Name: retroviral transduction of helper t cells as a genetic approach to study mechanisms controlling their differentiation and function
Uploaded: 2016-11-04T15:00:00
Duration: 11 min 50 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function at JoVE.com

This work was supported by a Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) grant (BB/H018573/1) and a BD Biosciences grant.

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The authors have no conflicting interest in the publication of this work.

Retrovirale vermittelte Überexpression von Genen ist eine leistungsfähige Methode, Funktion in T-Helferzellen zu analysieren, wie ihre Entwicklung und Funktion oft durch die Expression von Schlüsselregulatoren bestimmt wird. Allerdings ist vorsichtige Interpretation der Ergebnisse erforderlich, da die Expressionsniveaus deutlich über denen des endogenen Gens viele Artefakte einführen können. Daher sollte diese Technik mit anderen kombiniert werden, um die Relevanz der Funktion zu überprüfen. Zum Beispiel Überexpression sollte durch eine reduzierte Expression unter Verwendung von siRNAs oder Gen-Knockout falls vorhanden, ergänzt werden. Mit miRNAs, ergänzt wir die Überexpression Experimente mit denen der Blockierung von Viren verwendet , die künstliche miRNA Targeting Websites überexprimiert , die als kompetitive Inhibitoren für eine miRNA 15 gehandelt hat. Retrovirale transduzierten Zellen können auch in biochemischen Assays denen RNA und Protein-Analyse verwendet werden. Jedoch ist eine große Einschränkung dieser Experimente Effizienz der Transduktion resulting in einer gemischten Population von transduzierten und untransduzierten Zellen. Daher werden diese Assays wahrscheinlich erfordern der GFP + -Population Sortieren. Schließlich wird in vitro Differenzierungsassays sollten mit in vivo Experimenten kombiniert werden, und ein Weg , dies erreicht werden kann , ist durch die adoptiv transduzierten T - Zellen in Mäuse übertragen und nach ihrer Differenzierung und ihre Wirkung auf die Immunantwort. Eine der wichtigsten Beschränkungen dieses Systems ist die Größe des RNA-Genoms, die in das retrovirale Kapsid verpackt werden kann. Nach unserer Erfahrung ist die maximale Einsatzgröße für MIG retroviralen System, das gute Virusproduktion gibt, ist 3-3,5 kb. Daher können größere Gene mit diesem System nicht analysiert werden, da sie schlechte Virustiter geben. Jedoch sind die meisten Gene kleiner als diese Größe so dass dieses System für eine große Vielzahl von Gen-Studien nützlich ist. Mit retrovirale Transduktion, mehrere Alternativen, die in dieser Protocols verwendet. Viele Forscher haben Verpackungszelllinien verwendet, die die retroviralen Gene stabil exprimieren (zum Beispiel 16 Referenz). Allerdings haben wir die höchsten Titer unter Verwendung von Standard-HEK 293T-Zellen mit Co-Transfektion des PCL- Eco Helfervirus-Vektor erhalten. Isolation von naiven T-Helferzellen können auch durch die Zelle erreicht werden Sortier anstelle der magnetischen Kügelchen und Zellseparationssäule Protokoll, aber dies erfordert Zugang zu einem Zellsortierer, und die Kosten für die Sortierzeit sind in der Regel höher als die Wulst Reagenzien. Schließlich gibt es Variationen Aktivierungsbedingungen verwendet, um Helfer-T-Zellen in den verschiedenen Untergruppen zu unterscheiden. Zum Beispiel TCR Stimulation der Zellen zu lange vor der Einwirkung von Treg induzierenden Bedingungen können ihre Induktion 16 hemmen. Dies kann ein Problem sein, weil retroviralen Expressions erfordert durch Stimulation von Zellen induzierten Zellteilung. Trotzdem haben wir eine effiziente Treg Induktion dieses Protokoll mit O / N activ gefundenation vor der retrovirale Transduktion. Innerhalb dieser Protokolle, erfordert eine erfolgreiche Anwendung mehrere Faktoren zurückzuführen. Hohe Titer-Retrovirus Präparate benötigen effiziente Transfektion der HEK 293T-Zellen so qualitativ hochwertige DNA und präzise vorbereitet 2x HBS sind wichtig. Darüber hinaus muss die Zelldichte der HEK 293T-Zellen etwa 50% am Punkt der Transfektion zu sein, weil eine gute Expression der transfizierten DNA erfordert, dass die Zellen aktiv wachsen, und dies verhindert werden, wenn die Zellen zu spärlich oder dicht sind. Zellen, die bei der optimalen Dichte während der Transfektion sollten Einmündung an einem gewissen Punkt während der Virussammlung Schritte erreichen, aber sie werden auch weiterhin mit hohem Titer Virusstämme den ganzen Weg bis zum letzten Kollektion produziert. Effiziente Differenzierung der T - Helferzellen erfordert eine gute Zellqualität gewährleisten , so dass isolierte Zellen auf die Reinheit sind in 1 dargestellt ist . In ähnlicher Weise ist die Qualität der Zellen hängt von der Mäuse from, die sie isoliert wurden. Für diese Studien haben wir 6-8 Wochen alte C57BL / 6-Mäusen verwendet. Ältere Mäuse haben weniger naive Zellen und andere Stämme in ihrer Differenzierung unterscheiden. Beispielsweise BALB / c - Mäuse sind anfälliger für Th2 - Antworten als C57BL / 6 - Mäusen 17 so wie oben erwähnt, C57BL / 6 - T - Zellen kann schwierig sein , eine Th2 - Antwort zu induzieren. Zusätzlich kann jeder der Differenzierungsbedingungen können leicht von Labor zu Labor variieren und die Wirkung von Gen-Überexpression kann in nur suboptimale Bedingungen offensichtlich werden so Cytokin-Konzentrationen in den verschiedenen Polarisationszustände müssen titriert werden. Schließlich Wirkungen des überexprimierten Gens oder die Polarisationsbedingungen auf die Zellproliferation können die Transduktionseffizienz beeinflussen so Meßeffekte des Gens von Interesse erfordern kann das Timing und die Konzentration der polarisierenden Reagenzien zu optimieren. Die Optimierung all dieser Faktoren sollten mit diesem System zu informativen Ergebnissen führen.

The immune response must be highly regulated to eliminate infections but prevent attacks on self-tissue that lead to autoimmunity. Helper T cells play an essential role in regulating the immune response, and a great deal of effort has been undertaken to understand their development and function (illustrated in several recent reviews 1-3). However, many questions remain, and many approaches have been utilized to study the mechanisms controlling helper T cell development and function. These have ranged from the use of in vitro cell culture systems to whole animals. Cell culture systems, especially those using cell lines, offer the benefit of ease of use and the ability to generate large amount of material to do sophisticated biochemical analyses. However, they suffer from their limited ability to reproduce the actual conditions occurring in an immune response. In contrast, whole animal experiments offer the benefit of relevance, but they can suffer from difficulties in manipulation and the ability to perform precise controls in addition to their large costs and ethical implications. Nevertheless, the vast majority of helper T cells studies today still require the use of whole animal experiments involving primary T cells because of the inability of cell lines to duplicate the exact steps occurring in the whole animal. Therefore, it is essential to utilize cost effective approaches that are highly informative. 
Genetics is one powerful tool to study helper T cell development and function, yet traditional methods involving gene knockouts or transgenes are time consuming and expensive so they are often out of reach of small labs. However, retroviral transduction offers a powerful, rapid and, cost effective genetic approach to study the mechanisms of specific gene products. Therefore, it is commonly used in papers studying helper T cell development and function. 
We have optimized a procedure for retroviral transduction of helper T cells. It utilizes the pMIG (Murine stem cell virus-Internal ribosomal entry site-Green fluorescent protein) retroviral expression vector, in which the gene of interest can be cloned and thereby expressed from the retrovirus long terminal repeat (LTR) 4. In addition, downstream of the inserted gene of interest is an internal ribosome entry sequence (IRES) followed by the green fluorescent protein (GFP) gene so transduced cells can easily be followed by their expression of GFP. The vector was originally derived from the Murine Stem Cell Virus (MSCV) vectors, which contain mutations in repressor binding sites in the LTRs making them resistant to silencing and thus, giving high expression in many cell types including helper T cells 5,6. Production of high titer retrovirus requires a simple transient transfection protocol of human embryonic kidney (HEK) 293T cells with the MIG vector and a helper virus vector that expresses the retroviral GAG, Pol, and Env genes. For this the pCL-Eco helper virus vector 7 works well in producing high titer replication incompetent retroviruses. 
Here these protocols for retroviral production and transduction of primary murine T cells are described in addition to some of our results using this approach to study miRNA regulation of gene expression controlling helper T cell differentiation. miRNAs are small RNAs of approximately 22 nucleotides in length that post-transcriptionally regulate gene expression by targeting homologous sequences in protein encoding messenger RNAs and suppressing translation and inducing message instability 8,9. miRNAs play critical roles in developmental gene regulation. They are essential in the earliest stages of development, as embryos that cannot produce miRNAs die at a very early stage 10. In addition miRNAs are important later on in the development of many tissues. They are thought to function by fine-tuning the expression of genes required for developmental programs 1. In helper T cells miRNAs play multiple roles and are required for regulatory T cell (Treg) development 11-14. We used retroviral transduction as a means to dissect the mechanisms of miRNA regulation of Treg differentiation 15. Through such studies important individual miRNAs were determined by retroviral-mediated overexpression. Subsequently, relevant genes regulated by these miRNAs were identified in order to understand the molecular pathways regulated by miRNAs in helper T cell differentiation.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="763">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">RPMI</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">R8758</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">DMEM</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">D5671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Penicillin Streptomycin solution</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">DPBS</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">MIG vector</td>
			<td style="width:143px;">Addgene</td>
			<td style="width:167px;">Plasmid 9094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">pCL-Eco vector</td>
			<td style="width:143px;">Addgene</td>
			<td style="width:167px;">Plasmid 12371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Cell strainer</td>
			<td style="width:143px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:167px;">352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Magnetic beads mouse CD4 cell kit&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Invitrogen (Dynabeads)</td>
			<td style="width:167px;">11415D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Streptavidin Beads&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Miltenyi Biotech</td>
			<td style="width:167px;">130-048-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">MS cell separation columns</td>
			<td style="width:143px;">Miltenyi Biotech</td>
			<td style="width:167px;">130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">LS cell separation columns</td>
			<td style="width:143px;">Miltenyi Biotech</td>
			<td style="width:167px;">130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">CD25 Biotenylated MAb&#160;</td>
			<td style="width:143px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:167px;">85059</td>
			<td>clone 7D4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">CD62L Biotenylated MAb&#160;</td>
			<td style="width:143px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:167px;">553149</td>
			<td>clone MEL-14</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Polybrene (Hexadimethrine Bromide)</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">107689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-CD3</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td>16-0031-85</td>
			<td>clone 145-2C11&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-CD28</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td>16-0281-85</td>
			<td>clone 37.51&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-IL-4</td>
			<td style="width:143px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:167px;">559062</td>
			<td>clone 11B11</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-IFN-gamma</td>
			<td style="width:143px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:167px;">559065</td>
			<td>clone XMG1.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-IL-2</td>
			<td style="width:143px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:167px;">554425</td>
			<td>cloneJES6-5H4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Recombinant IL-12 p70</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:167px;">14-8121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Recombinant IL-4</td>
			<td style="width:143px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:167px;">550067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Recombinant TGF-beta</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td>14-8342-62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Recombinant IL-6</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:167px;">14-8061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Recombinant IL-2</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:167px;">14-8021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">PMA&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">P8139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Ionomycin</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">I0634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Brefeldin A</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:167px;">00-4506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">16005</td>
			<td>Paraformaldehyde is toxic so use appropriate caution when handling&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Foxp3 staining buffer set</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:167px;">00-5523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-CD4&#160; FITC</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:167px;">11-0041</td>
			<td>clone GK1.5&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-CD8a perCP-cy5.5</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td>45-0081-80</td>
			<td>clone 53-6.7&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-MHCII PE</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:167px;">12-0920</td>
			<td>&#160;clone HIS19</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-CD25 PE</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td>12-0251-82</td>
			<td>&#160;clone PC61.5&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-CD62L PE</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td>12-0621-82</td>
			<td>clone MEL-14&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-CD44 APC</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:167px;">17-0441</td>
			<td>clone IM7&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-IFN-gamma FITC&#160;</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td>11-7311-81</td>
			<td>clone XMG1.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-IL-4 PE</td>
			<td style="width:143px;">BD Biosciences</td>
			<td>554435</td>
			<td>clone 11B11</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:287px;">Anti-IL-9 PE or APC</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences/Biolegend</td>
			<td>50-8091-82/514104</td>
			<td>clone RM9A4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-IL-17a PE</td>
			<td style="width:143px;">BD Biosciences</td>
			<td>559502</td>
			<td>clone TC11-18H10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-Foxp3&#160; APC or PE</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td>17-5773-82/12-5773-80&#160;</td>
			<td>clone FJK-16s</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Na2HPO4-2H2O</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">71643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dextrose/Glucose</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES, free acid</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">NH4Cl</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">A9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disodium EDTA</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">D2900000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">KHCO3</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">237205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">&#160;CaCl2&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retroviral transduction of helper t cells as a genetic approach to study mechanisms controlling their differentiation and function

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents autoimmunity. Many approaches involving different model organisms have been utilized to understand the mechanisms controlling helper T cell development and function. However, studies using mouse models have proven to be highly informative due to the availability of genetic, cellular, and biochemical systems. One genetic approach in mice used by many labs involves retroviral transduction of primary helper T cells. This is a powerful approach due to its relative ease, making it accessible to almost any laboratory with basic skills in molecular biology and immunology. Therefore, multiple genes in wild type or mutant forms can readily be tested for function in helper T cells to understand their importance and mechanisms of action. We have optimized this approach and describe here the protocols for production of high titer retroviruses, isolation of primary murine helper T cells, and their transduction by retroviruses and differentiation toward the different helper subsets. Finally, the use of this approach is described in uncovering mechanisms utilized by microRNAs (miRNAs) to regulate pathways controlling helper T cell development and function.

Der Erfolg dieses experimentelle System erfordert sehr reine Populationen von T-Zellen und hoher Titer-Retrovirus-Präparate. Repräsentative Ergebnisse sind als Beispiele für erfolgreiche Experimente hier gezeigt. Abbildung 1 zeigt die typische Reinheit von prä- und post ausgewählten Populationen in jeder Phase der naiven T - Helferzellisolierungsprotokoll, Fig . 2 und 3 veranschaulichen die Analyse von Retrovirus - Produktion durch die GFP - Expression in den transfizierten HEK 293T - Zellen (Abbildung 2) und transduzierten T - Zellen (Abbildung 3). Transfektionseffizienzen der HEK 293T - Zellen können erheblich variieren mit verschiedenen retroviralen Konstrukten, aber dies häufig korreliert nicht mit der Ebene der Produktion Retrovirus mit der Anzahl der GFP + T - Zellen beobachtet. Auch kann die Anzahl der GFP + T - Zellen hängt von der Polarisationsbedingungen variieren. Weiterhin ist die mean Expression von GFP und das insertierte Gen kann in Abhängigkeit von der Anzahl der Kopien Virus integriert, die Wirkung der Integrationsstelle auf die Transkription und post-transkriptionalen Regulationsmechanismen variieren, um die viralen Transkripts zu beeinflussen. Schließlich Abbildung 4 zeigt einige typische Ergebnisse , die wir mit Helfer - T - Zell - Differenzierung beobachtet , wenn die miRNAs miR-15b / 16 überexprimiert werden. Diese Ergebnisse zeigen einige der Variabilität, die innerhalb eines einzelnen Experiments so wahr Effekte begründet werden muss durch eine statistische Analyse von mehreren Wiederholungsversuchen mit verschiedenen Präparaten von T-Helferzellen auftreten kann. In diesen Experimenten können Th2-Antworten schwierig sein, in der C57BL / 6-Linie hier verwendet, um zu beobachten, weil sie zu Th1-Reaktionen neigen. Ebenso kann IL-9-Färbung schwierig sein, über dem Hintergrund zu erfassen. Daher ist es zwingend notwendig, Isotypkontrollen zu tun und einen angemessenen Ausgleich einzurichten, um eine korrekte ga gewährleistenting der Zytokin-Expression. In unseren Ergebnissen haben wir , dass miR-15b / 16 verbessert iTreg Induktions 15 durch Hemmung des mTOR - Signalweg durch Unterdrückung der Expression der Komponenten Rictor und mTOR gefunden. miR-15b / 16 kann manchmal beeinflussen Th0, Th1 und Th17 Differenzierung in einzelnen Experimenten, aber es gibt keine signifikante Wirkung, wenn in mehreren Wiederholungsversuchen untersucht. Im Gegensatz miR-15b / 16 Überexpression nicht unterdrückt deutlich Th9 Differenzierung (siehe Referenz 18). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54698/54698fig1.jpg" /> Abbildung 1. Typische Reinheit von Helfer - T - Zellen in jeder Phase der Isolation. Repräsentative Durchflusszytometrie Ergebnisse der angegebenen Antigene werden von dem Gate von lebenden Zellen in der Vorwärtsstreuung (FSC) und Side Scatter (SSC) Plots bezeichnet gezeigt. (A) vor und nach der CD4 - negative Selektion. Expressionsprofile von CD4,CD8a und MHCII gezeigt. Diese veranschaulichen die Anreicherung von Helfer-T-Zellen und den Verlust der zytotoxischen T-Zellen und MHC-Klasse II exprimierende Zellen. Eine gute Reinigung sollte in ~ 90% CD4 + T - Zellen in diesem Stadium führen. (B) CD25 Auswahl. Auf der linken Seite sind die Expressionsprofile von CD4, CD8a und MHCII, und auf der rechten Seite sind die CD4 und CD25-Expressionsprofile vor und nach der Auswahl. An dieser Stelle&gt; 95% der CD25 negativ selektierten Zellen sollten CD4 + CD25 sein -. (C) CD62L Auswahl. CD4, CD8a und MHCII Expressionsprofile sind auf der linken Seite gezeigt. Auf der rechten Seite werden die Expressionsprofile für CD62L und CD44 für Pre- und Post-CD62L ausgewählten Zellen zusammen mit CD4 und CD62L Expressionsprofil von Post ausgewählten Zellen gezeigt. Nach CD62L Auswahl praktisch alle Speicherzellen (CD44 +) entfernt , um eine hoch angereicherte Population von naiven T - Helferzellen zu verlassen , die 10-15% Effektor - Zellen (CD62L low) enthält. Für alleFACS-Profile, Einstellungen und äquivalente Skalen für einen bestimmten Parameter wurden während gehalten. Die Zahlen stellen den Prozentsatz an Zellen in einer Gated Bevölkerung. Der leichte Rückgang der Größe der Zellen nach der ersten Wahl ist vermutlich durch mechanische Beanspruchung während des Protokolls. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54698fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54698fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54698/54698fig2.jpg" /> Abbildung 2. Analyse von Retrovirus-transfizierten HEK 293T - Zellen. Die GFP - Expression in HEK 293T - Zellen gezeigt , die entweder untransfizierten waren oder transfiziert und nach der Entnahme von viralen Kulturüberständen analysiert. GFP-Analyse wurde an lebenden Zellen aus dem Tor auf der FSC und SSC Plot in der ersten Platte erfolgen. Die Zahlen stellen den Prozentsatz der GFP + Zellen innerhalb der Gated Region. Typische transfection Effizienzen liegen zwischen 30-90%. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54698fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54698fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54698/54698fig3.jpg" /> Abbildung 3. Analyse von Retrovirus transduzierten T - Helferzellen. GFP - Expression wird für drei Tage in retroviral transduzierten Helfer - T - Zellen nach Differenzierung in Th0, Th1, Th2, Th9, Th17 und Treg Polarisationsbedingungen gezeigt. Die Analyse wurde gated auf Live- und aktivierten Zellen in der FSC / SSC-Panel angezeigt. Transduktionseffizienzen kann zwischen 10-75% in Abhängigkeit von dem Konstrukt und den Polarisationsbedingungen variieren. Ebenso kann die mittlere Fluoreszenzintensität der GFP - Expression variieren. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54698fig3large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54698fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Abbildung 4. Wirkung von miR-15b / 16 Überexpression auf T - Zell - Differenzierung Helfer in verschiedenen Polarisationszustände. Repräsentative Zytokinprofile sind auf der GFP + Population von Zellen aus Abbildung 3 dargestellt. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54698fig4large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54698fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Tabelle 1" src="/files/ftp_upload/54698/54698table1.jpg" /> Tabelle 1:. Puffer in diesen Protokollen verwendet <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54986table1.xlsx" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54986table1.xlsx" target="_blank">diese Tabelle als Excel</a> - <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54986table1.xlsx" target="_blank">Tabelle zum Download</a> bereit <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54986table1.xlsx" target="_blank">.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td colspan="3"> HelferT-Zell-Polarisationszustände </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Th0 </td><td> anti-IL-4 </td><td> 5 &amp; ​​mgr; g / ml </td></tr><tr><td></td><td> Anti-IFN-γ </td><td> 5 &amp; ​​mgr; g / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Th1 </td><td> rekombinante IL-12 </td><td> 20 ng / ml </td></tr><tr><td></td><td> anti-IL-4 </td><td> 5 &amp; ​​mgr; g / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Th2 </td><td> rekombinantes IL-4 </td><td> 40 ng / ml </td></tr><tr><td></td><td> Anti-IFN-γ </td><td> 5 &amp; ​​mgr; g / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Th9 </td><td> rekombinantes TGF-β </td><td> 2,5 ng / ml </td></tr><tr><td></td><td> rekombinantes IL-4 </td><td> 40 ng / ml </td></tr><tr><td></td><td> Anti-IFN-γ </td><td> 10 &amp; mgr; g / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Th17 </td><td> rekombinantes TGF-β </td><td> 2,5 ng / ml </td></tr><tr><td></td><td> rekombinantes IL-6 </td><td> 50 ng / ml </td></tr><tr><td></td><td> Anti-IFN-γ </td><td> 5 &amp; ​​mgr; g / ml </td></tr><tr><td></td><td> anti-IL-4 </td><td> 5 &amp; ​​mgr; g / ml </td></tr><tr><td></td><td> anti-IL-2 </td><td> 5 &amp; ​​mgr; g / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tregs </td><td> rekombinantes TGF-β </td><td> 2,5 ng / ml </td></tr><tr><td></td><td> rekombinantes IL-2 </td><td> 5 ng / ml </td></tr></tbody></table> Tabelle 2: Helper T - Zell - Untergruppe Polarisationszustände.

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Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

Viele experimentelle Systeme wurden die Mechanismen regulieren T-Zell-Entwicklung und Funktion in einer Immunantwort zu verstehen, verwendet. Hier ist ein genetischer Ansatz retrovirale Transduktion unter Verwendung beschrieben, die wirtschaftlich ist, Zeit effizient, und vor allem sehr informativ bei der Identifizierung von Regulationswege.

Retrovirale Transduktion von T-Helferzellen als genetischer Ansatz zur Untersuchung Mechanismen der Kontrolle ihrer Differenzierung und Funktion

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

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