Name: retroviral transduction of helper t cells as a genetic approach to study mechanisms controlling their differentiation and function
Uploaded: 2016-11-04T15:00:00
Duration: 11 min 50 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function at JoVE.com

This work was supported by a Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) grant (BB/H018573/1) and a BD Biosciences grant.

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	<li>Baumjohann, D., Ansel, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-mediated+regulation+of+T+helper+cell+differentiation+and+plasticity.">MicroRNA-mediated regulation of T helper cell differentiation and plasticity.</a> Nat Rev Immunol. 13 (9), 666-678 (2013).</li><li>Wilson, C. B., Rowell, E., Sekimata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+control+of+T-helper-cell+differentiation.">Epigenetic control of T-helper-cell differentiation.</a> Nat Rev Immunol. 9 (2), 91-105 (2009).</li><li>Pearce, E. L., Poffenberger, M. C., Chang, C. H., Jones, R. 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T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+miRNA+disruption+in+T+reg+cells+leads+to+uncontrolled+autoimmunity.">Selective miRNA disruption in T reg cells leads to uncontrolled autoimmunity.</a> J Exp Med. 205 (9), 1983-1991 (2008).</li><li>Singh, Y., Garden, O. A., Lang, F., Cobb, B. 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A., Lang, F., Cobb, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+regulate+T-cell+production+of+interleukin-9+and+identify+hypoxia-inducible+factor-2a+as+an+important+regulator+of+T+helper+9+and+regulatory+T-cell+differentiation.">MicroRNAs regulate T-cell production of interleukin-9 and identify hypoxia-inducible factor-2a as an important regulator of T helper 9 and regulatory T-cell differentiation.</a> Immunology. 149, 74-86 (2016).</li></ol>

The authors have no conflicting interest in the publication of this work.

その開発と機能は、多くの場合、重要な調節因子の発現レベルによって決定される遺伝子のレトロウイルス媒介過剰発現は、ヘルパーT細胞における機能を解析するための強力な方法です。大幅に内因性遺伝子のもの上記の発現レベルは、多くのアーチファクトを生じることがあるので、しかし、結果の慎重な解釈が必要です。従って、この技術は、機能の妥当性を確認するために他のものと組み合わされるべきです。例えば、過剰発現が可能な場合のsiRNAまたは遺伝子ノックアウトを使用して発現低下によって補完されるべきです。 miRNAにより、我々は、miRNA 15のための競合的阻害剤として作用した部位を標的人工のmiRNAを過剰発現したウイルスを使用することにより、ブロッキングのものと過剰発現実験を補完します。レトロウイルス形質導入された細胞はまた、RNAおよびタンパク質の分析を伴う生化学アッセイにおいて利用することができます。しかし、これらの実験の主な制限は、形質導入解像度の効率であります形質導入および非形質導入細胞の混合集団でulting。したがって、これらのアッセイは、最も可能性の高いGFP +集団のソートが必要になります。最後に、 インビトロ分化アッセイは、 インビボ実験と結合されるべきであり、これを達成することができる一つの方法は、養子マウスに形質導入したT細胞を転送し、それらの分化し、免疫応答に対する効果以下のことです。 このシステムの主要な制限の一つは、レトロウイルスキャプシドにパッケージングすることができるRNAゲノムの大きさです。我々の経験では、良好なウイルス産生を与えるMIGレトロウイルスシステムの最大挿入サイズは3〜3.5キロバイトです。それらが悪いウイルス力価を与えるしたがって、より大きな遺伝子は、このシステムを用いて分析することができません。このシステムは、遺伝子研究の広範囲に有用であるのでしかし、ほとんどの遺伝子は、このサイズよりも小さいです。 これらprotoco内のレトロウイルス形質導入すると、いくつかの選択肢LSが使用されています。多くの研究者は、安定したレトロウイルス遺伝子（例16を参照）を発現するパッケージング細胞株を利用しています。しかし、我々は、PCL-エコヘルパーウイルスベクターの同時トランスフェクションを用いて標準HEK 293T細胞を使用して最高の力価を得ました。ナイーブヘルパーT細胞の単離は、磁気ビーズと細胞分離カラムのプロトコルではなく、細胞選別によって達成することができ、これは、細胞ソーターへのアクセスを必要とし、ソート時間のコストは、典型的には、ビーズ試薬よりも高いです。最後に、異なるサブセットにヘルパーT細胞を区別するために使用される活性化条件のバリエーションが存在します。例えば、長すぎるために細胞のTCR刺激は、Tregの誘導条件への曝露の前に誘導16を阻害することができます。レトロウイルス発現細胞の刺激により誘導される細胞分裂を必要とするので、これは問題となり得ます。それにもかかわらず、我々はO / N ACTIVで、このプロトコルを使用して効率的なTregの誘導を発見しましたレトロウイルス形質導入に先立ってエーション。 これらのプロトコルの中で、成功したアプリケーションは、いくつかの要因が必要です。高力価のレトロウイルス調製物は、非常に高い品質のDNAと正確に準備された2×HBS HEK 293T細胞の効率的なトランスフェクションを必要とする重要です。トランスフェクトされたDNAの良好な発現は、細胞があまりに疎または密である場合、細胞が活発に増殖している、これが阻害されることを必要とするので、また、HEK 293T細胞の細胞密度はトランスフェクションの時点で約50％であることが必要です。トランスフェクション時の最適な密度の細胞を、ウイルス回収ステップの間にいくつかの点で合流に達する必要がありますが、彼らはすべての方法最後の収集まで、高力価のウイルスストックを生産継続します。ヘルパーT細胞の効率的な分化は、良好なセルの品質がので、単離された細胞は、 図1に示した純度であることを確認が必要である。同様に、細胞の品質は、マウスFRに依存しますそれらは単離されたOM。これらの研究のために、我々は6〜8週齢のC57BL / 6マウスを使用しています。古いマウスは少ないナイーブ細胞を持つことができ、他の株は、それらの分化に異なる場合があります。上述したように、例えば、BALB / cマウスは、C57BL / 6マウス17よりTh2応答をより受けやすいように、C57BL / 6 T細胞はTh2応答を誘導することは困難です。また、分化条件のいずれかが研究室に研究室から若干異なる場合があり、そして様々な偏光条件でのサイトカイン濃度を滴定する必要があるかもしれないので、遺伝子の過剰発現の効果は、サブ最適な条件で明らかになるであろう。最終的に、細胞増殖の過剰発現遺伝子の作用や偏光状態は、目的の遺伝子のように測定することの効果は、偏光試薬のタイミングおよび濃度を最適化する必要ができる形質導入効率に影響を与えることができます。すべてのこれらの要因を最適化すると、このシステムでの有益な結果をもたらすはずです。

The immune response must be highly regulated to eliminate infections but prevent attacks on self-tissue that lead to autoimmunity. Helper T cells play an essential role in regulating the immune response, and a great deal of effort has been undertaken to understand their development and function (illustrated in several recent reviews 1-3). However, many questions remain, and many approaches have been utilized to study the mechanisms controlling helper T cell development and function. These have ranged from the use of in vitro cell culture systems to whole animals. Cell culture systems, especially those using cell lines, offer the benefit of ease of use and the ability to generate large amount of material to do sophisticated biochemical analyses. However, they suffer from their limited ability to reproduce the actual conditions occurring in an immune response. In contrast, whole animal experiments offer the benefit of relevance, but they can suffer from difficulties in manipulation and the ability to perform precise controls in addition to their large costs and ethical implications. Nevertheless, the vast majority of helper T cells studies today still require the use of whole animal experiments involving primary T cells because of the inability of cell lines to duplicate the exact steps occurring in the whole animal. Therefore, it is essential to utilize cost effective approaches that are highly informative. 
Genetics is one powerful tool to study helper T cell development and function, yet traditional methods involving gene knockouts or transgenes are time consuming and expensive so they are often out of reach of small labs. However, retroviral transduction offers a powerful, rapid and, cost effective genetic approach to study the mechanisms of specific gene products. Therefore, it is commonly used in papers studying helper T cell development and function. 
We have optimized a procedure for retroviral transduction of helper T cells. It utilizes the pMIG (Murine stem cell virus-Internal ribosomal entry site-Green fluorescent protein) retroviral expression vector, in which the gene of interest can be cloned and thereby expressed from the retrovirus long terminal repeat (LTR) 4. In addition, downstream of the inserted gene of interest is an internal ribosome entry sequence (IRES) followed by the green fluorescent protein (GFP) gene so transduced cells can easily be followed by their expression of GFP. The vector was originally derived from the Murine Stem Cell Virus (MSCV) vectors, which contain mutations in repressor binding sites in the LTRs making them resistant to silencing and thus, giving high expression in many cell types including helper T cells 5,6. Production of high titer retrovirus requires a simple transient transfection protocol of human embryonic kidney (HEK) 293T cells with the MIG vector and a helper virus vector that expresses the retroviral GAG, Pol, and Env genes. For this the pCL-Eco helper virus vector 7 works well in producing high titer replication incompetent retroviruses. 
Here these protocols for retroviral production and transduction of primary murine T cells are described in addition to some of our results using this approach to study miRNA regulation of gene expression controlling helper T cell differentiation. miRNAs are small RNAs of approximately 22 nucleotides in length that post-transcriptionally regulate gene expression by targeting homologous sequences in protein encoding messenger RNAs and suppressing translation and inducing message instability 8,9. miRNAs play critical roles in developmental gene regulation. They are essential in the earliest stages of development, as embryos that cannot produce miRNAs die at a very early stage 10. In addition miRNAs are important later on in the development of many tissues. They are thought to function by fine-tuning the expression of genes required for developmental programs 1. In helper T cells miRNAs play multiple roles and are required for regulatory T cell (Treg) development 11-14. We used retroviral transduction as a means to dissect the mechanisms of miRNA regulation of Treg differentiation 15. Through such studies important individual miRNAs were determined by retroviral-mediated overexpression. Subsequently, relevant genes regulated by these miRNAs were identified in order to understand the molecular pathways regulated by miRNAs in helper T cell differentiation.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="763">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">RPMI</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">R8758</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">DMEM</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">D5671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Penicillin Streptomycin solution</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">DPBS</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">MIG vector</td>
			<td style="width:143px;">Addgene</td>
			<td style="width:167px;">Plasmid 9094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">pCL-Eco vector</td>
			<td style="width:143px;">Addgene</td>
			<td style="width:167px;">Plasmid 12371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Cell strainer</td>
			<td style="width:143px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:167px;">352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Magnetic beads mouse CD4 cell kit&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Invitrogen (Dynabeads)</td>
			<td style="width:167px;">11415D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Streptavidin Beads&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Miltenyi Biotech</td>
			<td style="width:167px;">130-048-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">MS cell separation columns</td>
			<td style="width:143px;">Miltenyi Biotech</td>
			<td style="width:167px;">130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">LS cell separation columns</td>
			<td style="width:143px;">Miltenyi Biotech</td>
			<td style="width:167px;">130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">CD25 Biotenylated MAb&#160;</td>
			<td style="width:143px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:167px;">85059</td>
			<td>clone 7D4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">CD62L Biotenylated MAb&#160;</td>
			<td style="width:143px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:167px;">553149</td>
			<td>clone MEL-14</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Polybrene (Hexadimethrine Bromide)</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">107689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-CD3</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td>16-0031-85</td>
			<td>clone 145-2C11&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-CD28</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td>16-0281-85</td>
			<td>clone 37.51&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-IL-4</td>
			<td style="width:143px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:167px;">559062</td>
			<td>clone 11B11</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-IFN-gamma</td>
			<td style="width:143px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:167px;">559065</td>
			<td>clone XMG1.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-IL-2</td>
			<td style="width:143px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:167px;">554425</td>
			<td>cloneJES6-5H4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Recombinant IL-12 p70</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:167px;">14-8121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Recombinant IL-4</td>
			<td style="width:143px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:167px;">550067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Recombinant TGF-beta</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td>14-8342-62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Recombinant IL-6</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:167px;">14-8061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Recombinant IL-2</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:167px;">14-8021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">PMA&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">P8139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Ionomycin</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">I0634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Brefeldin A</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:167px;">00-4506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">16005</td>
			<td>Paraformaldehyde is toxic so use appropriate caution when handling&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Foxp3 staining buffer set</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:167px;">00-5523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-CD4&#160; FITC</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:167px;">11-0041</td>
			<td>clone GK1.5&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-CD8a perCP-cy5.5</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td>45-0081-80</td>
			<td>clone 53-6.7&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-MHCII PE</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:167px;">12-0920</td>
			<td>&#160;clone HIS19</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-CD25 PE</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td>12-0251-82</td>
			<td>&#160;clone PC61.5&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-CD62L PE</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td>12-0621-82</td>
			<td>clone MEL-14&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-CD44 APC</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:167px;">17-0441</td>
			<td>clone IM7&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-IFN-gamma FITC&#160;</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td>11-7311-81</td>
			<td>clone XMG1.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-IL-4 PE</td>
			<td style="width:143px;">BD Biosciences</td>
			<td>554435</td>
			<td>clone 11B11</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:287px;">Anti-IL-9 PE or APC</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences/Biolegend</td>
			<td>50-8091-82/514104</td>
			<td>clone RM9A4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-IL-17a PE</td>
			<td style="width:143px;">BD Biosciences</td>
			<td>559502</td>
			<td>clone TC11-18H10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-Foxp3&#160; APC or PE</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td>17-5773-82/12-5773-80&#160;</td>
			<td>clone FJK-16s</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Na2HPO4-2H2O</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">71643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dextrose/Glucose</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES, free acid</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">NH4Cl</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">A9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disodium EDTA</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">D2900000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">KHCO3</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">237205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">&#160;CaCl2&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retroviral transduction of helper t cells as a genetic approach to study mechanisms controlling their differentiation and function

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents autoimmunity. Many approaches involving different model organisms have been utilized to understand the mechanisms controlling helper T cell development and function. However, studies using mouse models have proven to be highly informative due to the availability of genetic, cellular, and biochemical systems. One genetic approach in mice used by many labs involves retroviral transduction of primary helper T cells. This is a powerful approach due to its relative ease, making it accessible to almost any laboratory with basic skills in molecular biology and immunology. Therefore, multiple genes in wild type or mutant forms can readily be tested for function in helper T cells to understand their importance and mechanisms of action. We have optimized this approach and describe here the protocols for production of high titer retroviruses, isolation of primary murine helper T cells, and their transduction by retroviruses and differentiation toward the different helper subsets. Finally, the use of this approach is described in uncovering mechanisms utilized by microRNAs (miRNAs) to regulate pathways controlling helper T cell development and function.

この実験系の成功は、T細胞および高力価のレトロウイルス調製物の純度の高い集団を必要とします。代表的な結果は、成功した実験の例として示されている。 図1ナイーブヘルパーT細胞単離プロトコールの各段階で前後選択集団の典型的な純度を示す。 図2及び図3は、GFPの発現を介して、レトロウイルス産生の分析を示しますトランスフェクトされたHEK 293T細胞において（ 図2）および形質導入T細胞（ 図3）。 HEK 293T細胞のトランスフェクション効率は、異なるレトロウイルス構築物で有意に変化し得るが、これは多くの場合、GFP + T細胞の数で観察レトロウイルス産生のレベルと相関しません。また、GFP + T細胞の数は、偏光状態に依存して変化し得ます。また、メートルGFPのEAN発現レベルと集積ウイルスコピーの数に応じて変化することができ、挿入された遺伝子、転写の組込み部位の効果、およびウイルスの転写に影響する転写後調節機構。 最後に、 図4は、miRNAののmiR-15bは/ 16が過剰発現されたときに我々は、ヘルパーT細胞の分化と観察しているいくつかの典型的な結果を示しています。これらの結果は、そのように真の効果は、ヘルパーT細胞の異なる調製物を使用して複数回の反復実験の統計分析によって実証されている必要があり、個々の実験内で発生することができ変動のいくつかを示しています。これらの実験において、Th2応答は、それらがTh1応答の傾向があるので、ここで使用されるC57BL / 6行目に観察することは困難です。同様に、IL-9染色は、バックグラウンドを上回る検出するのが困難であることができます。したがって、アイソタイプコントロールを行い、正しいGAを確保するために適切な補償を設定することが不可欠ですサイトカイン発現のティン。我々の結果では、我々は、miR-15bは/ 16が部品のRictorおよびmTOR 15の発現を抑制することを通じてシグナル伝達経路のmTORを阻害することにより、iTregの誘導を増強することを発見しました。 miR-15bは/ 16は時々、個々の実験でTh0の、のTh1およびTh17細胞の分化に影響を与えることができるが、複数回の反復実験で調べ有意な影響はありません。対照的に、のmiR-15bは/ 16過剰発現は有意に（18を参照する参照）TH9の分化を抑制しません。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54698/54698fig1.jpg" /> 分離の各段階でのヘルパーT細胞の図1.標準的な純度。示された抗原の結果代表的なフローサイトメトリーは、前方散乱（FSC）および側方散乱光（SSC）プロットに指定された生細胞のゲートから示されています。 （A）前後のCD4陰性選択。 CD4の発現プロファイル、CD8a、およびMHCIIが示されています。これらは、ヘルパーT細胞の濃縮および細胞傷害性T細胞およびMHCクラスIIを発現する細胞の損失を示します。良好な精製は、この段階で〜90％のCD4 + T細胞をもたらすはずです。 （B）CD25選択。左側にはCD4、CD8a、およびMHCIIの発現プロファイルであり、右側にCD4とCD25の発現は、事前と事後選択をプロファイルしています。この時点で&gt; CD25陰性に選択された細胞の95％がCD4 + CD25であるべきです- 。 （C）CD62L選択。 CD4、CD8a、およびMHCII発現プロファイルは、左側に示されています。右側にはCD62LおよびCD44のための発現プロファイルは、ポスト、選択された細胞のCD4とCD62L発現プロファイルと一緒に前後のCD62L選択したセルについて示されています。 CD62L選択した後、実質的に全てのメモリセル（CD44 +）は、10〜15％のエフェクター細胞（CD62L 低）が含まナイーブヘルパーT細胞の高度に濃縮された集団を残して除去されます。すべてのためにFACSプロファイルは、特定のパラメータのための同等の設定とスケールが全体で維持しました。数字は、ゲート集団内の細胞の割合を表します。最初の選択後の細胞の大きさのわずかな減少は、プロトコル中の機械的ストレスにおそらくある。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54698fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54698/54698fig2.jpg" /> レトロウイルストランスフェクションHEK 293T細胞の図2分析。GFPの発現は、ウイルス培養上清を回収した後、非トランスフェクトまたはトランスフェクトし、分析のいずれかであったHEK 293T細胞において示されています。 GFP分析はFSCと最初のパネルでSSCプロット上のゲートからの生細胞で行いました。数値は、ゲート領域内のGFP +細胞の割合を表します。典型的なトンransfection効率は30から90までパーセントの範囲である。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54698fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54698/54698fig3.jpg" /> レトロウイルス形質導入されたヘルパーT細胞の図3.分析。GFPの発現は3日間Th0を、のTh1、Th2を、TH9、Th17細胞およびTregの偏光状態の分化した後、レトロウイルス形質導入ヘルパーT細胞において示されています。分析は、FSC / SSCパネルに示されているライブや活性化細胞にゲートされました。形質導入効率は、構造と偏光状態に応じて10-75％の間で変化することができます。同様に、GFP発現の平均蛍光強度が変化することができる。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54698fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 異なる偏光条件でのヘルパーT細胞の分化に対するのmiR-15bは/ 16過剰発現の図4.影響。代表的サイトカインプロファイルは、 図3からの細胞のGFP +集団に示されている。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54698fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="表1" src="/files/ftp_upload/54698/54698table1.jpg" /> 表1： これらのプロトコルで使用されるバッファの <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54986table1.xlsx" target="_blank">Excelスプレッドシートとしてこの表をダウンロードするにはこちらをクリックしてください。</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td colspan="3"> ヘルパーT細胞の分極条件</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Th0を</td><td>抗IL-4 </td><td> 5μg/ mlの</td></tr><tr><td></td><td>抗IFN-γ </td><td> 5μg/ mlの</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Th1 </td><td>組換えIL-12 </td><td> 20 ng / mlで</td></tr><tr><td></td><td>抗IL-4 </td><td> 5μg/ mlの</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Th2の</td><td>組換えIL-4 </td><td> 40 ng / mlで</td></tr><tr><td></td><td>抗IFN-γ </td><td> 5μg/ mlの</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> TH9 </td><td>組換えTGF-β </td><td> 2.5 ng / mlで</td></tr><tr><td></td><td>組換えIL-4 </td><td> 40 ng / mlで</td></tr><tr><td></td><td>抗IFN-γ </td><td> 10μg/ mlの</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Th17細胞</td><td>組換えTGF-β </td><td> 2.5 ng / mlで</td></tr><tr><td></td><td>組換えIL-6 </td><td> 50 ng / mlで</td></tr><tr><td></td><td>抗IFN-γ </td><td> 5μg/ mlの</td></tr><tr><td></td><td>抗IL-4 </td><td> 5μg/ mlの</td></tr><tr><td></td><td>抗IL-2 </td><td> 5μg/ mlの</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tregは</td><td>組換えTGF-β </td><td> 2.5 ng / mlで</td></tr><tr><td></td><td>組換えIL-2 </td><td> 5 ngの/ mlの</td></tr></tbody></table> 表2： ヘルパーT細胞サブセットの偏光状態。

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Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

多くの実験系は、免疫応答におけるT細胞の発達および機能を調節するメカニズムを理解するために利用されています。ここではレトロウイルス形質導入を用いた遺伝子アプローチは、調節経路を同定することに、経済的、時間効率的な、そして最も重要なのは、非常に有益である、記載されています。

遺伝的分化を制御するメカニズムを研究するためのアプローチと機能などのヘルパーT細胞のレトロウイルス形質導入

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

Research

JoVE Journal

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