Name: retroviral transduction of helper t cells as a genetic approach to study mechanisms controlling their differentiation and function
Uploaded: 2016-11-04T15:00:00
Duration: 11 min 50 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function at JoVE.com

This work was supported by a Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) grant (BB/H018573/1) and a BD Biosciences grant.

<ol>
	<li>Baumjohann, D., Ansel, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-mediated+regulation+of+T+helper+cell+differentiation+and+plasticity.">MicroRNA-mediated regulation of T helper cell differentiation and plasticity.</a> Nat Rev Immunol. 13 (9), 666-678 (2013).</li><li>Wilson, C. B., Rowell, E., Sekimata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+control+of+T-helper-cell+differentiation.">Epigenetic control of T-helper-cell differentiation.</a> Nat Rev Immunol. 9 (2), 91-105 (2009).</li><li>Pearce, E. L., Poffenberger, M. C., Chang, C. H., Jones, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fueling+immunity:+insights+into+metabolism+and+lymphocyte+function.">Fueling immunity: insights into metabolism and lymphocyte function.</a> Science. 342 (6155), 1242454 (2013).</li><li>Cherry, S. R., Biniszkiewicz, D., Van Parijs, L., Baltimore, D., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+Expression+in+Embryonic+Stem+Cells+and+Hematopoietic+Stem+Cells.">Retroviral Expression in Embryonic Stem Cells and Hematopoietic Stem Cells.</a> Mol and Cell Biol. 20 (20), 7419-7426 (2000).</li><li>Miller, A. D., Rosman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+retroviral+vectors+for+gene+transfer+and+expression.">Improved retroviral vectors for gene transfer and expression.</a> BioTechniques. 7 (9), 980-990 (1989).</li><li>Grez, M., Akg&#252;n, E., Hilberg, F., Ostertag, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+virus,+a+recombinant+murine+retrovirus+with+expression+in+embryonic+stem+cells.">Embryonic stem cell virus, a recombinant murine retrovirus with expression in embryonic stem cells.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 87 (23), 9202-9206 (1990).</li><li>Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pCL+vector+system:+rapid+production+of+helper-free,+high-titer,+recombinant+retroviruses.">The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses.</a> J Virol. 70 (8), 5701-5705 (1996).</li><li>Filipowicz, W., Bhattacharyya, S. N., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+post-transcriptional+regulation+by+microRNAs:+are+the+answers+in+sight?.">Mechanisms of post-transcriptional regulation by microRNAs: are the answers in sight?.</a> Nat Rev Genetics. 9 (2), 102-114 (2008).</li><li>He, L., Hannon, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+small+RNAs+with+a+big+role+in+gene+regulation.">MicroRNAs: small RNAs with a big role in gene regulation.</a> Nat Rev Genetics. 5 (7), 522-531 (2004).</li><li>Bernstein, E., Kim, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dicer+is+essential+for+mouse+development.">Dicer is essential for mouse development.</a> Nat Genetics. 35 (3), 215-217 (2003).</li><li>Cobb, B. S., Hertweck, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+Dicer+in+immune+regulation.">A role for Dicer in immune regulation.</a> J Exp Med. 203 (11), 2519-2527 (2006).</li><li>Chong, M. M. W., Rasmussen, J. P., Rudensky, A. Y., Rundensky, A. Y., Littman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNAseIII+enzyme+Drosha+is+critical+in+T+cells+for+preventing+lethal+inflammatory+disease.">The RNAseIII enzyme Drosha is critical in T cells for preventing lethal inflammatory disease.</a> J Exp Med. 205 (9), 2005-2017 (2008).</li><li>Liston, A., Lu, L. F., O'Carroll, D., Tarakhovsky, A., Rudensky, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dicer-dependent+microRNA+pathway+safeguards+regulatory+T+cell+function.">Dicer-dependent microRNA pathway safeguards regulatory T cell function.</a> J Exp Med. 205 (9), 1993-2004 (2008).</li><li>Zhou, X., Jeker, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+miRNA+disruption+in+T+reg+cells+leads+to+uncontrolled+autoimmunity.">Selective miRNA disruption in T reg cells leads to uncontrolled autoimmunity.</a> J Exp Med. 205 (9), 1983-1991 (2008).</li><li>Singh, Y., Garden, O. A., Lang, F., Cobb, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-15b/16+Enhances+the+Induction+of+Regulatory+T+Cells+by+Regulating+the+Expression+of+Rictor+and+mTOR.">MicroRNA-15b/16 Enhances the Induction of Regulatory T Cells by Regulating the Expression of Rictor and mTOR.</a> J Immunol. 195 (12), 5667-5677 (2015).</li><li>Sauer, S., Bruno, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+receptor+signaling+controls+Foxp3+expression+via+PI3K,+Akt,+and+mTOR.">T cell receptor signaling controls Foxp3 expression via PI3K, Akt, and mTOR.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 105 (22), 7797-7802 (2008).</li><li>Yagi, J., Arimura, Y., Takatori, H., Nakajima, H., Iwamoto, I., Uchiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+background+influences+Th+cell+differentiation+by+controlling+the+capacity+for+IL-2-induced+IL-4+production+by+naive+CD4++T+cells.">Genetic background influences Th cell differentiation by controlling the capacity for IL-2-induced IL-4 production by naive CD4+ T cells.</a> Int Immunol. 18 (12), 1681-1690 (2006).</li><li>Singh, Y., Garden, O. A., Lang, F., Cobb, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+regulate+T-cell+production+of+interleukin-9+and+identify+hypoxia-inducible+factor-2a+as+an+important+regulator+of+T+helper+9+and+regulatory+T-cell+differentiation.">MicroRNAs regulate T-cell production of interleukin-9 and identify hypoxia-inducible factor-2a as an important regulator of T helper 9 and regulatory T-cell differentiation.</a> Immunology. 149, 74-86 (2016).</li></ol>

The authors have no conflicting interest in the publication of this work.

ביטוי יתר של גנים בתיווך retroviral היא דרך רבת עוצמה כדי לנתח פונקציה בתאי T מסייעים, כמו התפתחות ותפקוד שלהם נקבעת בדרך כלל על ידי רמת הביטוי של רגולטורים מרכזיים. עם זאת, פרשנות זהירה של התוצאות נדרשת כי רמות ביטוי משמעותי מעל אלה של גן אנדוגני יכולות להציג ממצאים רבים. לכן, טכניקה זו צריכה להיות משולבת עם אחרים כדי לאמת את הרלוונטיות של פונקציה. לדוגמא, ביטוי יתר צריך להיות כהשלמת ביטוי מופחת באמצעות siRNAs או נוקאאוט גנטי אם זמין. עם miRNAs, בהחלט השלמנו ניסויי ביטוי יתר עם אלה של חסימה באמצעות וירוסים כי ביטוי יתר מירנה מלאכותית מיקוד אתרים שפעלו מעכבים תחרותיים כתעריף מירנה 15. תאי retroviral transduced יכולים להיות מנוצלים גם מבחני ביוכימיים המעורבים RNA וניתוח חלבון. עם זאת, מגבלה עיקרית של ניסויים אלה היא יעילות של מיל התמרulting באוכלוסייה מעורבת של תאים transduced ו untransduced. לכן, מבחנים אלה יהיו רוב דורשים סבירים מיון של GFP + אוכלוסייה. לבסוף, מבחני בידול במבחנה צריכים להיות משולבים עם ניסויי in vivo, ואחת דרכים זו יכולה להיות מושגת על ידי הוא adoptively העברה תאי T transduced לעכברים ובעקבות הבידול שלהם והשפיעו על התגובה החיסונית. אחת המגבלות המפתח מערכת זו הוא בגודל של הגנום רנ&quot;א שיכולים להיות ארוז לתוך קפסיד retroviral. מניסיוננו, בגודל הכנס המרבי עבור מערכת retroviral MIG שנותן ייצור וירוס טוב הוא 3-3.5 קילו. לכן, גנים גדולים לא ניתן לנתח עם מערכת זו, כפי שהם נותנים titers וירוס העני. עם זאת, רוב הגנים הם קטנים יותר מאשר גודל זה כל כך מערכת זו שימושית עבור מגוון רחב של מחקרי גן. עם התמרה retroviral, מספר חלופות בתוך protoco אלהls שמש. חוקרים רבים נצלו שורות תאי אריזה המבטאות את גני retroviral ביציבות (למשל אסמכתא 16). עם זאת, השגנו את טיטר הגבוהה ביותר באמצעות תאים 293T HEK רגיל עם שיתוף transfection של וקטור PCL-אקו עוזר וירוס. בידוד של תאי T מסייע נאיבי יכול גם להיות מושג באמצעות מיון תא ולא פרדת חרוז תא מגנט פרוטוקול הטור, אבל זה דורש גישת סדרן תא, ואת עלויות זמן מסוג הם בדרך כלל גבוהות יותר מאשר ריאגנטים החרוז. לבסוף, יש וריאציות על תנאי הפעלה בשימוש להבדיל תאי T מסייע לתוך תת השונה. לדוגמה, גירוי TCR של תאים במשך זמן רב מדי לפני חשיפה לתנאי התרמה Treg יכול לעכב גיוסם 16. זו יכולה להיות בעיה, כי הביטוי retroviral דורש חלוקת התא הנגרמת על ידי גירוי של תאים. אף על פי כן, מצאנו אינדוקציה יעילה Treg באמצעות פרוטוקול זה עם O / Activ Nation לפני התמרה retroviral. בתוך הפרוטוקולים הללו, יישום מוצלח דורש מספר גורמים. הכנות רטרו-וירוס כייל גבוה צריכים transfection היעיל של תאי 293T HEK כך DNA באיכות גבוהה HBS 2x המוכנה בדיוק חשובות. בנוסף, את צפיפות התאים של תאי HEK 293T צריך להיות בערך 50% בשלב של transfection כי ביטוי טוב של ה- DNA transfected דורש כי התא ומתרחב, וזה יהיה עכבות אם התאים הם גם דלילים או צפופים. תאים בצפיפות האופטימלית במהלך transfection צריכים להגיע למפגש בשלב כלשהו במהלך השלבים האוספים וירוס, אבל הם ימשיכו לייצר מניות וירוס כייל גבוה לאורך כל הדרך אל האוסף האחרון. בידול יעיל של תאי T מסייע דורש איכות תא טובה כדי להבטיח כי תאים בודדים הם לטוהר באיור 1. כמו כן, את איכות התאים תלויה fr העכבריםאום אשר הם בודדו. עבור מחקרים אלה, השתמשנו C57BL בן 6-8 בשבוע / 6 עכברים. עכברים מבוגרים יכולים להיות פחות תאים תמימים, זנים אחרים, יכולים להיות שונים הבידול שלהם. לדוגמה, עכברים BALB / ג נוטים יותר לתגובות Th2 מ C57BL / 6 עכברים 17 כך כאמור לעיל, C57BL / 6 T תאים יכול להיות קשה כדי לעורר תגובה Th2. בנוסף, אחד מתנאי הבידול עשויים להשתנות מעט ממעבדה למעבדה, ואת ההשפעה של ביטוי יתר גן עשויה רק ​​להתברר בתנאים תת-אופטימלית כך ריכוזים ציטוקינים בתנאי הקיטוב השונים ייתכן שיהיו צורך טיטרציה. לבסוף, תופעות של גן ביטוי היתר או תנאי הקיטוב על התפשטות תאים יכולות להשפיע על היעילות התמר כך תופעות מדידה של הגן של עניין עשויות לדרוש אופטימיזציה של התזמון וריכוז ריאגנטים מקטב. אופטימיזציה כל הגורמים הללו צריכות להוביל לתוצאות אינפורמטיבי עם מערכת זו.

The immune response must be highly regulated to eliminate infections but prevent attacks on self-tissue that lead to autoimmunity. Helper T cells play an essential role in regulating the immune response, and a great deal of effort has been undertaken to understand their development and function (illustrated in several recent reviews 1-3). However, many questions remain, and many approaches have been utilized to study the mechanisms controlling helper T cell development and function. These have ranged from the use of in vitro cell culture systems to whole animals. Cell culture systems, especially those using cell lines, offer the benefit of ease of use and the ability to generate large amount of material to do sophisticated biochemical analyses. However, they suffer from their limited ability to reproduce the actual conditions occurring in an immune response. In contrast, whole animal experiments offer the benefit of relevance, but they can suffer from difficulties in manipulation and the ability to perform precise controls in addition to their large costs and ethical implications. Nevertheless, the vast majority of helper T cells studies today still require the use of whole animal experiments involving primary T cells because of the inability of cell lines to duplicate the exact steps occurring in the whole animal. Therefore, it is essential to utilize cost effective approaches that are highly informative. 
Genetics is one powerful tool to study helper T cell development and function, yet traditional methods involving gene knockouts or transgenes are time consuming and expensive so they are often out of reach of small labs. However, retroviral transduction offers a powerful, rapid and, cost effective genetic approach to study the mechanisms of specific gene products. Therefore, it is commonly used in papers studying helper T cell development and function. 
We have optimized a procedure for retroviral transduction of helper T cells. It utilizes the pMIG (Murine stem cell virus-Internal ribosomal entry site-Green fluorescent protein) retroviral expression vector, in which the gene of interest can be cloned and thereby expressed from the retrovirus long terminal repeat (LTR) 4. In addition, downstream of the inserted gene of interest is an internal ribosome entry sequence (IRES) followed by the green fluorescent protein (GFP) gene so transduced cells can easily be followed by their expression of GFP. The vector was originally derived from the Murine Stem Cell Virus (MSCV) vectors, which contain mutations in repressor binding sites in the LTRs making them resistant to silencing and thus, giving high expression in many cell types including helper T cells 5,6. Production of high titer retrovirus requires a simple transient transfection protocol of human embryonic kidney (HEK) 293T cells with the MIG vector and a helper virus vector that expresses the retroviral GAG, Pol, and Env genes. For this the pCL-Eco helper virus vector 7 works well in producing high titer replication incompetent retroviruses. 
Here these protocols for retroviral production and transduction of primary murine T cells are described in addition to some of our results using this approach to study miRNA regulation of gene expression controlling helper T cell differentiation. miRNAs are small RNAs of approximately 22 nucleotides in length that post-transcriptionally regulate gene expression by targeting homologous sequences in protein encoding messenger RNAs and suppressing translation and inducing message instability 8,9. miRNAs play critical roles in developmental gene regulation. They are essential in the earliest stages of development, as embryos that cannot produce miRNAs die at a very early stage 10. In addition miRNAs are important later on in the development of many tissues. They are thought to function by fine-tuning the expression of genes required for developmental programs 1. In helper T cells miRNAs play multiple roles and are required for regulatory T cell (Treg) development 11-14. We used retroviral transduction as a means to dissect the mechanisms of miRNA regulation of Treg differentiation 15. Through such studies important individual miRNAs were determined by retroviral-mediated overexpression. Subsequently, relevant genes regulated by these miRNAs were identified in order to understand the molecular pathways regulated by miRNAs in helper T cell differentiation.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="763">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">RPMI</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">R8758</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">DMEM</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">D5671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Penicillin Streptomycin solution</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">DPBS</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">MIG vector</td>
			<td style="width:143px;">Addgene</td>
			<td style="width:167px;">Plasmid 9094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">pCL-Eco vector</td>
			<td style="width:143px;">Addgene</td>
			<td style="width:167px;">Plasmid 12371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Cell strainer</td>
			<td style="width:143px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:167px;">352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Magnetic beads mouse CD4 cell kit&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Invitrogen (Dynabeads)</td>
			<td style="width:167px;">11415D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Streptavidin Beads&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Miltenyi Biotech</td>
			<td style="width:167px;">130-048-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">MS cell separation columns</td>
			<td style="width:143px;">Miltenyi Biotech</td>
			<td style="width:167px;">130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">LS cell separation columns</td>
			<td style="width:143px;">Miltenyi Biotech</td>
			<td style="width:167px;">130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">CD25 Biotenylated MAb&#160;</td>
			<td style="width:143px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:167px;">85059</td>
			<td>clone 7D4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">CD62L Biotenylated MAb&#160;</td>
			<td style="width:143px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:167px;">553149</td>
			<td>clone MEL-14</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Polybrene (Hexadimethrine Bromide)</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">107689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-CD3</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td>16-0031-85</td>
			<td>clone 145-2C11&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-CD28</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td>16-0281-85</td>
			<td>clone 37.51&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-IL-4</td>
			<td style="width:143px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:167px;">559062</td>
			<td>clone 11B11</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-IFN-gamma</td>
			<td style="width:143px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:167px;">559065</td>
			<td>clone XMG1.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-IL-2</td>
			<td style="width:143px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:167px;">554425</td>
			<td>cloneJES6-5H4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Recombinant IL-12 p70</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:167px;">14-8121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Recombinant IL-4</td>
			<td style="width:143px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:167px;">550067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Recombinant TGF-beta</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td>14-8342-62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Recombinant IL-6</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:167px;">14-8061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Recombinant IL-2</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:167px;">14-8021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">PMA&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">P8139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Ionomycin</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">I0634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Brefeldin A</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:167px;">00-4506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">16005</td>
			<td>Paraformaldehyde is toxic so use appropriate caution when handling&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Foxp3 staining buffer set</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:167px;">00-5523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-CD4&#160; FITC</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:167px;">11-0041</td>
			<td>clone GK1.5&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-CD8a perCP-cy5.5</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td>45-0081-80</td>
			<td>clone 53-6.7&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-MHCII PE</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:167px;">12-0920</td>
			<td>&#160;clone HIS19</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-CD25 PE</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td>12-0251-82</td>
			<td>&#160;clone PC61.5&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-CD62L PE</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td>12-0621-82</td>
			<td>clone MEL-14&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-CD44 APC</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:167px;">17-0441</td>
			<td>clone IM7&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-IFN-gamma FITC&#160;</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td>11-7311-81</td>
			<td>clone XMG1.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-IL-4 PE</td>
			<td style="width:143px;">BD Biosciences</td>
			<td>554435</td>
			<td>clone 11B11</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:287px;">Anti-IL-9 PE or APC</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences/Biolegend</td>
			<td>50-8091-82/514104</td>
			<td>clone RM9A4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-IL-17a PE</td>
			<td style="width:143px;">BD Biosciences</td>
			<td>559502</td>
			<td>clone TC11-18H10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-Foxp3&#160; APC or PE</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td>17-5773-82/12-5773-80&#160;</td>
			<td>clone FJK-16s</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Na2HPO4-2H2O</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">71643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dextrose/Glucose</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES, free acid</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">NH4Cl</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">A9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disodium EDTA</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">D2900000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">KHCO3</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">237205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">&#160;CaCl2&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retroviral transduction of helper t cells as a genetic approach to study mechanisms controlling their differentiation and function

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents autoimmunity. Many approaches involving different model organisms have been utilized to understand the mechanisms controlling helper T cell development and function. However, studies using mouse models have proven to be highly informative due to the availability of genetic, cellular, and biochemical systems. One genetic approach in mice used by many labs involves retroviral transduction of primary helper T cells. This is a powerful approach due to its relative ease, making it accessible to almost any laboratory with basic skills in molecular biology and immunology. Therefore, multiple genes in wild type or mutant forms can readily be tested for function in helper T cells to understand their importance and mechanisms of action. We have optimized this approach and describe here the protocols for production of high titer retroviruses, isolation of primary murine helper T cells, and their transduction by retroviruses and differentiation toward the different helper subsets. Finally, the use of this approach is described in uncovering mechanisms utilized by microRNAs (miRNAs) to regulate pathways controlling helper T cell development and function.

ההצלחה של מערכת ניסיונית זו דורשת אוכלוסיות טהורות מאוד של תאי T והכנות רטרו-וירוס כייל גבוה. תוצאות נציג מוצגים כאן כדוגמאות ניסויים מוצלחים. איור 1 מציג את טוהר טיפוסי של אוכלוסיות טרום שנבחרו פוסט בכל שלב של פרוטוקול בידוד T מסייעים התא נאיבי. איור 2 ו -3 להמחיש את ניתוח הייצור רטרו-וירוס דרך ביטוי של GFP בתאי HEK 293T טרנספקציה (איור 2) ותאי T transduced (איור 3). יעילות transfection של תאי 293T HEK יכולה להשתנות באופן משמעותי עם בונת retroviral שונה, אבל זה בדרך כלל לא תואם את רמת ייצור רטרו-וירוס ציין עם מספר תאי GFP + T. כמו כן, את מספר התאים GFP + T יכול להשתנות בהתאם לתנאי הקיטוב. יתר על כן, מ &#39;רמת ביטוי EAN של GFP ואת הגן המוכנס יכול להשתנות בהתאם למספר עותקי וירוס המשולב, ההשפעה של אתר האינטגרציה על שעתוק, ועל מנגנוני ויסות שלאחר תעתיק המשפיעים על תמליל ויראלי. לבסוף, איור 4 מראה כמה תוצאות טיפוסיות שראינו עם התמיינות תאי T מסייע כאשר miRNAs miR-15b / 16 הם ביטוי יתר. תוצאות אלו מראות כמה השתנות שיכולים להתרחש בתוך ניסוי פרט כך השפעות אמיתיות חייבות להיות תימוכי ניתוח סטטיסטי של ניסויים חוזרים מרובים באמצעות תכשירים שונים של תאי T מסייע. בניסויים אלו התגובות Th2 יכול להיות קשה להבחין בקו C57BL / 6 משמש כאן משום שהם נוטים לתגובות Th1. כמו כן, IL-9 מכתים יכול להיות קשה לזהות מעל הרקע. לכן, קיים הכרח לעשות שולטת אלוטיפ ולהקים פיצוי הולם על מנת להבטיח ga הנכוןטינג ביטוי ציטוקינים. בתוצאות שלנו מצאנו כי miR-15b / 16 משפר אינדוקציה iTreg ידי עיכוב mTOR במסלול איתות באמצעות דיכוי הביטוי של Rictor רכיבים mTOR 15. miR-15b / 16 לפעמים יכול להשפיע Th0, Th1, והבחנת TH17 בניסויים בודדים, אך אין השפעה משמעותית כאשר בוחנים ניסויים חוזרים מרובים. בניגוד miR-15b / 16 ביטוי יתר עושה באופן משמעותי לדכא בידול Th9 (ראה התייחסות 18). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54698/54698fig1.jpg" /> איור 1. טוהר אופייני של תאי T מסייע בכל שלב של בידוד. תזרים נציג cytometry תוצאות של אנטיגנים הצביעו מוצג מהשער של תאי חיים שיועדו לכך הפיזור קדימה (FSC) ואת צד פיזור (SSC) מגרשים. (א) לפני ואחרי CD4 סלקציה שלילית. פרופילי ביטוי של CD4,CD8a, ו MHCII מוצגים. אלו ממחישות את העשרת תאי T מסייעים אובדן תאי T ציטוטוקסיים ו MHC class II תאים המבטאים. היטהרות טובה צריכה לגרום תאים ~ 90% CD4 + T בשלב זה. (ב) בחירת CD25. מהשמאל הם פרופילי הביטוי של CD4, CD8a, ו MHCII, והמימין הוא CD4 וביטוי CD25 פרופילי בחירה לפני ואחרי. בשלב זה&gt; 95% של תאי CD25 שליליים שנבחרו צריך להיות CD4 + CD25 -. הבחירה (C) CD62L. פרופילי הביטוי CD4, CD8a, ו MHCII מוצגים בצד שמאל. מימין פרופילי ביטוי CD62L ו CD44 מוצגים עבור תאים טרום ופוסט CD62L שנבחרו יחד עם פרופיל ביטוי CD4 ו CD62L של תאים שנבחרו פוסט. לאחר בחירת CD62L כמעט כל תאי זיכרון (CD44 +) יוסרו השארת אוכלוסייה מועשרת בתאי T מסייע נאיביים המכילים 10-15 תאי מפעיל% (CD62L נמוך). לכולםפרופילי FACS, גדרות מקבילות וקשקשת עבור פרמטר ספציפי נשמרו לאורך כל דרך. המספרים מייצגים את אחוז התאים בתוך אוכלוסיה מגודרת. ירידת הקלת גודל התאים לאחר המיון הראשוני היא ככל הנראה בשל לחץ מכאני במהלך הפרוטוקול. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54698fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54698/54698fig2.jpg" /> איור 2. ניתוח של תאים HEK 293T-טרנספקציה רטרו-וירוס. הביטוי GFP מוצג תאים HEK 293T שהיו או untransfected או transfected ונותחו לאחר איסוף supernatants תרבות ויראלי. ניתוח GFP נעשה על תאים חיים מהשער על המגרש FSC ו SSC בלוח הראשון. מספרים מייצגים את אחוז GFP + התאים בתוך האזור המגודר. t האופיינית<html> יעילות ransfection נעה בין 30-90%. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54698fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54698/54698fig3.jpg" /> איור 3. ניתוח של תאי T מסייעים transduced רטרו-וירוס. הביטוי GFP מוצג בתאי T מסייעים retroviral-transduced לאחר בידול Th0, Th1, Th2, Th9, TH17, ו Treg תנאי הקיטוב במשך שלושה ימים. ניתוח היה מגודר על תאי חיים והופעלו מצוינים בלוח FSC / SSC. יעילות התמרה יכול להשתנות בין 10-75% תלוי מבנה ותנאי הקיטוב. כמו כן, עוצמת הניאון מתכוונת ביטוי GFP יכול להשתנות. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54698fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> ילדה = &quot;jove_content&quot; FO: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/54698/54698fig4.jpg" /> איור 4. השפעת miR-15b / 16 ביטוי יתר על התמיינות תאי T מסייע בתנאי קיטוב שונים. פרופילים ציטוקינים נציג מוצגים על GFP + אוכלוסיית תאי האיור 3. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54698fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="שולחן 1" src="/files/ftp_upload/54698/54698table1.jpg" /> טבלה 1:. חוצצי המשמשים הפרוטוקולים הללו <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54986table1.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הטבלה כמו גיליון אלקטרוני של Excel.</a> <table fo:keep-together.within-page="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="3"> עוֹזֵרתנאי קיטוב תא T </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Th0 </td><td> אנטי-IL-4 </td><td> 5 מיקרוגרם / מ&quot;ל </td></tr><tr><td></td><td> אנטי IFN-γ </td><td> 5 מיקרוגרם / מ&quot;ל </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Th1 </td><td> רקומביננטי-IL-12 </td><td> 20 ng / ml </td></tr><tr><td></td><td> אנטי-IL-4 </td><td> 5 מיקרוגרם / מ&quot;ל </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Th2 </td><td> IL-4 רקומביננטי </td><td> 40 ng / ml </td></tr><tr><td></td><td> אנטי IFN-γ </td><td> 5 מיקרוגרם / מ&quot;ל </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Th9 </td><td> TGF-β רקומביננטי </td><td> 2.5 ng / ml </td></tr><tr><td></td><td> IL-4 רקומביננטי </td><td> 40 ng / ml </td></tr><tr><td></td><td> אנטי IFN-γ </td><td> 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> TH17 </td><td> TGF-β רקומביננטי </td><td> 2.5 ng / ml </td></tr><tr><td></td><td> IL-6 רקומביננטי </td><td> 50 ng / ml </td></tr><tr><td></td><td> אנטי IFN-γ </td><td> 5 מיקרוגרם / מ&quot;ל </td></tr><tr><td></td><td> אנטי-IL-4 </td><td> 5 מיקרוגרם / מ&quot;ל </td></tr><tr><td></td><td> אנטי-IL-2 </td><td> 5 מיקרוגרם / מ&quot;ל </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tregs </td><td> TGF-β רקומביננטי </td><td> 2.5 ng / ml </td></tr><tr><td></td><td> IL-2 רקומביננטי </td><td> 5 ng / ml </td></tr></tbody></table> טבלה 2: תנאי קיטוב משנה תא T מסייע.

Watch this Scientific Journal Video about Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function at JoVE.com

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

מערכות ניסיוניות רבות כבר נוצלו כדי להבין את המנגנונים המסדירים פיתוח תאי T ולתפקד תגובה חיסונית. הנה גישה גנטית באמצעות תמרת retroviral מתוארת, אשר היא כלכלי, זמן יעיל, והכי חשוב, מאוד אינפורמטיבי בזיהוי מסלולים רגולטוריים.

Retroviral תמרה של Helper T תאים כגישה גנטית לחקר מנגנוני בקרת הבידול והתפקוד שלהם

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

התמרה retroviral של T-cell קולטנים עכבר מתאי T

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

היכרות עם מתח שאר בחקר הדבקה חיידקית

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

התמיינות מכוונת של המושרה בתאי גזע pluripotent כלפי לימפוציטים-T

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+  cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of  malignancies 1. CTLs can  ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

<em&gt; במבחנה</em&gt; מודל ללמוד ההטרוגניות של בידול Macrophage אדם וקיטוב

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation

התמרה adenoviral של CD4 תמימים תאי T ללמוד בידול Treg

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

השתלה של עור זנב לחקר תגובות תא Allogeneic T מסוג CD4 בעכברים

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Radial Mobility and Cytotoxic Function of Retroviral Replicating Vector Transduced, Non-adherent Alloresponsive T Lymphocytes

מחוגי ניידות ותפקוד ציטוטוקסיות של retroviral מעתיקה וקטור transduced, שאינם חסיד Alloresponsive T לימפוציטים

We report a novel adaptation of the Radial Monolayer Cell Migration assay, first reported to measure the radial migration of adherent tumor cells on ...

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

Retroviral התמרה של ובתאים מח עצם כדי ליצור תאי T קולטן Retrogenic עכברים

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

Development of an Antigen-driven Colitis Model to Study Presentation of Antigens by Antigen Presenting Cells to T Cells

פיתוח מודל קוליטיס מונחה Antigen ללמוד מצגת של אנטיגנים על ידי אנטיגן הצגת תאים לתאי T

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological ...

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

יצירה<em&gt; דה נובו</em&gt; לקולטנים המצויים בתאי אנטיגן ספציפי האדם T על ידי retroviral התמרה של Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...