बूती से जीन अभिव्यक्ति में सूक्ष्म perturbations पता लगाने में सक्षम था का उपयोग करने की जरूरत है। परख और इस प्रणाली के अद्वितीय विशेषताओं नमूना प्रसंस्करण मानकीकरण और स्वचालन के माध्यम से निपटने के प्रयोगकर्ता को कम करने, तकनीकी विचरण को कम करने के अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य डेटा का उत्पादन करने के लिए। इन सुविधाओं को ध्यान केंद्रित जांच के लिए अनुमति देते हैं और बेहद सटीक और अनुसंधान का उत्पादनeplicable डेटा। यह जब तीव्रता या प्रवर्धन आधारित विधियों का उपयोग कर कम अभिव्यक्ति लक्ष्य है कि अनदेखी या लादा जा सकता है और अधिक प्रचुर मात्रा में लक्ष्य के संकेतों के बीच में सूक्ष्म perturbations और perturbations का पता लगाने के लिए अनुमति देता है। पीसीआर आधारित प्रोटीन और RNAseq तरीकों वर्णित मंच का उपयोग करने के लिए व्यवहार्य विकल्प हैं और विकल्प के रूप में आकर्षक हो सकता है जब उच्च throughputs आवश्यक हैं या जब उद्देश्य पूरे transcriptome को चिह्नित करने के लिए या उपन्यास अणुओं के लिए लग रही है। हालांकि, विकल्प सही ढंग से और संवेदनशीलता का पता लगाने और दुर्लभ लक्ष्य और सूक्ष्म perturbations quantitating में रूप में अच्छा प्रदर्शन नहीं कर सकते। भविष्य के अनुप्रयोगों या दिशा-निर्देश के बाद इस तकनीक में माहिर आईबीएस प्रतिभागियों में घूम miRNA अभिव्यक्ति perturbations कि दोनों महत्वपूर्ण और श्रेणियों के भीतर अनुरूप होना पाया गया के एक नंबर से पता चला है। पहचान miRNAs प्रासंगिक pathwa के साथ जुड़े थेवाईएस और एक कार्यात्मक दर्द हालत (मीर 342-3p: पुरानी मूत्राशय में दर्द) सहित रोग की स्थिति, 8 और सूजन (मीर 150) 13। उदाहरण के अध्ययन के एक खोजपूर्ण लक्ष्य और हित के सिस्टम को परिभाषित करने के लिए इस्तेमाल पलटन के आधार पर किया गया था। अधिक लक्षित, छोटे miRNA सरणी तो निर्माण किया गया था, नमूना लागत प्रति कम करने और आदेश मान्य है और हस्ताक्षर और बायोमार्कर को परिष्कृत करने में एक लागत प्रभावी तरीके से विश्लेषण किया जाना बहुत बड़ा साथियों के लिए अनुमति देता है। जीन अभिव्यक्ति मंच परख प्रणाली माइक्रोएरे के पारंपरिक खोजपूर्ण प्रकृति और अधिक लक्षित, परिकल्पना संचालित डेटा को निखारने और आणविक हस्ताक्षर और बायोमार्कर 14-16 का परीक्षण करने के संग्रह के बीच एक संतुलन बनाता है। विधि विवो में और इन विट्रो मॉडल में आणविक और प्रोटीन perturbations जांच करने के लिए जहां वर्णित लक्ष्य miRNAs प्रयोगात्मक हैं अधिक व्यक्त या हिचकते इस्तेमाल किया जाएगा। न्यू assays mRNAs और पी के एक साथ मात्रा का ठहराव के लिए अनुमतिसेल और ऊतक lysates से सीधे roteins। इसके अलावा, परिधीय रक्त और मलमूत्र (जैसे, मूत्र) के विशिष्ट अंशों की शुद्धि के अनुकूलन के द्वारा और अनुरूपण और कुछ परख मापदंडों, आणविक प्रोफाइल और कम आणविक एकाग्रता भिन्न (जैसे, exosomal अंशों) के हस्ताक्षर के अनुकूलन के द्वारा जांच की जाएगी।

सामान्य आबादी का 15% और स्वास्थ्य सेवाओं पर एक महत्वपूर्ण बोझ का प्रतिनिधित्व - चिड़चिड़ा आंत्र सिंड्रोम (आईबीएस) गैस्ट्रोएंटरोलॉजी में सबसे आम आउट पेशेंट निदान, afflicting 10 है। IBS के लिए वर्तमान में, वहाँ कोई आम तौर पर स्वीकार किए जाते हैं नैदानिक बायोमार्कर (यानी, निदान नैदानिक लक्षणों पर आधारित है और इस तरह के सैनिक द्रोह, सूजन आंत्र रोग, और जठरांत्र (सैनिक) संक्रमण के रूप में अन्य जैविक विकारों, बाहर राज कर रही है)। जब इस तरह के आईबीएस, उच्च संवेदनशीलता और सटीकता (reproducibility) के रूप में उपनैदानिक ऊतकविकृतिविज्ञानी के साथ आम की स्थिति में जीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल का अध्ययन, जरूरत के रूप में जीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल में अव्यवस्थाएं अक्सर सूक्ष्म 1-3 कर रहे हैं। miRNAs आईबीएस 4,5 में दोनों नैदानिक और कार्यात्मक लक्ष्य के रूप में पहचान की गई है, और हम विशेष रूप से आईबीएस से जुड़े जैविक perturbations 3,4,6,7 की बायोमार्कर घूम रूप में उनके उपयोग का आकलन करने में रुचि रखते हैं। circula के नैदानिक ​​उपयोगटिंग बायोमार्कर आसानी और रोगियों से बायोमार्कर &#39;स्रोत (जैसे, परिधीय रक्त) के संग्रह का न्यूनतम आक्रामक प्रकृति के कारण मौजूदा ब्याज की है। जीन अभिव्यक्ति assays मंच, उनके अद्वितीय रसायन शास्त्र और सुव्यवस्थित, ज्यादातर स्वचालित कार्यप्रवाह की वजह से, कि लक्षित खोज के लिए transcriptome की व्यापक और अनुकूलन कवरेज (एक भी प्रतिक्रिया में 800 लक्ष्य) प्रदान करता है एक माइक्रोएरे मंच प्रदान करते हैं। उन्होंने यह भी transcriptomic लक्ष्यों की मात्रा का ठहराव में अभिव्यक्ति के स्तर की एक व्यापक स्पेक्ट्रम से अधिक उच्च परिशुद्धता और linearity निकलेगा। परख शाही सेना की रिवर्स प्रतिलेखन, सीडीएनए, या किसी अन्य एंजाइमी प्रतिक्रियाओं जिसके परिणामस्वरूप के प्रवर्धन की आवश्यकता नहीं है। इस प्रकार, कम बहुतायत या दुर्लभ ब्याह वेरिएंट के साथ शाही सेना प्रजातियों से प्रवर्धन के उच्च चक्र संख्या द्वारा शुरू की संभावित त्रुटियों डिजिटल गिनती की प्रक्रिया द्वारा कम हो रहे हैं। इसका मतलब यह है कि इस तरह के शुद्ध कुल के रूप में नमूना प्रकार की एक विस्तृत विविधताआरएनए (यानी, mRNA + miRNA), आरएनए formalin तय आयल एम्बेडेड (FFPE) नमूनों, साथ ही कच्चे तेल के ऊतकों और सेल lysates से, assays के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है। ब्याज की RNAs जांच (कब्जा है और रिपोर्टर जांच) की एक जोड़ी का उपयोग, प्रत्येक एक लक्ष्य विशिष्ट अनुक्रम कि लक्ष्य शाही सेना पर एक इसी क्षेत्र पहचानता युक्त पता चला रहे हैं। आदेश में कम आरएनए (यानी, miRNAs) का पता लगाने को सुनिश्चित करने के लिए, परिपक्व miRNA अनुक्रम अणु के 3 &#39;अंत के लिए एक अनूठा oligonucleotide टैग (miRtag) annealing द्वारा लम्बी है। एक ब्रिजिंग oligonucleotide है, जो दोनों परिपक्व लक्ष्य miRNA और miRNA-विशिष्ट miRtag के एक हिस्से के लिए मानार्थ है, अनुक्रम विशिष्टता सुनिश्चित करने के लिए प्रयोग किया जाता है। कैद और रिपोर्टर जांच क्रमश: 3 &#39;और 5&#39; के लिए ligate, परिपक्व miRNA-miRtag परिसर के समाप्त होता है। कब्जा जांच 3 &#39;अंत में एक बायोटिन लेबल है, जो उन्हें एक streptavidin लेपित गिलास स्लाइड की सतह को संलग्न करने की अनुमति है, fixiएनजी स्लाइड करने के लिए कब्जा जांच miRNA-miRtag-रिपोर्टर जांच जटिल है। एक विद्युत प्रवाह तो इजाजत दी फ्लोरोसेंट 5 &#39;अंत पर रिपोर्टर जांच के द्वारा किया बारकोड को एक माइक्रोस्कोप और आरोप युग्मित डिवाइस (सीसीडी) कैमरे का उपयोग कर देखे जा करने के लिए, स्लाइड सतह पर जटिल उन्मुख करने के लिए प्रयोग किया जाता है। बारकोड गिना और डीकोड कर रहे हैं, विशेष लक्ष्य miRNAs की गिनती उपज। फ्लोरोसेंट बारकोड छह पदों है कि चार फ्लोरोसेंट रंगों में से एक द्वारा कब्जा किया जा सकता है, जो 4,000 से अधिक रंग-बारकोड संयोजन, एक विशिष्ट शाही सेना के लिए प्रत्येक कोडिंग के निर्माण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के होते हैं। नमूना तैयार (यानी, शाही सेना शुद्धि या सेल / ऊतक lysate तैयारी), साथ ही कब्जा है और रिपोर्टर जांच के संकरण, बेंच पर किया जाता है। बारह नमूनों एक एकल स्लाइड पर मल्टिप्लेक्स जा सकता है। रात भर संकरण के बाद, आगे की सभी नमूना तैयार करना एक रोबोट तैयार करने का स्टेशन द्वारा किया जाता है। लोड स्लाइड फिर विज्ञापन करने के लिए स्थानांतरित कर रहे हैंइमेजिंग, गिनती, डिकोडिंग, और डाटा प्रोसेसिंग के लिए igital विश्लेषक। परिणामी डेटा साथ सॉफ्टवेयर, जहां वे आगे उपयोगकर्ता नियंत्रण के एक उच्च डिग्री के साथ कार्रवाई कर रहे हैं करने के लिए आयात कर रहे हैं। अनूठा रसायन विज्ञान, सरल तैयारी, स्वचालित प्रकृति, सरल डेटा प्रकार (मायने रखता है), और परख के समग्र सुव्यवस्थित कार्यप्रवाह उच्च परिशुद्धता जीन अभिव्यक्ति मात्रा का ठहराव की सुविधा है, यह इस तरह के रूप में कार्य की स्थिति में घूम miRNA अभिव्यक्ति प्रोफाइल और हस्ताक्षर के अध्ययन में एक उपयोगी उपकरण बना रही है आईबीएस।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="758">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:221px;">nCounter Prep-Station</td>
			<td style="width:221px;">Nanostring</td>
			<td style="width:108px;">N/A</td>
			<td style="width:208px;">Essential</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">nCounter Digital Analyzer</td>
			<td>Nanostring</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Essential</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Spectrophotometer</td>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>ND-1000</td>
			<td>Can use suitable equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Centrifuge</td>
			<td>Any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Can use suitable equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MiniMicroCentrifuge</td>
			<td>Any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Can use suitable equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pipettes (1000, 100, 20, 10ul)</td>
			<td>Any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Can use suitable equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Qiacube</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>9001292</td>
			<td>Can use suitable equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PAXgene Blood miRNA Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>763134</td>
			<td>Can use suitable equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PAXgene Blood Tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>77776-026</td>
			<td>Can use suitable equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">nCounter Human miRNA Assay Kit</td>
			<td>Nanostring</td>
			<td>150625</td>
			<td>Essential</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">nCounter Master Kit</td>
			<td>Nanostring</td>
			<td>100050</td>
			<td>Essential</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">nSolver</td>
			<td>Nanostring</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Essential</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

perturbations of circulating mirnas in irritable bowel syndrome detected using a multiplexed high-throughput gene expression platform

जीन अभिव्यक्ति मंच परख एक भी प्रतिक्रिया में अप करने के लिए 800 टेप (mRNA या miRNAs) की अभिव्यक्ति की मजबूत और अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देता है। miRNA परख सीधे इमेजिंग और डिजिटल miRNA अणुओं है कि कलर-कोडेड फ्लोरोसेंट बारकोड वाले जांच के सेट (एक पत्रकार की जांच और एक पर कब्जा जांच) के साथ चिह्नित कर रहे हैं गणना के द्वारा टेप में गिना जाता है। बारकोड miRNAs कि 3 &#39;के अंत के लिए एक अनूठा oligonucleotide टैग (miRtag) ligating द्वारा लम्बी दिया है परिपक्व करने के लिए सीधे संकरित हैं। रिवर्स प्रतिलेखन और टेप के प्रवर्धन की आवश्यकता नहीं है। रिपोर्टर जांच के छह रंग चार फ्लोरोसेंट रंगों के संयोजन का उपयोग आबादी वाले पदों के एक दृश्य होते हैं। छह पदों पर चार रंगों में एक जीन विशिष्ट रंग बारकोड अनुक्रम का निर्माण करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। पोस्ट-संकरण प्रसंस्करण के लिए एक रोबोट तैयार करने का स्टेशन पर स्वचालित है। संकरण, अतिरिक्त जांच, धुल रहे हैं और त्रिपक्षीय ढांचे (कब्जा समर्थक के बादहो-miRNA-रिपोर्टर जांच) बायोटिन लेबल पर कब्जा जांच के माध्यम से एक streptavidin लेपित स्लाइड करने के लिए तय कर रहे हैं। इमेजिंग और बारकोड गिनती एक डिजिटल विश्लेषक का उपयोग किया जाता है। स्थिर बारकोड वाले miRNAs कल्पना कर रहे हैं और एक माइक्रोस्कोप और कैमरे का उपयोग imaged, और अद्वितीय बारकोड को डीकोड और गिने जाते हैं। डेटा गुणवत्ता नियंत्रण (क्यूसी), सामान्य, और विश्लेषण एक कस्टम डिजाइन डाटा प्रोसेसिंग और विश्लेषण सॉफ्टवेयर है कि परख सॉफ्टवेयर accompanies से मदद कर रहे हैं। परख अभिव्यक्ति का एक व्यापक रेंज पर उच्च linearity, साथ ही उच्च संवेदनशीलता को दर्शाता है। नमूना और परख तैयारी एंजाइमी प्रतिक्रियाओं, रिवर्स प्रतिलेखन, या प्रवर्धन शामिल नहीं करता है; कुछ कदम है; और काफी हद तक स्वचालित है, अन्वेषक प्रभाव को कम करने और उच्च स्थिरता और तकनीकी reproducibility में जिसके परिणामस्वरूप। यहाँ, हम चिड़चिड़ा आंत्र सिंड्रोम में घूम miRNA perturbations की पहचान करने के लिए इस प्रौद्योगिकी के अनुप्रयोग का वर्णन है।

कार्यात्मक विकारों में transcriptomic गड़बड़ी सूक्ष्म हो सकता है, और आदेश में मज़बूती से अभिव्यक्ति में उन सूक्ष्म परिवर्तन का पता लगाने के लिए, जीन अभिव्यक्ति की मात्रा का ठहराव सटीक होने की जरूरत है। जीन अभिव्यक्ति मंच परख प्रणाली अपने अत्यधिक स्वचालित प्रकृति के माध्यम से तकनीकी शोर कम कर देता है, और अद्वितीय रसायन विज्ञान इसे इस्तेमाल करता है उच्च परिशुद्धता जीन अभिव्यक्ति डेटा पैदा करता है। तकनीकी चित्र में दिखाया गया replicates 1 दोनों अंतर्जात (नीले डॉट्स) में उच्च reproducibility और वायरल miRNA (नारंगी डॉट्स, गृह व्यवस्था जीन पीले डॉट्स द्वारा प्रतिनिधित्व कर रहे हैं) को प्रदर्शित अभिव्यक्ति मात्रा का ठहराव है कि इस विधि का उपयोग संभव है। इस विधि, वायरल (चित्रा 2A) और अंतर्जात (चित्रा 2 बी) miRNAs कि उम्मीद की अभिव्यक्ति से विचलन दिखाने के लिए, के रूप में स्वस्थ अध्ययन प्रतिभागियों द्वारा परिभाषित का उपयोग करना, आईबीएस में ब्याज की लक्ष्य के रूप में पहचाना जा सकता है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि यह स्पष्ट नहीं है कि वायरल miRNAsयहां पता चला मानव जीनोम में या वायरल लोड से एकीकृत वायरल जीन से निकाले जाते हैं। परख केवल एकल न्यूक्लियोटाइड विशिष्टता के साथ परिपक्व miRNAs में गिना जाता है के रूप में, समान अंतर्जात मानव miRNAs के साथ पार संकरण की संभावना नहीं है। बहरहाल, इन अणुओं के अंतर स्थिर राज्य स्तरों बायोमार्कर के रूप में ब्याज की हैं। के रूप में इन टेप के सही पता लगाने के अधिक प्रचुर मात्रा में टेप से बाहर लादा नहीं कर रहे हैं विधि की परिशुद्धता, कम अभिव्यक्ति लक्ष्यों के बीच perturbations पता लगाया जा करने के लिए अनुमति देता है। सूक्ष्म perturbations भी मज़बूती से मनाया जा सकता है। आंकड़े 3 और 4 IBS और IBS-उपप्रकार स्वस्थ नियंत्रण की तुलना में miRNAs घूम में इन perturbations के कुछ शो, और आंकड़े 5 और 6 (दोनों 3 से अनुकूलित) के दो सबसे महत्वपूर्ण विभिन्न ऊंचा दिखाने miRNAs (चित्रा 5: miRNA 342-3p, चित्रा 6: miRNA 150)। आईबीएस प्रतिभागियों में यह आंकड़ा 6<html> संबंधित सॉफ्टवेयर द्वारा उत्पन्न परिणामों की चित्रमय उत्पादन का एक उदाहरण है। <img alt="आकृति 1" src="/files/ftp_upload/54693/54693fig1.jpg" /> । चित्रा 1: दो तकनीकी replicates से सामान्यीकृत गिनता तकनीकी दो अलग-अलग कारतूस पर चलने प्रतिकृति के उच्च रैखिक संबंध दिखाने (2 आर = 0.90, y = 1.03x - 0.4) सामान्यीकृत की सीमा पर (ऊपर 100 के लिए सामान्यीकृत व्यक्त miRNAs) miRNA मायने रखता है (एक्स पर log2 मायने रखता है और शाफ़्ट)। तितर बितर साजिश पीला (8 जीन) में ब्लू (654 miRNAs) में अंतर्जात मानव miRNAs के लिए डेटा, नारंगी (80 miRNAs) में अंतर्जात वायरल miRNAs, और गृह व्यवस्था जीन भी शामिल है। अंतर्जात वायरल miRNAs परख के पिछले संस्करणों (संस्करण 1.4 यहां इस्तेमाल किया गया था) पर उपलब्ध थे, लेकिन अब नहीं, मानक परख पर शामिल किए गए हैं, हालांकि वे कस्टम अतिरिक्त के रूप में उपलब्ध हैं।/54693fig1large.jpg &quot;लक्ष्य =&quot; _blank &quot;&gt; यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। <img alt="चित्र 2" src="/files/ftp_upload/54693/54693fig2.jpg" /> चित्रा 2:। आईबीएस-कब्ज (IBS- सी) बनाम स्वस्थ नियंत्रण में वायरल और अंतर्जात मानव miRNAs की सामान्यीकृत गिनता perturbations (क) में वायरल (नारंगी) और (ख) अंतर्जात मानव miRNAs (नीला) इस उदाहरण है, जहां में स्पष्ट कर रहे हैं miRNA आईबीएस-सी प्रतिभागियों (शाफ़्ट) के मायने रखता है (log2 तब्दील) स्वस्थ नियंत्रण (एक्स अक्ष) की miRNA मायने रखता है (log2 तब्दील हो) के खिलाफ वहीं रहे हैं। miRNAs की बहुमत आबादी में दोनों बहुत इसी तरह व्यक्त करते हैं, लेकिन कुछ विशेष रूप से सह-संबंध से विचलित। इन विचलन दोनों दुर्लभ और बहुतायत से व्यक्त लक्ष्यों के बीच में स्पष्ट कर रहे हैं। <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54693/54693fig2large.jpg" target="_blank">कृपया</a>यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। <img alt="चित्र तीन" src="/files/ftp_upload/54693/54693fig3.jpg" /> चित्रा 3:। MiRNAs गौरतलब है और समान रूप से विभिन्न स्वस्थ नियंत्रण की तुलना में आईबीएस में व्यक्त कर रहे विभिन्न व्यक्त आईबीएस में miRNAs रैखिक विभेदक विश्लेषण प्रभाव आकार विधि है, जो श्रेणियों के भीतर स्थिरता के लिए जाँच के साथ सांख्यिकीय महत्व का परीक्षण को जोड़ती है का उपयोग कर पता चला रहे हैं। <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54693/54693fig3large.jpg" target="_blank">करने के लिए यहाँ क्लिक करें यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए।</a> <img alt="चित्रा 4" src="/files/ftp_upload/54693/54693fig4.jpg" /> चित्रा 4:। MiRNAs गौरतलब है और समान रूप से विभिन्न आईबीएस उपप्रकारों में व्यक्त कर रहे हैं स्वस्थ नियंत्रण की तुलना में miRNAs di थे(: दस्त, सी: डी कब्ज) fferentially आईबीएस-उपप्रकारों में व्यक्त किया। रैखिक विभेदक विश्लेषण प्रभाव आकार विधि है, जो श्रेणियों के भीतर स्थिरता के लिए जाँच के साथ सांख्यिकीय महत्व का परीक्षण को जोड़ती है का उपयोग कर स्वस्थ नियंत्रण की तुलना में <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54693/54693fig4large.jpg" target="_blank">एक बड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें यह आंकड़ा का संस्करण।</a> <img alt="चित्रा 5" src="/files/ftp_upload/54693/54693fig5.jpg" /> चित्रा 5:। MiRNA-342-3p के अंतर अभिव्यक्ति अज्ञात एटियलजि की जीर्ण पेट दर्द IBS के एक प्रमुख लक्षण है। बॉक्स साजिश से पता चलता है कि मीर 342-3p (y अक्ष पर सामान्यीकृत मायने रखता है), अज्ञात एटियलजि की पुरानी मूत्राशय में दर्द के साथ जुड़े एक miRNA, स्वस्थ नियंत्रण की तुलना में सभी आईबीएस उपप्रकार भर में उच्च मायने रखता है पर संचलन में उपस्थित होने के लिए मिला था। सलाखों के गैर-ग़ैर रेंज का प्रतिनिधित्व करते हैं, बॉक्सतों अंतर-चतुर्थक विस्तार और नीले वर्ग मंझला गिनती। 3 से संशोधित। <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54693/54693fig5large.jpg" target="_blank">यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a> <img alt="चित्रा 6" src="/files/ftp_upload/54693/54693fig6.jpg" /> चित्रा 6: miRNA-150 के अंतर अभिव्यक्ति दिखा रहा है कि आईबीएस प्रतिभागियों काफी अधिक थी स्वस्थ नियंत्रण (y अक्ष पर log2 तब्दील मायने रखता है) की तुलना में घूम मीर 150 मायने रखता है एक वायलिन साजिश है।। घटता श्रेणी में गिना जाता है की आवृत्ति संकेत मिलता है, ऊर्ध्वाधर सलाखों 1 और 3 चतुर्थकों प्रतिनिधित्व करते हैं, और लाल चौक मंझला गिनती इंगित करता है। 3 से संशोधित। <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54693/54693fig6large.jpg" target="_blank">यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a>

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Perturbations of Circulating miRNAs in Irritable Bowel Syndrome Detected Using a Multiplexed High-throughput Gene Expression Platform

We describe the use of a multiplexed high-throughput gene expression platform that quantitates gene expression by barcoding and counting molecules in biological substrates without the need for amplification. We used the platform to quantitate microRNA (miRNA) expression in whole blood in subjects with and without irritable bowel syndrome.

चिड़चिड़ा आंत्र सिंड्रोम में miRNAs परिसंचारी की perturbations एक मल्टिप्लेक्स उच्च throughput जीन एक्सप्रेशन प्लेटफार्म का उपयोग कर पाया

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in ...

Research

JoVE Journal

Genetics

A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

उच्च throughput मूलतत्त्व अलगाव और परिवर्तन के लिए एक रोबोट मंच

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The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

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High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

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परिपत्र गुणसूत्र अनुरूप कब्जा की अगली पीढ़ी के अनुक्रमण का उपयोग जीन विनियामक अनुक्रम का उच्च प्रवाह पहचान (4c-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

अंतर्जात जीन अभिव्यक्ति के हेरफेर के लिए दूरस्थ नियंत्रण प्रणाली के vivo आवेदन में

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