Name: retroviral transduction of helper t cells as a genetic approach to study mechanisms controlling their differentiation and function
Uploaded: 2016-11-04T15:00:00
Duration: 11 min 50 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function at JoVE.com

This work was supported by a Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) grant (BB/H018573/1) and a BD Biosciences grant.

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	<li>Baumjohann, D., Ansel, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-mediated+regulation+of+T+helper+cell+differentiation+and+plasticity.">MicroRNA-mediated regulation of T helper cell differentiation and plasticity.</a> Nat Rev Immunol. 13 (9), 666-678 (2013).</li><li>Wilson, C. B., Rowell, E., Sekimata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+control+of+T-helper-cell+differentiation.">Epigenetic control of T-helper-cell differentiation.</a> Nat Rev Immunol. 9 (2), 91-105 (2009).</li><li>Pearce, E. L., Poffenberger, M. C., Chang, C. H., Jones, R. 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The authors have no conflicting interest in the publication of this work.

Retrovirales sobreexpresión de los genes mediada es una forma poderosa para analizar la función de las células T auxiliares, ya que su desarrollo y la función es a menudo determinado por el nivel de expresión de los reguladores clave. Sin embargo, se requiere una interpretación cautelosa de los resultados, ya que los niveles de expresión significativamente superiores a los del gen endógeno pueden introducir muchos artefactos. Por lo tanto, esta técnica se debe combinar con otros para comprobar la relevancia de la función. Por ejemplo, la sobreexpresión debe complementarse con una expresión reducida mediante siRNAs gen knockouts o si está disponible. Con miRNAs, complementamos experimentos de sobreexpresión con los de bloqueo usando virus que sobreexpresan miRNA artificial orientada a sitios que actuaban como inhibidores competitivos para un miARN 15. células transducidas retrovirales también se pueden utilizar en ensayos bioquímicos que implican ARN y análisis de proteínas. Sin embargo, una limitación importante de estos experimentos es la eficiencia de transducción de resulting en una población mixta de células transducidas y no transducidas. Por lo tanto, estos ensayos lo más probable es requerir la clasificación de la GFP + población. Finalmente, en ensayos in vitro de la diferenciación se deben combinar con los experimentos in vivo, y una forma esto se puede lograr es mediante la transferencia adoptiva de las células T transducidas en ratones y después de su diferenciación y su efecto sobre la respuesta inmune. Una de las limitaciones principales de este sistema es el tamaño del genoma de ARN que puede ser empaquetado en la cápside retroviral. En nuestra experiencia, el tamaño máximo de inserción para el sistema MIG retroviral que da buena producción de virus es 3-3,5 kb. Por lo tanto, los genes de mayor tamaño no pueden ser analizados con este sistema, ya que dan pobres títulos de virus. Sin embargo, la mayoría de los genes son más pequeños que este tamaño por lo que este sistema es útil para una amplia variedad de estudios de genes. Con la transducción retroviral, varias alternativas dentro de estos protocose han utilizado ls. Muchos investigadores han utilizado líneas celulares de empaquetamiento que expresan de forma estable los genes retrovirales (para el Ejemplo de Referencia 16). Sin embargo, se han obtenido los títulos más altos utilizando células HEK 293T estándar con la co-transfección del vector del virus auxiliar PCL-Eco. Aislamiento de células T auxiliares naïve también se puede lograr a través de clasificación de células en lugar de el protocolo de la columna de talón y la separación celular magnética, pero esto requiere el acceso a un clasificador de células, y los costes de tiempo de tipo son típicamente más altos que los reactivos de talón. Por último, hay variaciones en condiciones de activación que se utilizan para diferenciar las células T auxiliares en los diferentes subconjuntos. Por ejemplo, la estimulación de TCR de las células durante demasiado tiempo antes de la exposición a condiciones de inducción de Treg puede inhibir su inducción 16. Esto puede ser un problema porque la expresión retroviral requiere la división celular inducida por la estimulación de las células. Sin embargo, hemos encontrado que la inducción de Treg eficiente el uso de este protocolo con S / N activación antes de la transducción retroviral. Dentro de estos protocolos, la aplicación exitosa requiere de varios factores. preparaciones de retrovirus con alta titulación necesitan transfección eficiente de las células HEK 293T ADN tan alta calidad y precisión preparado 2x HBS son importantes. Además, la densidad celular de las células HEK 293T necesita ser aproximadamente 50% en el punto de transfección debido a la buena expresión del ADN transfectado requiere que las células están creciendo activamente, y esto se inhibe si las células son demasiado escasa o densa. Las células en la densidad óptima durante la transfección deben llegar a la confluencia en algún momento durante las etapas de recolección de virus, pero seguirán produciendo reservas de virus de alto título hasta el final de la última colección. Diferenciación eficiente de las células T auxiliares requiere buena calidad celular para asegurar que las células aisladas son a la pureza se ilustra en la Figura 1. Del mismo modo, la calidad de las células depende de la fr ratonesom que se aislaron. Para estos estudios, hemos utilizado de 6-8 semanas de edad C57BL / 6 ratones. Los ratones más viejos pueden tener células menos ingenuas, y otras cepas pueden diferir en su diferenciación. Por ejemplo, los ratones BALB / c son más propensos a las respuestas Th2 que C57BL / 6 ratones 17 de manera que se ha indicado anteriormente, C57BL / 6 células T pueden ser difíciles de inducir una respuesta Th2. Además, cualquiera de las condiciones de diferenciación pueden variar ligeramente de un laboratorio a otro, y el efecto de la sobreexpresión del gen sólo se pondrá de manifiesto en condiciones subóptimas por lo concentraciones de citoquinas en las diversas condiciones de polarización pueden necesitar ser valorada. Finalmente, los efectos del gen sobreexpresado o las condiciones de polarización en la proliferación celular pueden influir en la eficacia de transducción así efectos de medición del gen de interés pueden requerir la optimización de la sincronización y la concentración de reactivos de polarización. La optimización de todos estos factores debe conducir a resultados informativos con este sistema.

The immune response must be highly regulated to eliminate infections but prevent attacks on self-tissue that lead to autoimmunity. Helper T cells play an essential role in regulating the immune response, and a great deal of effort has been undertaken to understand their development and function (illustrated in several recent reviews 1-3). However, many questions remain, and many approaches have been utilized to study the mechanisms controlling helper T cell development and function. These have ranged from the use of in vitro cell culture systems to whole animals. Cell culture systems, especially those using cell lines, offer the benefit of ease of use and the ability to generate large amount of material to do sophisticated biochemical analyses. However, they suffer from their limited ability to reproduce the actual conditions occurring in an immune response. In contrast, whole animal experiments offer the benefit of relevance, but they can suffer from difficulties in manipulation and the ability to perform precise controls in addition to their large costs and ethical implications. Nevertheless, the vast majority of helper T cells studies today still require the use of whole animal experiments involving primary T cells because of the inability of cell lines to duplicate the exact steps occurring in the whole animal. Therefore, it is essential to utilize cost effective approaches that are highly informative. 
Genetics is one powerful tool to study helper T cell development and function, yet traditional methods involving gene knockouts or transgenes are time consuming and expensive so they are often out of reach of small labs. However, retroviral transduction offers a powerful, rapid and, cost effective genetic approach to study the mechanisms of specific gene products. Therefore, it is commonly used in papers studying helper T cell development and function. 
We have optimized a procedure for retroviral transduction of helper T cells. It utilizes the pMIG (Murine stem cell virus-Internal ribosomal entry site-Green fluorescent protein) retroviral expression vector, in which the gene of interest can be cloned and thereby expressed from the retrovirus long terminal repeat (LTR) 4. In addition, downstream of the inserted gene of interest is an internal ribosome entry sequence (IRES) followed by the green fluorescent protein (GFP) gene so transduced cells can easily be followed by their expression of GFP. The vector was originally derived from the Murine Stem Cell Virus (MSCV) vectors, which contain mutations in repressor binding sites in the LTRs making them resistant to silencing and thus, giving high expression in many cell types including helper T cells 5,6. Production of high titer retrovirus requires a simple transient transfection protocol of human embryonic kidney (HEK) 293T cells with the MIG vector and a helper virus vector that expresses the retroviral GAG, Pol, and Env genes. For this the pCL-Eco helper virus vector 7 works well in producing high titer replication incompetent retroviruses. 
Here these protocols for retroviral production and transduction of primary murine T cells are described in addition to some of our results using this approach to study miRNA regulation of gene expression controlling helper T cell differentiation. miRNAs are small RNAs of approximately 22 nucleotides in length that post-transcriptionally regulate gene expression by targeting homologous sequences in protein encoding messenger RNAs and suppressing translation and inducing message instability 8,9. miRNAs play critical roles in developmental gene regulation. They are essential in the earliest stages of development, as embryos that cannot produce miRNAs die at a very early stage 10. In addition miRNAs are important later on in the development of many tissues. They are thought to function by fine-tuning the expression of genes required for developmental programs 1. In helper T cells miRNAs play multiple roles and are required for regulatory T cell (Treg) development 11-14. We used retroviral transduction as a means to dissect the mechanisms of miRNA regulation of Treg differentiation 15. Through such studies important individual miRNAs were determined by retroviral-mediated overexpression. Subsequently, relevant genes regulated by these miRNAs were identified in order to understand the molecular pathways regulated by miRNAs in helper T cell differentiation.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="763">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">RPMI</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">R8758</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">DMEM</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">D5671</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Penicillin Streptomycin solution</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">DPBS</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">MIG vector</td>
			<td style="width:143px;">Addgene</td>
			<td style="width:167px;">Plasmid 9094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">pCL-Eco vector</td>
			<td style="width:143px;">Addgene</td>
			<td style="width:167px;">Plasmid 12371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Cell strainer</td>
			<td style="width:143px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:167px;">352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Magnetic beads mouse CD4 cell kit&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Invitrogen (Dynabeads)</td>
			<td style="width:167px;">11415D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Streptavidin Beads&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Miltenyi Biotech</td>
			<td style="width:167px;">130-048-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">MS cell separation columns</td>
			<td style="width:143px;">Miltenyi Biotech</td>
			<td style="width:167px;">130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">LS cell separation columns</td>
			<td style="width:143px;">Miltenyi Biotech</td>
			<td style="width:167px;">130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">CD25 Biotenylated MAb&#160;</td>
			<td style="width:143px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:167px;">85059</td>
			<td>clone 7D4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">CD62L Biotenylated MAb&#160;</td>
			<td style="width:143px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:167px;">553149</td>
			<td>clone MEL-14</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Polybrene (Hexadimethrine Bromide)</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">107689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-CD3</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td>16-0031-85</td>
			<td>clone 145-2C11&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-CD28</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td>16-0281-85</td>
			<td>clone 37.51&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-IL-4</td>
			<td style="width:143px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:167px;">559062</td>
			<td>clone 11B11</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-IFN-gamma</td>
			<td style="width:143px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:167px;">559065</td>
			<td>clone XMG1.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-IL-2</td>
			<td style="width:143px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:167px;">554425</td>
			<td>cloneJES6-5H4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Recombinant IL-12 p70</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:167px;">14-8121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Recombinant IL-4</td>
			<td style="width:143px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:167px;">550067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Recombinant TGF-beta</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td>14-8342-62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Recombinant IL-6</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:167px;">14-8061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Recombinant IL-2</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:167px;">14-8021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">PMA&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">P8139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Ionomycin</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">I0634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Brefeldin A</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:167px;">00-4506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">16005</td>
			<td>Paraformaldehyde is toxic so use appropriate caution when handling&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Foxp3 staining buffer set</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:167px;">00-5523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-CD4&#160; FITC</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:167px;">11-0041</td>
			<td>clone GK1.5&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-CD8a perCP-cy5.5</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td>45-0081-80</td>
			<td>clone 53-6.7&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-MHCII PE</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:167px;">12-0920</td>
			<td>&#160;clone HIS19</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-CD25 PE</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td>12-0251-82</td>
			<td>&#160;clone PC61.5&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-CD62L PE</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td>12-0621-82</td>
			<td>clone MEL-14&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-CD44 APC</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td style="width:167px;">17-0441</td>
			<td>clone IM7&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-IFN-gamma FITC&#160;</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td>11-7311-81</td>
			<td>clone XMG1.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-IL-4 PE</td>
			<td style="width:143px;">BD Biosciences</td>
			<td>554435</td>
			<td>clone 11B11</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:287px;">Anti-IL-9 PE or APC</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences/Biolegend</td>
			<td>50-8091-82/514104</td>
			<td>clone RM9A4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-IL-17a PE</td>
			<td style="width:143px;">BD Biosciences</td>
			<td>559502</td>
			<td>clone TC11-18H10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Anti-Foxp3&#160; APC or PE</td>
			<td style="width:143px;">eBiosciences</td>
			<td>17-5773-82/12-5773-80&#160;</td>
			<td>clone FJK-16s</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Na2HPO4-2H2O</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">71643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dextrose/Glucose</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES, free acid</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">NH4Cl</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">A9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disodium EDTA</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">D2900000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">KHCO3</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">237205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">&#160;CaCl2&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:167px;">C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retroviral transduction of helper t cells as a genetic approach to study mechanisms controlling their differentiation and function

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents autoimmunity. Many approaches involving different model organisms have been utilized to understand the mechanisms controlling helper T cell development and function. However, studies using mouse models have proven to be highly informative due to the availability of genetic, cellular, and biochemical systems. One genetic approach in mice used by many labs involves retroviral transduction of primary helper T cells. This is a powerful approach due to its relative ease, making it accessible to almost any laboratory with basic skills in molecular biology and immunology. Therefore, multiple genes in wild type or mutant forms can readily be tested for function in helper T cells to understand their importance and mechanisms of action. We have optimized this approach and describe here the protocols for production of high titer retroviruses, isolation of primary murine helper T cells, and their transduction by retroviruses and differentiation toward the different helper subsets. Finally, the use of this approach is described in uncovering mechanisms utilized by microRNAs (miRNAs) to regulate pathways controlling helper T cell development and function.

El éxito de este sistema experimental requiere poblaciones altamente puras de células T y de las preparaciones de retrovirus de alto título. Los resultados representativos se muestran aquí como ejemplos de experimentos exitosos. La figura 1 muestra la pureza típica de las poblaciones de pre y seleccionado enviar-en cada etapa del protocolo de aislamiento de células helper T naïve. Figura 2 y 3 ilustran el análisis de la producción de retrovirus a través de la expresión de GFP en las células HEK 293T transfectadas (Figura 2) y las células T transducidas (Figura 3). Las eficacias de transfección de las células HEK 293T pueden variar significativamente con diferentes construcciones retrovirales, pero esto a menudo no se correlaciona con el nivel de producción observado retrovirus con el número de células T + GFP. Además, el número de células GFP + T puede variar dependiendo de las condiciones de polarización. Además, el mnivel de expresión de GFP ean y el gen insertado puede variar en función del número de copias de virus integrado, el efecto del sitio de integración en la transcripción, y los mecanismos de regulación post-transcripcional que afectan a la transcripción viral. Por último, la figura 4 muestra algunos resultados típicos que hemos observado con la diferenciación de células T ayudantes cuando el miARN miR-15b / 16 se sobreexpresa. Estos resultados muestran algunas de las variables que puede ocurrir dentro de un experimento individual efectos tan verdaderos deben justificarse mediante un análisis estadístico de múltiples experimentos repetidos utilizando diferentes preparaciones de células T auxiliares. En estos experimentos las respuestas Th2 pueden ser difíciles de observar en la línea C57BL / 6 se utiliza aquí, ya que son propensos a las respuestas Th1. Asimismo, IL-9 tinción puede ser difícil de detectar por encima del fondo. Por lo tanto, es imperativo que hacer controles de isotipo y establecer una compensación adecuada para garantizar la correcta gating de expresión de citoquinas. En nuestros resultados hemos encontrado que miR-15b / 16 aumenta la inducción iTreg mediante la inhibición de la vía de señalización a través de la supresión de la expresión de la Rictor componentes y mTOR 15 mTOR. miR-15b / 16 veces puede influir Th0, Th1, y la diferenciación Th17 en experimentos individuales, pero no hay ningún efecto significativo cuando se examinó en varios experimentos repetidos. En contraste miR-15b / 16 sobreexpresión no suprimir significativamente la diferenciación Th9 (véase la referencia 18). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54698/54698fig1.jpg" /> Figura 1. pureza típica de las células T colaboradoras en cada etapa de aislamiento. Citometría de flujo Representante resultados de los antígenos indicados se muestran desde la puerta de células vivas designadas en la dispersión frontal (FSC) y parcelas de dispersión lateral (SSC). Selección negativa (A) pre y post-CD4. perfiles de expresión de CD4,CD8a, y MHCII se muestran. Estos ilustran el enriquecimiento de células T auxiliares y la pérdida de las células T citotóxicas y de MHC de clase II de las células que expresan. Una buena purificación debe resultar en ~ células T CD4 + 90% en esta etapa. (B) Selección de CD25. A la izquierda están los perfiles de expresión de CD4, CD8a, y MHCII, ya la derecha son la expresión de CD4 y CD25 perfiles de pre y selección posterior. En este punto&gt; 95% de CD25 células seleccionadas negativamente debe ser CD4 + CD25 -. (C) CD62L selección. CD4, CD8a, y MHCII perfiles de expresión se muestran a la izquierda. A la derecha de los perfiles de expresión de CD62L y CD44 se comunican para las celdas seleccionadas pre y post-CD62L junto con CD4 y CD62L perfil de expresión de células de correos seleccionado. Después de la selección CD62L se eliminan virtualmente todas las células de memoria (CD44 +) dejando una población altamente enriquecida de células T colaboradoras ingenuas que contiene 10-15% de células efectoras (CD62L baja). Para todosperfiles de FACS, configuraciones equivalentes y escalas de un parámetro específico se mantuvieron a lo largo. Los números representan el porcentaje de células dentro de una población cerrada. La ligera disminución en el tamaño de las células después de la selección inicial es presumiblemente debido a la tensión mecánica durante el protocolo. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54698fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54698/54698fig2.jpg" /> Figura 2. Análisis de células HEK 293T transfectadas de retrovirus. Expresión de GFP se muestra en las células HEK 293T que eran o no transfectadas o transfectadas y se analizaron después de la recogida de los sobrenadantes de cultivo virales. análisis de GFP se realiza en células vivas de la puerta en el FSC y SSC trama en el primer panel. Los números representan el porcentaje de células GFP + dentro de la región acotada. t típicaeficiencias ransfection oscilan entre 30-90%. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54698fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54698/54698fig3.jpg" /> Figura 3. Análisis de células T auxiliares de retrovirus transducidas. Expresión de GFP se muestra en las células T helper-retrovirales transducidas después de la diferenciación en Th0, Th1, Th2, Th9, Th17, y las condiciones de polarización Treg durante tres días. El análisis fue cerrada en células vivas y activos indicados en el panel de FSC / SSC. Las eficacias de transducción pueden variar entre 10-75% dependiendo de la construcción y de las condiciones de polarización. Del mismo modo, la intensidad media de fluorescencia de la expresión de GFP puede variar. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54698fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Figura 4. Efecto de miR-15b / 16 sobreexpresión de ayudante de diferenciación de células T en diferentes condiciones de polarización. Perfiles de citoquinas representativos se muestran en la GFP + población de células a partir de la figura 3. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54698fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Tabla 1" src="/files/ftp_upload/54698/54698table1.jpg" /> Tabla 1:. Los tampones utilizados en estos protocolos <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54698/54986table1.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar la tabla como una hoja de cálculo de Excel.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td colspan="3"> Ayudantecondiciones de polarización de las células T </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Th0 </td><td> anti-IL-4 </td><td> 5 mg / ml </td></tr><tr><td></td><td> anti-IFN-γ </td><td> 5 mg / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Th1 </td><td> recombinante-IL-12 </td><td> 20 ng / ml </td></tr><tr><td></td><td> anti-IL-4 </td><td> 5 mg / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Th2 </td><td> IL-4 recombinante </td><td> 40 ng / ml </td></tr><tr><td></td><td> anti-IFN-γ </td><td> 5 mg / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Th9 </td><td> TGF-β recombinante </td><td> 2,5 ng / ml </td></tr><tr><td></td><td> IL-4 recombinante </td><td> 40 ng / ml </td></tr><tr><td></td><td> anti-IFN-γ </td><td> 10 mg / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Th17 </td><td> TGF-β recombinante </td><td> 2,5 ng / ml </td></tr><tr><td></td><td> IL-6 recombinante </td><td> 50 ng / ml </td></tr><tr><td></td><td> anti-IFN-γ </td><td> 5 mg / ml </td></tr><tr><td></td><td> anti-IL-4 </td><td> 5 mg / ml </td></tr><tr><td></td><td> anti-IL-2 </td><td> 5 mg / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tregs </td><td> TGF-β recombinante </td><td> 2,5 ng / ml </td></tr><tr><td></td><td> IL-2 recombinante </td><td> 5 ng / ml </td></tr></tbody></table> Tabla 2: T colaboradoras subconjunto de células condiciones de polarización.

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Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

Muchos sistemas experimentales se han utilizado para entender los mecanismos que regulan el desarrollo de células T y la función en una respuesta inmune. Aquí se describe un enfoque genético usando la transducción retroviral, que es económico, eficiente en tiempo, y lo más importante, muy informativos en la identificación de las vías de regulación.

Retroviral transducción de células T colaboradoras como un enfoque genético para estudiar mecanismos que controlan su diferenciación y función

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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