Name: retroviral transduction of helper t cells as a genetic approach to study mechanisms controlling their differentiation and function
Uploaded: 2016-11-04T15:00:00
Duration: 11 min 50 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function at JoVE.com

This work was supported by a Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) grant (BB/H018573/1) and a BD Biosciences grant.

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	<li>Baumjohann, D., Ansel, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-mediated+regulation+of+T+helper+cell+differentiation+and+plasticity.">MicroRNA-mediated regulation of T helper cell differentiation and plasticity.</a> Nat Rev Immunol. 13 (9), 666-678 (2013).</li><li>Wilson, C. B., Rowell, E., Sekimata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+control+of+T-helper-cell+differentiation.">Epigenetic control of T-helper-cell differentiation.</a> Nat Rev Immunol. 9 (2), 91-105 (2009).</li><li>Pearce, E. L., Poffenberger, M. C., Chang, C. H., Jones, R. 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The authors have no conflicting interest in the publication of this work.

Rétrovirale surexpression de gènes à médiation est un moyen puissant pour analyser la fonction des cellules T auxiliaires, comme le développement et la fonction est souvent déterminée par le niveau des régulateurs clés de l&#39;expression. Cependant, une interprétation prudente des résultats est nécessaire parce que les niveaux d&#39;expression significativement supérieurs à ceux du gène endogène peuvent introduire de nombreux artefacts. Par conséquent, cette technique devrait être combinée avec d&#39;autres pour vérifier la pertinence de la fonction. Par exemple, la surexpression devrait être complété par une expression réduite en utilisant des ARNsi ou KOs géniques si disponible. Avec miARN, nous complétions expériences de surexpression avec ceux de blocage en utilisant des virus qui surexprimés miARN artificiel ciblant les sites qui ont agi comme des inhibiteurs compétitifs pour un miRNA 15. les cellules transduites rétroviraux peuvent également être utilisés dans des dosages biochimiques impliquant l&#39;ARN et l&#39;analyse des protéines. Toutefois, une limitation majeure de ces expériences est l&#39;efficacité de la résolution de transductionUlting dans une population mixte de cellules transduites et non transduites. Par conséquent, ces essais seront très probablement besoin de tri de la GFP + population. Enfin, tests in vitro de différenciation doivent être combinées avec des expériences in vivo, et une façon d&#39;y parvenir est par le transfert adoptif des cellules T transduites à des souris et à la suite de leur différenciation et leur effet sur la réponse immunitaire. L&#39;une des principales limitations de ce système est la taille du génome de l&#39;ARN qui peut être encapsidé dans la capside rétrovirale. Dans notre expérience, la taille de l&#39;insert maximum pour MIG système rétroviral qui donne une bonne production de virus est de 3-3,5 kb. Par conséquent, les gènes plus grands ne peuvent pas être analysés avec ce système, car ils donnent des titres viraux pauvres. Cependant, la plupart des gènes sont plus petites que cette dimension si ce système est utile pour une grande variété d&#39;études génétiques. Avec une transduction rétrovirale, plusieurs variantes dans le cadre de ces protocols ont été utilisés. De nombreux chercheurs ont utilisé des lignées cellulaires d&#39;encapsidation qui expriment de manière stable les gènes rétroviraux (par exemple , référence 16). Cependant, nous avons obtenu les titres les plus élevés en utilisant des cellules HEK 293T standard par co-transfection du vecteur de virus auxiliaire pCL-Eco. L&#39;isolement des cellules auxiliaires T naïfs peut également être réalisée par le tri, plutôt que le bourrelet et la séparation des cellules protocole de colonne magnétique de cellules, mais cela nécessite un accès à un trieur de cellules, et les coûts pour le temps de tri sont généralement plus élevées que les réactifs de perles. Enfin, il existe des variations sur les conditions d&#39;activation utilisées pour différencier les cellules T auxiliaires dans les différents sous-ensembles. Par exemple, la stimulation du TCR des cellules trop longtemps avant l&#39; exposition Treg conditions induisant peut inhiber leur induction 16. Cela peut être un problème parce que l&#39;expression rétrovirale nécessite la division cellulaire induite par la stimulation des cellules. Néanmoins, nous avons trouvé efficace induction Treg utilisant ce protocole avec O / N activation avant la transduction rétrovirale. Au sein de ces protocoles, l&#39;application réussie nécessite plusieurs facteurs. préparations de retrovirus à titre élevé ont besoin transfection efficace des cellules HEK 293T d&#39;ADN afin de haute qualité et précisément préparé 2x HBS sont importants. En outre, la densité cellulaire des cellules HEK 293T doit être d&#39;environ 50% au point de transfection parce que la bonne expression de l&#39;ADN transfectées exige que les cellules sont en pleine croissance, et cela va être inhibée si les cellules sont trop rares ou dense. Les cellules à la densité optimale pendant la transfection devraient atteindre la confluence à un moment donné au cours des étapes de collecte de virus, mais ils vont continuer à produire des stocks de virus à titre élevé tout au long de la dernière collection. Une différenciation efficace des cellules T auxiliaires nécessite une bonne qualité de la cellule afin d&#39; assurer que les cellules sont isolées à la pureté illustrée sur la figure 1. De même, la qualité des cellules est dépendante de la souris from laquelle ils ont été isolés. Pour ces études, nous avons utilisé 6-8 semaines C57BL / 6 de souris. souris âgées peuvent avoir des cellules moins naïfs, et d&#39;autres souches peuvent différer dans leur différenciation. Par exemple, des souris BALB / c sont plus sujettes à Th2 que C57BL / 6 17 manière indiquée ci - dessus, C57BL / 6 cellules T peuvent être difficiles à induire une réponse Th2. En outre, l&#39;une des conditions de différenciation peut varier légèrement d&#39;un laboratoire à, et l&#39;effet de la surexpression du gène ne peuvent apparaître dans des conditions sous-optimales afin concentrations de cytokine dans les différentes conditions de polarisation peuvent avoir besoin d&#39;être titrée. Enfin, les effets du gène surexprimé ou les conditions de polarisation sur la prolifération cellulaire peuvent influencer l&#39;efficacité de transduction de sorte que les effets de mesure du gène d&#39;intérêt peuvent nécessiter d&#39;optimiser le temps et la concentration des réactifs de polarisation. Optimisation de tous ces facteurs devrait conduire à des résultats d&#39;information avec ce système.

The immune response must be highly regulated to eliminate infections but prevent attacks on self-tissue that lead to autoimmunity. Helper T cells play an essential role in regulating the immune response, and a great deal of effort has been undertaken to understand their development and function (illustrated in several recent reviews 1-3). However, many questions remain, and many approaches have been utilized to study the mechanisms controlling helper T cell development and function. These have ranged from the use of in vitro cell culture systems to whole animals. Cell culture systems, especially those using cell lines, offer the benefit of ease of use and the ability to generate large amount of material to do sophisticated biochemical analyses. However, they suffer from their limited ability to reproduce the actual conditions occurring in an immune response. In contrast, whole animal experiments offer the benefit of relevance, but they can suffer from difficulties in manipulation and the ability to perform precise controls in addition to their large costs and ethical implications. Nevertheless, the vast majority of helper T cells studies today still require the use of whole animal experiments involving primary T cells because of the inability of cell lines to duplicate the exact steps occurring in the whole animal. Therefore, it is essential to utilize cost effective approaches that are highly informative. 
Genetics is one powerful tool to study helper T cell development and function, yet traditional methods involving gene knockouts or transgenes are time consuming and expensive so they are often out of reach of small labs. However, retroviral transduction offers a powerful, rapid and, cost effective genetic approach to study the mechanisms of specific gene products. Therefore, it is commonly used in papers studying helper T cell development and function. 
We have optimized a procedure for retroviral transduction of helper T cells. It utilizes the pMIG (Murine stem cell virus-Internal ribosomal entry site-Green fluorescent protein) retroviral expression vector, in which the gene of interest can be cloned and thereby expressed from the retrovirus long terminal repeat (LTR) 4. In addition, downstream of the inserted gene of interest is an internal ribosome entry sequence (IRES) followed by the green fluorescent protein (GFP) gene so transduced cells can easily be followed by their expression of GFP. The vector was originally derived from the Murine Stem Cell Virus (MSCV) vectors, which contain mutations in repressor binding sites in the LTRs making them resistant to silencing and thus, giving high expression in many cell types including helper T cells 5,6. Production of high titer retrovirus requires a simple transient transfection protocol of human embryonic kidney (HEK) 293T cells with the MIG vector and a helper virus vector that expresses the retroviral GAG, Pol, and Env genes. For this the pCL-Eco helper virus vector 7 works well in producing high titer replication incompetent retroviruses. 
Here these protocols for retroviral production and transduction of primary murine T cells are described in addition to some of our results using this approach to study miRNA regulation of gene expression controlling helper T cell differentiation. miRNAs are small RNAs of approximately 22 nucleotides in length that post-transcriptionally regulate gene expression by targeting homologous sequences in protein encoding messenger RNAs and suppressing translation and inducing message instability 8,9. miRNAs play critical roles in developmental gene regulation. They are essential in the earliest stages of development, as embryos that cannot produce miRNAs die at a very early stage 10. In addition miRNAs are important later on in the development of many tissues. They are thought to function by fine-tuning the expression of genes required for developmental programs 1. In helper T cells miRNAs play multiple roles and are required for regulatory T cell (Treg) development 11-14. We used retroviral transduction as a means to dissect the mechanisms of miRNA regulation of Treg differentiation 15. Through such studies important individual miRNAs were determined by retroviral-mediated overexpression. Subsequently, relevant genes regulated by these miRNAs were identified in order to understand the molecular pathways regulated by miRNAs in helper T cell differentiation.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="763">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">RPMI</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">R8758</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">DMEM</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">D5671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Penicillin Streptomycin solution</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">DPBS</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">MIG vector</td>
			<td style="width:143px;">Addgene</td>
			<td style="width:167px;">Plasmid 9094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">pCL-Eco vector</td>
			<td style="width:143px;">Addgene</td>
			<td style="width:167px;">Plasmid 12371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Cell strainer</td>
			<td style="width:143px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:167px;">352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Magnetic beads mouse CD4 cell kit&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Invitrogen (Dynabeads)</td>
			<td style="width:167px;">11415D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Streptavidin Beads&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Miltenyi Biotech</td>
			<td style="width:167px;">130-048-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">MS cell separation columns</td>
			<td style="width:143px;">Miltenyi Biotech</td>
			<td style="width:167px;">130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">LS cell separation columns</td>
			<td style="width:143px;">Miltenyi Biotech</td>
			<td style="width:167px;">130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">CD25 Biotenylated MAb&#160;</td>
			<td style="width:143px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:167px;">85059</td>
			<td>clone 7D4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">CD62L Biotenylated MAb&#160;</td>
			<td style="width:143px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:167px;">553149</td>
			<td>clone MEL-14</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Polybrene (Hexadimethrine Bromide)</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">107689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-CD3</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td>16-0031-85</td>
			<td>clone 145-2C11&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-CD28</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td>16-0281-85</td>
			<td>clone 37.51&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-IL-4</td>
			<td style="width:143px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:167px;">559062</td>
			<td>clone 11B11</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-IFN-gamma</td>
			<td style="width:143px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:167px;">559065</td>
			<td>clone XMG1.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-IL-2</td>
			<td style="width:143px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:167px;">554425</td>
			<td>cloneJES6-5H4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Recombinant IL-12 p70</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:167px;">14-8121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Recombinant IL-4</td>
			<td style="width:143px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:167px;">550067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Recombinant TGF-beta</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td>14-8342-62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Recombinant IL-6</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:167px;">14-8061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Recombinant IL-2</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:167px;">14-8021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">PMA&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">P8139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Ionomycin</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">I0634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Brefeldin A</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:167px;">00-4506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">16005</td>
			<td>Paraformaldehyde is toxic so use appropriate caution when handling&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Foxp3 staining buffer set</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:167px;">00-5523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-CD4&#160; FITC</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:167px;">11-0041</td>
			<td>clone GK1.5&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-CD8a perCP-cy5.5</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td>45-0081-80</td>
			<td>clone 53-6.7&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-MHCII PE</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:167px;">12-0920</td>
			<td>&#160;clone HIS19</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-CD25 PE</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td>12-0251-82</td>
			<td>&#160;clone PC61.5&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-CD62L PE</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td>12-0621-82</td>
			<td>clone MEL-14&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-CD44 APC</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:167px;">17-0441</td>
			<td>clone IM7&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-IFN-gamma FITC&#160;</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td>11-7311-81</td>
			<td>clone XMG1.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-IL-4 PE</td>
			<td style="width:143px;">BD Biosciences</td>
			<td>554435</td>
			<td>clone 11B11</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:287px;">Anti-IL-9 PE or APC</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences/Biolegend</td>
			<td>50-8091-82/514104</td>
			<td>clone RM9A4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-IL-17a PE</td>
			<td style="width:143px;">BD Biosciences</td>
			<td>559502</td>
			<td>clone TC11-18H10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-Foxp3&#160; APC or PE</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td>17-5773-82/12-5773-80&#160;</td>
			<td>clone FJK-16s</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Na2HPO4-2H2O</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">71643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dextrose/Glucose</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES, free acid</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">NH4Cl</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">A9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disodium EDTA</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">D2900000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">KHCO3</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">237205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">&#160;CaCl2&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retroviral transduction of helper t cells as a genetic approach to study mechanisms controlling their differentiation and function

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents autoimmunity. Many approaches involving different model organisms have been utilized to understand the mechanisms controlling helper T cell development and function. However, studies using mouse models have proven to be highly informative due to the availability of genetic, cellular, and biochemical systems. One genetic approach in mice used by many labs involves retroviral transduction of primary helper T cells. This is a powerful approach due to its relative ease, making it accessible to almost any laboratory with basic skills in molecular biology and immunology. Therefore, multiple genes in wild type or mutant forms can readily be tested for function in helper T cells to understand their importance and mechanisms of action. We have optimized this approach and describe here the protocols for production of high titer retroviruses, isolation of primary murine helper T cells, and their transduction by retroviruses and differentiation toward the different helper subsets. Finally, the use of this approach is described in uncovering mechanisms utilized by microRNAs (miRNAs) to regulate pathways controlling helper T cell development and function.

Le succès de ce système expérimental nécessite des populations très pures de cellules T et préparations de retrovirus à titre élevé. Les résultats représentatifs sont présentés ici à titre d&#39; exemples d&#39;expériences réussies. La figure 1 montre la pureté typique des populations pré- et post-sélectionnés à chaque étape du protocole d&#39;isolement des cellules T auxiliaires naïves. La figure 2 et 3 illustrent l&#39;analyse de la production de retrovirus par l&#39; expression de la GFP dans les cellules HEK 293T transfectées (figure 2) et les cellules T transduites (figure 3). L&#39; efficacité de la transfection des cellules HEK 293T peuvent varier considérablement avec les différentes constructions rétrovirales, mais souvent ne correspond pas avec le niveau de production de retrovirus observée avec le nombre de cellules GFP + T. En outre, le nombre de cellules GFP + T peut varier en fonction des conditions de polarisation. En outre, le mean niveau d&#39;expression de la GFP et le gène inséré peut varier en fonction du nombre de copies de virus intégré, l&#39;effet du site d&#39;intégration sur la transcription, et des mécanismes de régulation post-transcriptionnel qui affectent la transcription virale. Enfin, la figure 4 montre des résultats typiques que nous avons observés avec la différenciation des cellules T auxiliaires lorsque les miRNAs miR-15b / 16 sont surexprimés. Ces résultats montrent une partie de la variabilité qui peut se produire au sein d&#39;une expérience individuelle des effets tellement vrais doivent être étayées par une analyse statistique de plusieurs expériences répétées en utilisant différentes préparations de cellules T auxiliaires. Dans ces expériences, les réponses Th2 peuvent être difficiles à observer dans la / 6 ligne C57BL utilisé ici parce qu&#39;ils sont sujets à des réponses Th1. De même, l&#39;IL-9 coloration peut être difficile à détecter dessus du fond. Par conséquent, il est impératif d&#39;effectuer des contrôles d&#39;isotype et mettre en place une compensation adéquate pour garantir un bon gating de l&#39;expression des cytokines. Dans nos résultats , nous avons découvert que miR-15b / 16 améliore iTreg l&#39; induction par inhibition de la voie de signalisation par suppression de l&#39;expression des composants et Rictor mTOR 15 mTOR. miR-15b / 16 peut parfois influencer Th0, Th1, et la différenciation Th17 dans des expériences individuelles, mais il n&#39;y a pas d&#39;effet significatif lorsqu&#39;il a examiné dans plusieurs expériences répétées. En revanche miR-15b / 16 surexpression ne supprime de manière significative la différenciation Th9 (voir référence 18). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54698/54698fig1.jpg" /> Figure 1. pureté typique de cellules T auxiliaires à chaque étape de l&#39; isolement. D&#39;écoulement représentant cytométrie résultats des antigènes indiqués sont présentés à partir de la porte de cellules vivantes désignées dans le Scatter Forward (FSC) et Side Scatter (SSC) parcelles. Sélection négative (A) avant et après-CD4. Les profils d&#39;expression de CD4,CD8a et MHCII sont présentés. Ces exemples illustrent l&#39;enrichissement des cellules T auxiliaires et de la perte de lymphocytes T cytotoxiques et du CMH de classe II des cellules exprimant. Une bonne purification devrait aboutir à ~ 90% de cellules T CD4 + à ce stade. (B) sélection de CD25. Sur la gauche sont les profils d&#39;expression de CD4, CD8a et MHCII, et à droite sont les CD4 et l&#39;expression de CD25 profils pré et post-sélection. À ce stade , &gt; 95% des cellules CD25 sélectionnées négativement devrait être CD4 + CD25 -. (C) CD62L sélection. les profils d&#39;expression de CD4, CD8A et CMHII sont indiqués sur la gauche. Sur la droite, les profils d&#39;expression pour CD62L et CD44 sont présentés pour les cellules sélectionnées pré et post-CD62L ainsi que CD4 et CD62L profil d&#39;expression des cellules de poste sélectionné. Après la sélection CD62L pratiquement toutes les cellules de mémoire (CD44 +) sont éliminés en laissant une population fortement enrichie de cellules T auxiliaires naïves , qui contient 10-15% des cellules effectrices (CD62L faible). Pour tousprofils FACS, paramètres équivalents et des échelles pour un paramètre spécifique ont été maintenues tout au long. Les nombres représentent le pourcentage de cellules dans une population fermée. La légère diminution de la taille des cellules après la sélection initiale est probablement due à une contrainte mécanique pendant le protocole. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54698fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/54698/54698fig2.jpg" /> Figure 2. Analyse des cellules HEK 293T transfectées avec un retrovirus. L&#39; expression de GFP dans les cellules est représenté HEK 293T qui étaient soit non transfectées ou transfectées et analysé après la collecte de surnageant de culture virale. l&#39;analyse de la GFP a été effectuée sur des cellules vivantes de la porte sur le FSC et l&#39;intrigue SSC dans le premier panneau. Les nombres représentent le pourcentage de cellules GFP + dans la région fermée. Typique tl&#39; efficacité de ransfection varient entre 30-90%. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54698fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/54698/54698fig3.jpg" /> Expression de la GFP Figure 3. L&#39; analyse des cellules T auxiliaires de type retrovirus transduites. Est représenté dans les cellules T auxiliaires rétroviraux transduites après différenciation dans Th0, Th1, Th2, Th9, Th17 et Treg conditions de polarisation pendant trois jours. L&#39;analyse a été fermée sur des cellules vivantes et activées indiquées dans le panneau FSC / SSC. Les efficacités de transduction peuvent varier entre 10 à 75% en fonction de la construction et des conditions de polarisation. De même, l&#39;intensité de fluorescence moyenne d&#39;expression de la GFP peut varier. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54698fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> Figure 4. Effet de miR-15b / 16 surexpression sur la différenciation des cellules T helper dans différentes conditions de polarisation. Les profils de cytokine représentatifs sont présentés sur la GFP + population de cellules à partir de la figure 3. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54698fig4large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Tableau 1" src="/files/ftp_upload/54698/54698table1.jpg" /> Tableau 1:. Les tampons utilisés dans ces protocoles <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54986table1.xlsx" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce tableau comme une feuille</a> de <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54986table1.xlsx" target="_blank">calcul Excel.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td colspan="3"> Auxiliaireconditions de polarisation des lymphocytes T </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Th0 </td><td> anti-IL-4 </td><td> 5 ug / ml </td></tr><tr><td></td><td> anti-IFN-γ </td><td> 5 ug / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Th1 </td><td> recombinant-IL-12 </td><td> 20 ng / ml </td></tr><tr><td></td><td> anti-IL-4 </td><td> 5 ug / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Th2 </td><td> IL-4 recombinante </td><td> 40 ng / ml </td></tr><tr><td></td><td> anti-IFN-γ </td><td> 5 ug / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Th9 </td><td> Le TGF-β recombiné </td><td> 2,5 ng / ml </td></tr><tr><td></td><td> IL-4 recombinante </td><td> 40 ng / ml </td></tr><tr><td></td><td> anti-IFN-γ </td><td> 10 pg / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Th17 </td><td> Le TGF-β recombiné </td><td> 2,5 ng / ml </td></tr><tr><td></td><td> IL-6 recombinante </td><td> 50 ng / ml </td></tr><tr><td></td><td> anti-IFN-γ </td><td> 5 ug / ml </td></tr><tr><td></td><td> anti-IL-4 </td><td> 5 ug / ml </td></tr><tr><td></td><td> anti-IL-2 </td><td> 5 ug / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tregs </td><td> Le TGF-β recombiné </td><td> 2,5 ng / ml </td></tr><tr><td></td><td> IL-2 recombinante </td><td> 5 ng / ml </td></tr></tbody></table> Tableau 2: sous - ensemble de cellules conditions de polarisation T auxiliaires.

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Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

De nombreux systèmes expérimentaux ont été utilisés pour comprendre les mécanismes qui régulent la croissance et la fonction des lymphocytes T dans une réponse immunitaire. Ici, une approche génétique en utilisant la transduction rétrovirale est décrite, qui est économique, efficace du temps, et surtout, très instructif pour identifier les voies de régulation.

Rétrovirale transduction des cellules T auxiliaires comme une approche génétique pour étudier les mécanismes contrôlant leur différenciation et la fonction

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

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