Name: retroviral transduction of helper t cells as a genetic approach to study mechanisms controlling their differentiation and function
Uploaded: 2016-11-04T15:00:00
Duration: 11 min 50 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function at JoVE.com

This work was supported by a Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) grant (BB/H018573/1) and a BD Biosciences grant.

<ol>
	<li>Baumjohann, D., Ansel, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-mediated+regulation+of+T+helper+cell+differentiation+and+plasticity.">MicroRNA-mediated regulation of T helper cell differentiation and plasticity.</a> Nat Rev Immunol. 13 (9), 666-678 (2013).</li><li>Wilson, C. B., Rowell, E., Sekimata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+control+of+T-helper-cell+differentiation.">Epigenetic control of T-helper-cell differentiation.</a> Nat Rev Immunol. 9 (2), 91-105 (2009).</li><li>Pearce, E. L., Poffenberger, M. C., Chang, C. H., Jones, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fueling+immunity:+insights+into+metabolism+and+lymphocyte+function.">Fueling immunity: insights into metabolism and lymphocyte function.</a> Science. 342 (6155), 1242454 (2013).</li><li>Cherry, S. R., Biniszkiewicz, D., Van Parijs, L., Baltimore, D., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+Expression+in+Embryonic+Stem+Cells+and+Hematopoietic+Stem+Cells.">Retroviral Expression in Embryonic Stem Cells and Hematopoietic Stem Cells.</a> Mol and Cell Biol. 20 (20), 7419-7426 (2000).</li><li>Miller, A. D., Rosman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+retroviral+vectors+for+gene+transfer+and+expression.">Improved retroviral vectors for gene transfer and expression.</a> BioTechniques. 7 (9), 980-990 (1989).</li><li>Grez, M., Akg&#252;n, E., Hilberg, F., Ostertag, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+virus,+a+recombinant+murine+retrovirus+with+expression+in+embryonic+stem+cells.">Embryonic stem cell virus, a recombinant murine retrovirus with expression in embryonic stem cells.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 87 (23), 9202-9206 (1990).</li><li>Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pCL+vector+system:+rapid+production+of+helper-free,+high-titer,+recombinant+retroviruses.">The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses.</a> J Virol. 70 (8), 5701-5705 (1996).</li><li>Filipowicz, W., Bhattacharyya, S. N., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+post-transcriptional+regulation+by+microRNAs:+are+the+answers+in+sight?.">Mechanisms of post-transcriptional regulation by microRNAs: are the answers in sight?.</a> Nat Rev Genetics. 9 (2), 102-114 (2008).</li><li>He, L., Hannon, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+small+RNAs+with+a+big+role+in+gene+regulation.">MicroRNAs: small RNAs with a big role in gene regulation.</a> Nat Rev Genetics. 5 (7), 522-531 (2004).</li><li>Bernstein, E., Kim, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dicer+is+essential+for+mouse+development.">Dicer is essential for mouse development.</a> Nat Genetics. 35 (3), 215-217 (2003).</li><li>Cobb, B. S., Hertweck, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+Dicer+in+immune+regulation.">A role for Dicer in immune regulation.</a> J Exp Med. 203 (11), 2519-2527 (2006).</li><li>Chong, M. M. W., Rasmussen, J. P., Rudensky, A. Y., Rundensky, A. Y., Littman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNAseIII+enzyme+Drosha+is+critical+in+T+cells+for+preventing+lethal+inflammatory+disease.">The RNAseIII enzyme Drosha is critical in T cells for preventing lethal inflammatory disease.</a> J Exp Med. 205 (9), 2005-2017 (2008).</li><li>Liston, A., Lu, L. F., O'Carroll, D., Tarakhovsky, A., Rudensky, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dicer-dependent+microRNA+pathway+safeguards+regulatory+T+cell+function.">Dicer-dependent microRNA pathway safeguards regulatory T cell function.</a> J Exp Med. 205 (9), 1993-2004 (2008).</li><li>Zhou, X., Jeker, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+miRNA+disruption+in+T+reg+cells+leads+to+uncontrolled+autoimmunity.">Selective miRNA disruption in T reg cells leads to uncontrolled autoimmunity.</a> J Exp Med. 205 (9), 1983-1991 (2008).</li><li>Singh, Y., Garden, O. A., Lang, F., Cobb, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-15b/16+Enhances+the+Induction+of+Regulatory+T+Cells+by+Regulating+the+Expression+of+Rictor+and+mTOR.">MicroRNA-15b/16 Enhances the Induction of Regulatory T Cells by Regulating the Expression of Rictor and mTOR.</a> J Immunol. 195 (12), 5667-5677 (2015).</li><li>Sauer, S., Bruno, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+receptor+signaling+controls+Foxp3+expression+via+PI3K,+Akt,+and+mTOR.">T cell receptor signaling controls Foxp3 expression via PI3K, Akt, and mTOR.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 105 (22), 7797-7802 (2008).</li><li>Yagi, J., Arimura, Y., Takatori, H., Nakajima, H., Iwamoto, I., Uchiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+background+influences+Th+cell+differentiation+by+controlling+the+capacity+for+IL-2-induced+IL-4+production+by+naive+CD4++T+cells.">Genetic background influences Th cell differentiation by controlling the capacity for IL-2-induced IL-4 production by naive CD4+ T cells.</a> Int Immunol. 18 (12), 1681-1690 (2006).</li><li>Singh, Y., Garden, O. A., Lang, F., Cobb, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+regulate+T-cell+production+of+interleukin-9+and+identify+hypoxia-inducible+factor-2a+as+an+important+regulator+of+T+helper+9+and+regulatory+T-cell+differentiation.">MicroRNAs regulate T-cell production of interleukin-9 and identify hypoxia-inducible factor-2a as an important regulator of T helper 9 and regulatory T-cell differentiation.</a> Immunology. 149, 74-86 (2016).</li></ol>

The authors have no conflicting interest in the publication of this work.

Ретровирусное опосредованной избыточная экспрессия генов является мощным средством для анализа функции в Т-хелперов, так как их развитие и функция часто определяется уровнем экспрессии ключевых регуляторов. Тем не менее, осторожность интерпретации результатов не требуется, поскольку уровни экспрессии значительно выше тех эндогенного гена можно ввести множество артефактов. Таким образом, этот метод следует сочетать с другими, чтобы проверить актуальность функции. Например, избыточная экспрессия должна быть дополнена снижением экспрессии с помощью миРНК или нокаут гена если таковые имеются. С микроРНК, мы дополнены ГИПЕРЭКСПРЕССИЯ эксперименты с теми блокировки с помощью вирусов, суперэкспрессированный искусственного микроРНК таргетирования сайтов , которые действовали в качестве конкурентных ингибиторов для микроРНК 15. Ретровирусные трансдуцированных клеток также могут быть использованы в биохимических анализов, включающих в себя РНК и анализа белков. Однако, главное ограничение этих экспериментов эффективность трансдукции Резulting в смешанной популяции трансдуцированных и untransduced клеток. Таким образом, эти анализы, скорее всего , потребуется сортировка GFP + населения. И, наконец, в пробирке дифференциации анализа должны быть объединены с экспериментами в естественных условиях, и один из способов это может быть достигнуто , является адаптивно передачи трансдуцированных Т - клеток в организм мышей и после их дифференцировки и их влияние на иммунный ответ. Одним из ключевых ограничений для этой системы является размер генома РНК, которые могут быть упакованы в ретровируса капсида. По нашему опыту, максимальный размер вставки для системы ретровирусов MIG, которая дает хорошую продукцию вируса составляет 3-3,5 кб. Таким образом, более крупные гены не могут быть проанализированы с помощью этой системы, так как они дают плохие вирусные титры. Тем не менее, большинство генов меньше, чем этот размер так что эта система полезна для широкого круга исследований генов. С помощью ретровирусов трансдукции, несколько альтернатив в рамках этих Protocoиспользовались Ls. Многие исследователи использовали упаковочные линии клеток , которые стабильно экспрессируют ретровирусные гены (например , ссылка 16). Тем не менее, мы получили самые высокие титры с использованием стандартных НЕК 293Т с котрансфекции вируса помощника вектора-Eco PCl. Выделение наивным Т-хелперов, также может быть достигнуто с помощью сортировки клеток, а не магнитного протокола колонке шарика и разделения клеток, но это требует доступа к мобильному сортировщика, а затраты на время сортировки, как правило, выше, чем бусинки реагентов. Наконец, существуют вариации на условиях активации, используемых для дифференциации Т-хелперы в различные подмножества. Например, TCR стимуляция клеток слишком долго перед воздействием Treg условий , побуждающих может ингибировать их индукции 16. Это может быть проблемой, так как ретровирусный выражение требует деление клеток, индуцированную стимуляции клеток. Тем не менее, мы нашли эффективную индукцию Treg, используя этот протокол с O / N эквания до ретровирусной трансдукции. В рамках этих протоколов, успешное применение требует нескольких факторов. Высокий титр препараты ретровирус должны эффективно трансфекции клеток 293Т НЕК настолько высокого качества ДНК и точно подготовленную 2x HBS имеют важное значение. Кроме того, плотность клеток из клеток НЕК 293Т должен быть примерно 50% в точке трансфекции, так как хорошее выражение трансфицированных ДНК требует, чтобы клетки активно растут, и это будет запрещено, если клетки слишком разреженным или плотным. Клетки при оптимальной плотности во время трансфекции должна достигать впадения в какой-то момент в течение этапов сбора вируса, но они будут продолжать производить вирусные акции с высоким титром весь путь вплоть до последней коллекции. Эффективное дифференцировка Т - хелперов требует хорошего качества клеток таким образом гарантировать , что отдельные клетки в чистоте , показанного на фиг.1. Подобным же образом, качество клеток зависит от мышей фрО.М. которой они были выделены. Для этих исследований мы использовали 6-8 неделю 6 мышей C57BL / старый. Более старые мыши могут иметь менее наивные клетки, и другие штаммы могут отличаться в их дифференциации. Например, BALB / C мышей , более склонны к Тh2 - ответов , чем мыши C57BL / 6 17 так , как было указано выше, C57BL / 6 Т - клетки могут быть трудно вызвать Th2 ответ. Кроме того, любое из условий дифференциации могут незначительно отличаться от лаборатории к лаборатории, и эффект гена сверхэкспрессии может только стать очевидными в неоптимальных условиях так концентрации цитокинов в различных условиях поляризации может потребоваться титрование. И, наконец, эффекты суперэкспрессированный гена или условия поляризации на пролиферацию клеток может влиять на эффективность трансдукции так измерения эффекты представляющего интерес гена может потребовать оптимизации времени и концентрации поляризационными реагентов. Оптимизация все эти факторы должны привести к информативных результатов с этой системой.

The immune response must be highly regulated to eliminate infections but prevent attacks on self-tissue that lead to autoimmunity. Helper T cells play an essential role in regulating the immune response, and a great deal of effort has been undertaken to understand their development and function (illustrated in several recent reviews 1-3). However, many questions remain, and many approaches have been utilized to study the mechanisms controlling helper T cell development and function. These have ranged from the use of in vitro cell culture systems to whole animals. Cell culture systems, especially those using cell lines, offer the benefit of ease of use and the ability to generate large amount of material to do sophisticated biochemical analyses. However, they suffer from their limited ability to reproduce the actual conditions occurring in an immune response. In contrast, whole animal experiments offer the benefit of relevance, but they can suffer from difficulties in manipulation and the ability to perform precise controls in addition to their large costs and ethical implications. Nevertheless, the vast majority of helper T cells studies today still require the use of whole animal experiments involving primary T cells because of the inability of cell lines to duplicate the exact steps occurring in the whole animal. Therefore, it is essential to utilize cost effective approaches that are highly informative. 
Genetics is one powerful tool to study helper T cell development and function, yet traditional methods involving gene knockouts or transgenes are time consuming and expensive so they are often out of reach of small labs. However, retroviral transduction offers a powerful, rapid and, cost effective genetic approach to study the mechanisms of specific gene products. Therefore, it is commonly used in papers studying helper T cell development and function. 
We have optimized a procedure for retroviral transduction of helper T cells. It utilizes the pMIG (Murine stem cell virus-Internal ribosomal entry site-Green fluorescent protein) retroviral expression vector, in which the gene of interest can be cloned and thereby expressed from the retrovirus long terminal repeat (LTR) 4. In addition, downstream of the inserted gene of interest is an internal ribosome entry sequence (IRES) followed by the green fluorescent protein (GFP) gene so transduced cells can easily be followed by their expression of GFP. The vector was originally derived from the Murine Stem Cell Virus (MSCV) vectors, which contain mutations in repressor binding sites in the LTRs making them resistant to silencing and thus, giving high expression in many cell types including helper T cells 5,6. Production of high titer retrovirus requires a simple transient transfection protocol of human embryonic kidney (HEK) 293T cells with the MIG vector and a helper virus vector that expresses the retroviral GAG, Pol, and Env genes. For this the pCL-Eco helper virus vector 7 works well in producing high titer replication incompetent retroviruses. 
Here these protocols for retroviral production and transduction of primary murine T cells are described in addition to some of our results using this approach to study miRNA regulation of gene expression controlling helper T cell differentiation. miRNAs are small RNAs of approximately 22 nucleotides in length that post-transcriptionally regulate gene expression by targeting homologous sequences in protein encoding messenger RNAs and suppressing translation and inducing message instability 8,9. miRNAs play critical roles in developmental gene regulation. They are essential in the earliest stages of development, as embryos that cannot produce miRNAs die at a very early stage 10. In addition miRNAs are important later on in the development of many tissues. They are thought to function by fine-tuning the expression of genes required for developmental programs 1. In helper T cells miRNAs play multiple roles and are required for regulatory T cell (Treg) development 11-14. We used retroviral transduction as a means to dissect the mechanisms of miRNA regulation of Treg differentiation 15. Through such studies important individual miRNAs were determined by retroviral-mediated overexpression. Subsequently, relevant genes regulated by these miRNAs were identified in order to understand the molecular pathways regulated by miRNAs in helper T cell differentiation.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="763">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">RPMI</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">R8758</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">DMEM</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">D5671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Penicillin Streptomycin solution</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">DPBS</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">MIG vector</td>
			<td style="width:143px;">Addgene</td>
			<td style="width:167px;">Plasmid 9094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">pCL-Eco vector</td>
			<td style="width:143px;">Addgene</td>
			<td style="width:167px;">Plasmid 12371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Cell strainer</td>
			<td style="width:143px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:167px;">352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Magnetic beads mouse CD4 cell kit&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Invitrogen (Dynabeads)</td>
			<td style="width:167px;">11415D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Streptavidin Beads&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Miltenyi Biotech</td>
			<td style="width:167px;">130-048-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">MS cell separation columns</td>
			<td style="width:143px;">Miltenyi Biotech</td>
			<td style="width:167px;">130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">LS cell separation columns</td>
			<td style="width:143px;">Miltenyi Biotech</td>
			<td style="width:167px;">130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">CD25 Biotenylated MAb&#160;</td>
			<td style="width:143px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:167px;">85059</td>
			<td>clone 7D4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">CD62L Biotenylated MAb&#160;</td>
			<td style="width:143px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:167px;">553149</td>
			<td>clone MEL-14</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Polybrene (Hexadimethrine Bromide)</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">107689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-CD3</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td>16-0031-85</td>
			<td>clone 145-2C11&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-CD28</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td>16-0281-85</td>
			<td>clone 37.51&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-IL-4</td>
			<td style="width:143px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:167px;">559062</td>
			<td>clone 11B11</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-IFN-gamma</td>
			<td style="width:143px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:167px;">559065</td>
			<td>clone XMG1.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-IL-2</td>
			<td style="width:143px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:167px;">554425</td>
			<td>cloneJES6-5H4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Recombinant IL-12 p70</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:167px;">14-8121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Recombinant IL-4</td>
			<td style="width:143px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:167px;">550067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Recombinant TGF-beta</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td>14-8342-62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Recombinant IL-6</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:167px;">14-8061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Recombinant IL-2</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:167px;">14-8021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">PMA&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">P8139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Ionomycin</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">I0634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Brefeldin A</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:167px;">00-4506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">16005</td>
			<td>Paraformaldehyde is toxic so use appropriate caution when handling&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Foxp3 staining buffer set</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:167px;">00-5523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-CD4&#160; FITC</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:167px;">11-0041</td>
			<td>clone GK1.5&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-CD8a perCP-cy5.5</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td>45-0081-80</td>
			<td>clone 53-6.7&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-MHCII PE</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:167px;">12-0920</td>
			<td>&#160;clone HIS19</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-CD25 PE</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td>12-0251-82</td>
			<td>&#160;clone PC61.5&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-CD62L PE</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td>12-0621-82</td>
			<td>clone MEL-14&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-CD44 APC</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:167px;">17-0441</td>
			<td>clone IM7&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-IFN-gamma FITC&#160;</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td>11-7311-81</td>
			<td>clone XMG1.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-IL-4 PE</td>
			<td style="width:143px;">BD Biosciences</td>
			<td>554435</td>
			<td>clone 11B11</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:287px;">Anti-IL-9 PE or APC</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences/Biolegend</td>
			<td>50-8091-82/514104</td>
			<td>clone RM9A4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-IL-17a PE</td>
			<td style="width:143px;">BD Biosciences</td>
			<td>559502</td>
			<td>clone TC11-18H10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-Foxp3&#160; APC or PE</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td>17-5773-82/12-5773-80&#160;</td>
			<td>clone FJK-16s</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Na2HPO4-2H2O</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">71643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dextrose/Glucose</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES, free acid</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">NH4Cl</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">A9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disodium EDTA</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">D2900000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">KHCO3</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">237205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">&#160;CaCl2&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retroviral transduction of helper t cells as a genetic approach to study mechanisms controlling their differentiation and function

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents autoimmunity. Many approaches involving different model organisms have been utilized to understand the mechanisms controlling helper T cell development and function. However, studies using mouse models have proven to be highly informative due to the availability of genetic, cellular, and biochemical systems. One genetic approach in mice used by many labs involves retroviral transduction of primary helper T cells. This is a powerful approach due to its relative ease, making it accessible to almost any laboratory with basic skills in molecular biology and immunology. Therefore, multiple genes in wild type or mutant forms can readily be tested for function in helper T cells to understand their importance and mechanisms of action. We have optimized this approach and describe here the protocols for production of high titer retroviruses, isolation of primary murine helper T cells, and their transduction by retroviruses and differentiation toward the different helper subsets. Finally, the use of this approach is described in uncovering mechanisms utilized by microRNAs (miRNAs) to regulate pathways controlling helper T cell development and function.

Успех этой экспериментальной системы требует высокой степенью чистоты популяции Т-клеток и препаратов ретровируса с высоким титром. Типичные результаты приведены здесь в качестве примеров успешных экспериментов. На рисунке 1 показана типичная чистота пред- и пост отобранных групп населения на каждом этапе наивным протокола изоляции клеток помощник T. Рисунок 2 и 3 иллюстрируют анализ производства ретровируса с помощью выражения GFP в трансфицированных НЕК 293T клеток (рис 2) и трансдуцированных Т - клетки (рисунок 3). Эффективность трансфекции клеток НЕК 293Т может существенно изменяться в зависимости от различных ретровирусов конструкциями, но это часто не коррелирует с уровнем производства ретровируса наблюдаемого с числом GFP + Т - клеток. Кроме того , количество GFP + Т - клеток может изменяться в зависимости от условий поляризации. Кроме того, мЕАН уровень экспрессии GFP и введенного гена может изменяться в зависимости от количества вирусных копий интегрированных, эффект сайта интеграции по отношению к транскрипции, и пост-транскрипционные регуляторные механизмы, влияющие на вирусный транскрипт. И, наконец, на рисунке 4 показаны некоторые типичные результаты , которые мы наблюдали с дифференциацией Т - хелперного , когда микроРНК микроРНК-15b / 16 гиперэкспрессии. Эти результаты показывают некоторые из изменчивости, которая может произойти в пределах отдельного эксперимента так истинные эффекты должны быть обоснованы с помощью статистического анализа многократных повторных экспериментах с использованием различных препаратов Т-хелперы. В этих опытах Th2 реакции может быть трудно наблюдать в / 6 линии C57BL используется здесь, потому что они склонны к Th1 ответа. Аналогично, IL-9 окрашивание может быть трудно обнаружить выше фона. Поэтому крайне важно, чтобы сделать контроль изотипа и установить надлежащую компенсацию для обеспечения правильного гатин экспрессии цитокина. В наших результатах , мы обнаружили , что микроРНК-15b / 16 усиливает iTreg индукцию путем ингибирования MTOR сигнальный путь через подавление экспрессии Rictor компонентов и МРМ 15. микроРНК-15b / 16 могут иногда влиять на Th0, Th1 и Th17 дифференциацию в отдельных экспериментах, но нет никакого существенного влияния при рассмотрении в нескольких повторных экспериментах. В отличие от микроРНК-15b / 16 избыточная экспрессия не приводит к существенному подавления Th9 дифференциации (см ссылку 18). <img alt="Рисунок 1" src="/files/ftp_upload/54698/54698fig1.jpg" /> Рисунок 1. Типичная чистота Т - хелперов на каждой стадии выделения. Представитель проточной цитометрии результаты указанных антигенов показаны от ворот живых клеток , обозначенных в Forward Scatter (FSC) и бокового рассеяния (SSC) участков. (А) до и после CD4 негативный отбор. Профили экспрессии CD4,CD8a и MHCII показаны. Они иллюстрируют обогащение Т-хелперов и потерю цитотоксических Т-клеток и МНС класса II, выражающие клетки. Хорошая очистка должна привести к ~ 90% CD4 + T - клеток на данном этапе. (Б) выбор CD25. Слева являются профили экспрессии CD4, CD8a и MHCII, а справа являются CD4 и экспрессия CD25 профилей до и после выбора. На данный момент&gt; 95% CD25 отрицательно отобранных клеток должны быть CD4 + CD25 -. (С) CD62L выбор. CD4, CD8a и MHCII профили экспрессии показаны на левой стороне. Справа профили экспрессии для CD62L и CD44 показаны для пред- и пост-CD62L выбранных клеток наряду с CD4 и CD62L профиля экспрессии почтовых выбранных ячеек. После выбора CD62L практически все ячейки памяти (CD44 +), удаляются , оставляя высокообогащенный популяцию наивных Т - хелперов , который содержит 10-15% эффекторных клеток (CD62L низкий). Для всехFACS профили, эквивалентные параметры и шкалы для определенного параметра были сохранены во всем. Числа представляют процент клеток в пределах огороженной населения. Небольшое уменьшение размеров клеток после первоначального отбора, предположительно , из - за механического напряжения во время протокола. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54698fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54698fig1large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54698fig1large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> <img alt="фигура 2" src="/files/ftp_upload/54698/54698fig2.jpg" /> Рисунок 2. Анализ ретровирусоподобных трансфецировали клетки 293Т НЕК. Экспрессии GFP показан на НЕК 293Т , которые были либо нетрансфицированные или трансфицируют и анализировали после сбора вирусных супернатантов культуры. Анализ GFP был сделан на живые клетки от ворот на FSC и SSC участок в первой панели. Числа представляют процент GFP + клеток в зоне интереса . Типичный тЭффективность ransfection в диапазоне от 30-90%. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54698fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54698fig2large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54698fig2large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> <img alt="Рисунок 3" src="/files/ftp_upload/54698/54698fig3.jpg" /> Выражение GFP Рисунок 3. Анализ ретровируса трансдуцированных Т - хелперов. Показана на ретровирусных-трансдуцированных Т - хелперы после дифференцировки в Th0, Th1, Th2, Th9, Th17, и условия поляризации Treg в течение трех дней. Анализ был закрытого типа на живых и активированных клеток, указанных в панели FSC / SSC. Эффективность трансдукции может колебаться в пределах 10-75%, в зависимости от конструкции и условий поляризации. Кроме того, средняя интенсивность флуоресценции GFP экспрессии может изменяться. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54698fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54698fig3large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54698fig3large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> Рисунок 4. Влияние MIR-15b / 16 суперэкспрессия на хелперов дифференциации Т - клеток в различных условиях поляризации. Типичные профили цитокина показаны на GFP + популяции клеток из рисунка 3. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54698fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54698fig4large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54698fig4large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> <img alt="Таблица 1" src="/files/ftp_upload/54698/54698table1.jpg" /> Таблица 1:. Буферы , используемые в этих протоколах <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54986table1.xlsx" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54986table1.xlsx" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54986table1.xlsx" target="_blank">чтобы загрузить эту таблицу в виде таблицы Excel.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td colspan="3"> помощникТ условия клеточной поляризации </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Th0 </td><td> анти-IL-4 </td><td> 5 мкг / мл </td></tr><tr><td></td><td> анти-IFN-γ </td><td> 5 мкг / мл </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Th1 </td><td> Рекомбинантный IL-12 </td><td> 20 нг / мл </td></tr><tr><td></td><td> анти-IL-4 </td><td> 5 мкг / мл </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Th2 </td><td> рекомбинантный IL-4 </td><td> 40 нг / мл </td></tr><tr><td></td><td> анти-IFN-γ </td><td> 5 мкг / мл </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Th9 </td><td> рекомбинантный TGF-β </td><td> 2,5 нг / мл </td></tr><tr><td></td><td> рекомбинантный IL-4 </td><td> 40 нг / мл </td></tr><tr><td></td><td> анти-IFN-γ </td><td> 10 мкг / мл </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Th17 </td><td> рекомбинантный TGF-β </td><td> 2,5 нг / мл </td></tr><tr><td></td><td> рекомбинантный IL-6 </td><td> 50 нг / мл </td></tr><tr><td></td><td> анти-IFN-γ </td><td> 5 мкг / мл </td></tr><tr><td></td><td> анти-IL-4 </td><td> 5 мкг / мл </td></tr><tr><td></td><td> анти-IL-2, </td><td> 5 мкг / мл </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tregs </td><td> рекомбинантный TGF-β </td><td> 2,5 нг / мл </td></tr><tr><td></td><td> рекомбинантный IL-2 </td><td> 5 нг / мл </td></tr></tbody></table> Таблица 2: Т - хелперного подмножество условия поляризации.

Watch this Scientific Journal Video about Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function at JoVE.com

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

Многие экспериментальные системы были использованы, чтобы понять механизмы, регулирующие развитие и функцию Т-клеток в иммунном ответе. Здесь генетический подход с использованием ретровирусной трансдукции описывается, что экономические, время эффективно, а самое главное, весьма информативным в выявлении регуляторных путей.

Ретровирусное трансдукция Т-хелперы как генетический подход к изучению механизмов, контролирующих их дифференцировку и функции

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Ретровирусные трансдукция Т-клеточных рецепторов в мышь Т-клеток

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Представляем напряжения сдвига в изучении бактериальной адгезии

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

Направленной дифференцировки индуцированных плюрипотентных стволовых клеток по отношению к Т-лимфоцитов

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+  cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of  malignancies 1. CTLs can  ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

<em&gt; В пробирке</em&gt; Модель для изучения гетерогенности человека дифференциации макрофагов и поляризация

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation

Аденовирусной трансдукции наивного CD4 Т-клеток по изучению Treg Дифференциация

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

Трансплантация кожи хвоста изучать Аллогенная лимфоцитов CD4 ответов у мышей

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Radial Mobility and Cytotoxic Function of Retroviral Replicating Vector Transduced, Non-adherent Alloresponsive T Lymphocytes

Радиальная Мобильность и цитотоксическую функцию ретровирусных Репликация Векторный Трансдуцированные неприлипшие Alloresponsive Т-лимфоцитов

We report a novel adaptation of the Radial Monolayer Cell Migration assay, first reported to measure the radial migration of adherent tumor cells on ...

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

Ретровирусное Трансдукция костного мозга клеток-предшественников для генерации Т-клеточного рецептора Retrogenic Мыши

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

Development of an Antigen-driven Colitis Model to Study Presentation of Antigens by Antigen Presenting Cells to T Cells

Разработка Антиген-ведомой колита моделью для изучения Презентация антигенами путем антигенпрезентирующих клеток, Т-клеткам

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological ...

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

порождающий<em&gt; De Novo</em&gt; Антиген-специфический человеческий Т-клеточный рецепторам трансдукции ретровирусных Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...