Name: retroviral transduction of helper t cells as a genetic approach to study mechanisms controlling their differentiation and function
Uploaded: 2016-11-04T15:00:00
Duration: 11 min 50 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function at JoVE.com

This work was supported by a Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) grant (BB/H018573/1) and a BD Biosciences grant.

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	<li>Baumjohann, D., Ansel, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-mediated+regulation+of+T+helper+cell+differentiation+and+plasticity.">MicroRNA-mediated regulation of T helper cell differentiation and plasticity.</a> Nat Rev Immunol. 13 (9), 666-678 (2013).</li><li>Wilson, C. B., Rowell, E., Sekimata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+control+of+T-helper-cell+differentiation.">Epigenetic control of T-helper-cell differentiation.</a> Nat Rev Immunol. 9 (2), 91-105 (2009).</li><li>Pearce, E. L., Poffenberger, M. C., Chang, C. H., Jones, R. 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A., Lang, F., Cobb, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+regulate+T-cell+production+of+interleukin-9+and+identify+hypoxia-inducible+factor-2a+as+an+important+regulator+of+T+helper+9+and+regulatory+T-cell+differentiation.">MicroRNAs regulate T-cell production of interleukin-9 and identify hypoxia-inducible factor-2a as an important regulator of T helper 9 and regulatory T-cell differentiation.</a> Immunology. 149, 74-86 (2016).</li></ol>

The authors have no conflicting interest in the publication of this work.

Retroviral superexpressão de genes mediada é uma maneira poderosa para analisar a função das células T helper, como seu desenvolvimento e função é muitas vezes determinada pelo nível de reguladores chaves expressão. No entanto, a interpretação cuidadosa dos resultados é necessária porque os níveis de expressão significativamente superiores aos do gene endógeno pode introduzir muitos artefatos. Portanto, esta técnica deve ser combinada com outros para verificar a relevância da função. Por exemplo, a sobre-expressão deve ser complementada por uma expressão reduzida usando siRNAs ou nocaute de genes, se disponível. Com miRNAs, nós complementada experimentos superexpressão com os de bloqueio usando vírus que overexpressed miRNA artificial alvejando sites que atuaram como inibidores competitivos para um miRNA 15. células transduzidas retrovirais podem também ser utilizados em ensaios bioquímicos envolvendo ARN e análise de proteínas. No entanto, a principal limitação destas experiências é a eficiência de transdução resulting numa população mista de células transduzidas e não transduzidas. Portanto, estes ensaios irá provavelmente exigir triagem da GFP + população. Finalmente, em ensaios in vitro de diferenciação deverá ser combinado com experiências in vivo, e uma maneira que isso pode ser conseguido é por transferência adoptiva, as células T transduzidas em murganhos e após a sua diferenciação e o seu efeito sobre a resposta imune. Uma das limitações principais do presente sistema é o tamanho do genoma de ARN que podem ser embalados na cápside retroviral. Em nossa experiência, o tamanho máximo de inserção para o sistema retroviral MIG que dá uma boa produção de vírus é 3-3,5 kb. Portanto, os genes maiores não podem ser analisados ​​com este sistema, uma vez que os títulos de vírus dar pobres. No entanto, a maioria dos genes são menores do que este tamanho de modo que este sistema é útil para uma grande variedade de estudos de genes. Com a transdução retroviral, várias alternativas dentro destes Protocols têm sido utilizados. Muitos investigadores têm utilizado as linhas de células de empacotamento que expressam de forma estável os genes retrovirais (por exemplo de referência 16). No entanto, temos obtido os títulos mais elevados utilizando células HEK 293T padrão com co-transfecção do vírus auxiliar vector PCL-Eco. Isolamento de células auxiliares T ingénuos também pode ser alcançada através de separação de células, em vez do protocolo coluna de pérolas e a separação magnética de células, mas isto requer o acesso a um seleccionador de células, e os custos de tempo tipo são tipicamente mais elevado do que os reagentes de grânulo. Finalmente, existem variações sobre condições de ativação usados ​​para diferenciar células T helper para os diferentes subgrupos. Por exemplo, a estimulação de TCR de células para muito tempo antes da exposição a condições de indução Treg podem inibir a indução 16. Isto pode ser um problema porque a expressão retroviral requer a divisão celular induzida por estimulação das células. No entanto, descobrimos indução Treg eficiente usando este protocolo com O activ / Nção antes da transdução retroviral. Dentro destes protocolos, a aplicação bem-sucedida requer vários fatores. preparações retrovírus elevado título precisa transfecção eficiente das células 293T HEK DNA tão alta qualidade e precisão preparado 2x HBS são importantes. Além disso, a densidade de células das células HEK 293T necessita de ser cerca de 50% no ponto de transfecção porque boa expressão do ADN transfectado requer que as células estão a crescer activamente, e este será inibida se as células são demasiado escasso ou densa. Células na densidade ideal durante a transfecção deve chegar a confluência em algum momento durante as etapas de coleta de vírus, mas eles vão continuar a produzir stocks de vírus de título elevado durante todo o tempo para a última coleção. A diferenciação eficiente de células T auxiliares exige uma boa qualidade célula para assegurar que as células são isoladas a pureza ilustrado na Figura 1. De igual modo, a qualidade das células é dependente da FR murganhosom que foram isolados. Para estes estudos, utilizou-se 6-8 semanas de idade C57BL / 6. ratos mais velhos podem ter células menos ingênuos, e outras linhagens podem diferir em sua diferenciação. Por exemplo, ratinhos BALB / c são mais propensas a respostas Th2 do que murganhos C57BL / 6 17, de modo tal como acima referido, C57BL / 6, as células T podem ser difíceis de induzir uma resposta de Th2. Além disso, nenhuma das condições de diferenciação pode variar um pouco, de laboratório para laboratório, e o efeito de sobre-expressão de genes só pode tornar-se aparente em condições sub-óptimas de modo concentrações de citocinas nas diversas condições de polarização pode precisar de ser ajustada. Por fim, os efeitos do gene sobre-expresso ou as condições de polarização na proliferação das células pode influenciar a eficiência de transdução de medição para que os efeitos do gene de interesse pode requerer optimização do tempo e da concentração dos reagentes de polarização. Optimizando todos estes fatores devem levar a resultados informativos com este sistema.

The immune response must be highly regulated to eliminate infections but prevent attacks on self-tissue that lead to autoimmunity. Helper T cells play an essential role in regulating the immune response, and a great deal of effort has been undertaken to understand their development and function (illustrated in several recent reviews 1-3). However, many questions remain, and many approaches have been utilized to study the mechanisms controlling helper T cell development and function. These have ranged from the use of in vitro cell culture systems to whole animals. Cell culture systems, especially those using cell lines, offer the benefit of ease of use and the ability to generate large amount of material to do sophisticated biochemical analyses. However, they suffer from their limited ability to reproduce the actual conditions occurring in an immune response. In contrast, whole animal experiments offer the benefit of relevance, but they can suffer from difficulties in manipulation and the ability to perform precise controls in addition to their large costs and ethical implications. Nevertheless, the vast majority of helper T cells studies today still require the use of whole animal experiments involving primary T cells because of the inability of cell lines to duplicate the exact steps occurring in the whole animal. Therefore, it is essential to utilize cost effective approaches that are highly informative. 
Genetics is one powerful tool to study helper T cell development and function, yet traditional methods involving gene knockouts or transgenes are time consuming and expensive so they are often out of reach of small labs. However, retroviral transduction offers a powerful, rapid and, cost effective genetic approach to study the mechanisms of specific gene products. Therefore, it is commonly used in papers studying helper T cell development and function. 
We have optimized a procedure for retroviral transduction of helper T cells. It utilizes the pMIG (Murine stem cell virus-Internal ribosomal entry site-Green fluorescent protein) retroviral expression vector, in which the gene of interest can be cloned and thereby expressed from the retrovirus long terminal repeat (LTR) 4. In addition, downstream of the inserted gene of interest is an internal ribosome entry sequence (IRES) followed by the green fluorescent protein (GFP) gene so transduced cells can easily be followed by their expression of GFP. The vector was originally derived from the Murine Stem Cell Virus (MSCV) vectors, which contain mutations in repressor binding sites in the LTRs making them resistant to silencing and thus, giving high expression in many cell types including helper T cells 5,6. Production of high titer retrovirus requires a simple transient transfection protocol of human embryonic kidney (HEK) 293T cells with the MIG vector and a helper virus vector that expresses the retroviral GAG, Pol, and Env genes. For this the pCL-Eco helper virus vector 7 works well in producing high titer replication incompetent retroviruses. 
Here these protocols for retroviral production and transduction of primary murine T cells are described in addition to some of our results using this approach to study miRNA regulation of gene expression controlling helper T cell differentiation. miRNAs are small RNAs of approximately 22 nucleotides in length that post-transcriptionally regulate gene expression by targeting homologous sequences in protein encoding messenger RNAs and suppressing translation and inducing message instability 8,9. miRNAs play critical roles in developmental gene regulation. They are essential in the earliest stages of development, as embryos that cannot produce miRNAs die at a very early stage 10. In addition miRNAs are important later on in the development of many tissues. They are thought to function by fine-tuning the expression of genes required for developmental programs 1. In helper T cells miRNAs play multiple roles and are required for regulatory T cell (Treg) development 11-14. We used retroviral transduction as a means to dissect the mechanisms of miRNA regulation of Treg differentiation 15. Through such studies important individual miRNAs were determined by retroviral-mediated overexpression. Subsequently, relevant genes regulated by these miRNAs were identified in order to understand the molecular pathways regulated by miRNAs in helper T cell differentiation.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="763">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">RPMI</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">R8758</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">DMEM</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">D5671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Penicillin Streptomycin solution</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">DPBS</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">MIG vector</td>
			<td style="width:143px;">Addgene</td>
			<td style="width:167px;">Plasmid 9094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">pCL-Eco vector</td>
			<td style="width:143px;">Addgene</td>
			<td style="width:167px;">Plasmid 12371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Cell strainer</td>
			<td style="width:143px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:167px;">352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Magnetic beads mouse CD4 cell kit&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Invitrogen (Dynabeads)</td>
			<td style="width:167px;">11415D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Streptavidin Beads&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Miltenyi Biotech</td>
			<td style="width:167px;">130-048-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">MS cell separation columns</td>
			<td style="width:143px;">Miltenyi Biotech</td>
			<td style="width:167px;">130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">LS cell separation columns</td>
			<td style="width:143px;">Miltenyi Biotech</td>
			<td style="width:167px;">130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">CD25 Biotenylated MAb&#160;</td>
			<td style="width:143px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:167px;">85059</td>
			<td>clone 7D4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">CD62L Biotenylated MAb&#160;</td>
			<td style="width:143px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:167px;">553149</td>
			<td>clone MEL-14</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Polybrene (Hexadimethrine Bromide)</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">107689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-CD3</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td>16-0031-85</td>
			<td>clone 145-2C11&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-CD28</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td>16-0281-85</td>
			<td>clone 37.51&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-IL-4</td>
			<td style="width:143px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:167px;">559062</td>
			<td>clone 11B11</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-IFN-gamma</td>
			<td style="width:143px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:167px;">559065</td>
			<td>clone XMG1.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-IL-2</td>
			<td style="width:143px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:167px;">554425</td>
			<td>cloneJES6-5H4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Recombinant IL-12 p70</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:167px;">14-8121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Recombinant IL-4</td>
			<td style="width:143px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:167px;">550067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Recombinant TGF-beta</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td>14-8342-62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Recombinant IL-6</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:167px;">14-8061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Recombinant IL-2</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:167px;">14-8021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">PMA&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">P8139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Ionomycin</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">I0634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Brefeldin A</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:167px;">00-4506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">16005</td>
			<td>Paraformaldehyde is toxic so use appropriate caution when handling&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Foxp3 staining buffer set</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:167px;">00-5523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-CD4&#160; FITC</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:167px;">11-0041</td>
			<td>clone GK1.5&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-CD8a perCP-cy5.5</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td>45-0081-80</td>
			<td>clone 53-6.7&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-MHCII PE</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:167px;">12-0920</td>
			<td>&#160;clone HIS19</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-CD25 PE</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td>12-0251-82</td>
			<td>&#160;clone PC61.5&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-CD62L PE</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td>12-0621-82</td>
			<td>clone MEL-14&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-CD44 APC</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:167px;">17-0441</td>
			<td>clone IM7&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-IFN-gamma FITC&#160;</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td>11-7311-81</td>
			<td>clone XMG1.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-IL-4 PE</td>
			<td style="width:143px;">BD Biosciences</td>
			<td>554435</td>
			<td>clone 11B11</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:287px;">Anti-IL-9 PE or APC</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences/Biolegend</td>
			<td>50-8091-82/514104</td>
			<td>clone RM9A4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-IL-17a PE</td>
			<td style="width:143px;">BD Biosciences</td>
			<td>559502</td>
			<td>clone TC11-18H10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-Foxp3&#160; APC or PE</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td>17-5773-82/12-5773-80&#160;</td>
			<td>clone FJK-16s</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Na2HPO4-2H2O</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">71643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dextrose/Glucose</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES, free acid</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">NH4Cl</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">A9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disodium EDTA</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">D2900000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">KHCO3</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">237205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">&#160;CaCl2&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retroviral transduction of helper t cells as a genetic approach to study mechanisms controlling their differentiation and function

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents autoimmunity. Many approaches involving different model organisms have been utilized to understand the mechanisms controlling helper T cell development and function. However, studies using mouse models have proven to be highly informative due to the availability of genetic, cellular, and biochemical systems. One genetic approach in mice used by many labs involves retroviral transduction of primary helper T cells. This is a powerful approach due to its relative ease, making it accessible to almost any laboratory with basic skills in molecular biology and immunology. Therefore, multiple genes in wild type or mutant forms can readily be tested for function in helper T cells to understand their importance and mechanisms of action. We have optimized this approach and describe here the protocols for production of high titer retroviruses, isolation of primary murine helper T cells, and their transduction by retroviruses and differentiation toward the different helper subsets. Finally, the use of this approach is described in uncovering mechanisms utilized by microRNAs (miRNAs) to regulate pathways controlling helper T cell development and function.

O sucesso deste sistema experimental requer populações altamente pura de células T e preparações retrovirais de título elevado. Os resultados representativos são mostrados aqui como exemplos de experiências bem sucedidas. A Figura 1 mostra o grau de pureza típico das populações pré e pós-seleccionado, em cada fase do protocolo de isolamento de células auxiliares T ingénuas. Figura 2 e 3 ilustram a análise da produção de retrovírus, através da expressão de GFP nas células de HEK 293T transfectadas (Figura 2) e as células T transduzidas (Figura 3). Eficiências de transfecção das células HEK 293T pode variar significativamente com diferentes construções retrovirais, mas isso nem sempre se correlaciona com o nível de produção de retrovírus observados com o número de células GFP + T. Além disso, o número de células GFP + T podem variar dependendo das condições de polarização. Além disso, o MEAN nível de expressão de GFP e o gene inserido pode variar, dependendo do número de cópias de vírus integrado, o efeito do local de integração na transcrição, e mecanismos de regulação pós-transcricional que afectam a transcrição viral. Finalmente, a Figura 4 mostra alguns resultados típicos que temos observado com a diferenciação das células T auxiliares quando o miARNs miR-15b / 16 são sobre-expressos. Estes resultados mostram um pouco da variabilidade que pode ocorrer dentro de um experimento indivíduo efeitos tão verdadeiro deve ser fundamentada pela análise estatística de múltiplas experiências de repetição usando diferentes preparações de células T auxiliares. Nestas experiências, as respostas de Th2 pode ser difícil observar na / 6 linha C57BL usado aqui, porque eles são propensos a respostas Th1. Do mesmo modo, IL-9 de coloração pode ser difícil de detectar acima do fundo. Portanto, é imperativo fazer controlos isotípicos e configurar uma compensação adequada para garantir ga corretating da expressão das citocinas. Nos nossos resultados verificou-se que o miR-15b / 16 aumenta a indução iTreg através da inibição da via de sinalização de mTOR através da repressão da expressão do Rictor componentes e mTOR 15. miR-15b / 16 pode, por vezes, influenciar Th0, Th1, Th17 e diferenciação em experiências individuais, mas não há nenhum efeito significativo, quando examinado em várias experiências repetidas. Em contraste miR-15b / 16 superexpressão não suprimir significativamente a diferenciação Th9 (ver referência 18). <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54698/54698fig1.jpg" /> Figura 1. pureza típica de células T auxiliares em cada fase de isolamento. Citometria de fluxo representativas resultados dos antigénios indicados são mostrados desde a porta de células vivas designados na dispersão frontal (FSC) e os gráficos de dispersão lateral (SSC). Seleção negativa (A) pré e pós-CD4. perfis de expressão de CD4,CD8a e MHCII são mostrados. Estes ilustram o enriquecimento de células T auxiliares e a perda das células T citotóxicas e MHC da classe II que expressam as células. Uma boa purificação deve resultar em ~ 90% de células T CD4 +, nesta fase. (B) a seleção CD25. À esquerda são os perfis de CD4, CD8a e MHCII expressão, e à direita são a CD4 e expressão CD25 perfis pré e seleção post. Neste ponto,&gt; 95% das células CD25 seleccionadas negativamente deve ser CD4 + CD25 -. (C) CD62L selecção. CD4, CD8a, e MHCII perfis de expressão estão apresentados à esquerda. À direita dos perfis de expressão de CD62L e CD44 são mostrados para células pré e pós-CD62L selecionados juntamente com CD4 e CD62L perfil de pós selecionadas células expressão. Após a seleção CD62L praticamente todas as células de memória (CD44 +) são removidos deixando uma população altamente enriquecido de células T helper ingênuos que contém 10-15% de células efetoras (CD62L baixo). Para todosperfis FACS, configurações equivalentes e balanças de um parâmetro específico foram mantidos por toda parte. Os números representam a percentagem de células dentro de uma população fechado. A ligeira diminuição no tamanho das células após a seleção inicial é presumivelmente devido ao estresse mecânico durante o protocolo. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54698fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54698/54698fig2.jpg" /> Figura 2. Análise de células HEK 293T transfectadas com retrovírus. Expressão da GFP é mostrado em células HEK 293T que eram ou não transfectadas ou transfectadas e analisados após a colheita dos sobrenadantes de cultura viral. análise GFP foi feito em células vivas a partir do portão do FSC e enredo SSC no primeiro painel. Os números representam a percentagem de GFP + células dentro da região fechada. típico teficiências ransfection variar entre 30-90%. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54698fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54698/54698fig3.jpg" /> Figura 3. Análise de células T auxiliares retrovirais transduzidas. Expressão da GFP é mostrado em células T auxiliares retrovirais transduzidas após a diferenciação em Th0, Th1, Th2, Th9, Th17, e as condições de polarização Treg para três dias. A análise foi fechado em células vivas e ativados indicados no painel FSC / SSC. eficiências de transdução pode variar entre 10-75%, dependendo da construção e as condições de polarização. Da mesma forma, a intensidade de fluorescência média de expressão GFP pode variar. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54698fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Figura 4. Efeito de miR-15b / 16 superexpressão na diferenciação de células T helper em diferentes condições de polarização. Perfis de citocinas representativos são mostrados na GFP + população de células da Figura 3. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54698fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="tabela 1" src="/files/ftp_upload/54698/54698table1.jpg" /> Tabela 1:. Os tampões utilizados nestes protocolos <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54986table1.xlsx" target="_blank">por favor, clique aqui para baixar esta tabela como uma planilha Excel.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td colspan="3"> Ajudantecondições de polarização de células T </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Th0 </td><td> anti-IL-4 </td><td> 5 ug / ml </td></tr><tr><td></td><td> anti-IFN-γ </td><td> 5 ug / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Th1 </td><td> recombinante-IL-12 </td><td> 20 ng / mL </td></tr><tr><td></td><td> anti-IL-4 </td><td> 5 ug / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Th2 </td><td> IL-4 recombinante </td><td> 40 ng / mL </td></tr><tr><td></td><td> anti-IFN-γ </td><td> 5 ug / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Th9 </td><td> TGF-β recombinante </td><td> 2,5 ng / mL </td></tr><tr><td></td><td> IL-4 recombinante </td><td> 40 ng / mL </td></tr><tr><td></td><td> anti-IFN-γ </td><td> 10 ug / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Th17 </td><td> TGF-β recombinante </td><td> 2,5 ng / mL </td></tr><tr><td></td><td> IL-6 recombinante </td><td> 50 ng / mL </td></tr><tr><td></td><td> anti-IFN-γ </td><td> 5 ug / ml </td></tr><tr><td></td><td> anti-IL-4 </td><td> 5 ug / ml </td></tr><tr><td></td><td> anti-IL-2 </td><td> 5 ug / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tregs </td><td> TGF-β recombinante </td><td> 2,5 ng / mL </td></tr><tr><td></td><td> IL-2 recombinante </td><td> 5 ng / ml </td></tr></tbody></table> Tabela 2: subconjunto de células condições de polarização T helper.

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Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

Muitos sistemas experimentais foram utilizados para compreender os mecanismos de regulação do desenvolvimento e função de células T numa resposta imunitária. Aqui uma abordagem genética utilizando transdução retroviral é descrito, que é económico, eficiente tempo, e, o mais importante, altamente informativos na identificação de vias reguladoras.

Transdução retroviral de células T helper como uma abordagem genética para estudar mecanismos que controlam a sua diferenciação e função

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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