Name: automated robotic liquid handling assembly of modular dna devices
Uploaded: 2017-12-01T14:00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices at JoVE.com

אנו מודים Swapnil Bhatia, אלחנדרו פלאז ו ג'ונסון לאם לעבודה על פרוייקט בובנאי, כמו גם Swati קאר, רייצ'ל סמית, תומאס קוסטה לעזרה עם כתב היד הזה. עבודה זו מומן על ידי ה-NSF הקריירה פרס #1253856. זה גם ממומן על ידי משלחות ה-NSF במחשוב פרס #1522074.

1. ציון חלקי כדי לשמש ספריית DNA התקן והוראות ליצור משתמש/נוזל המטפל [15 דקות]
<ol><li>שימוש בכל דפדפן אינטרנט, נווט אל mocloassembly.com ולהעלות Genbank קבצים עבור כל חלקי דנ א זה ייכלל בערכת עיצוב המכשיר DNA קומבינטורית.</li>
	<li>לאחר כל הקבצים שהעלית, בחר חלקים DNA הרצוי ולגרור אותם אל בד ריק, הצבת חלק סוגים לפי הסדר סופי המיועד חלקי דנ א. הערה: אוספים של חלקים, כמו גם חלקים בודדים, יכול להיות שנבחרו והניח על גבי בד. גם, להזמין חלקי דנ א כך 5' של 3' חופות סלעיות עבור כל משחק חלק.</li>
	<li>לחץ על "להרכיב" בחלק הימני התחתון של הדף. הערה: הכלי רק יפיק את הרכבות חוקי, buildable בהתבסס על המסוכך זוג בסיסים ארבע מחזיתות כל חלק על מערכת העיכול עם האנזים BsaI. אם אף התקן ה-DNA buildable קיים מבוסס על החלקים שהועלו על-ידי המדען, הכלי יציין כי הרכבות לא נמצאו.</li>
	<li>
נווט אל הכרטיסיה 'תוכניות' ולהוריד קבצים שנוצרו על-ידי הכלי. קבצים אלה יכללו:
	<ol>
<li>צלחת קריא מפות עבור המדען להכין דגימות די אן איי, וכן ריאגנטים הכרחי עבור התגובות</li>
		<li>'בחירה' עבור המטפל נוזלי</li>
		<li>קבצים Genbank המבואר מלא עבור כל התקני ה-DNA הניתנים להרכבה הערה: נוזל טיפול הזרוע מיצוב בעת גישה לכל כוח מעבדה חדשה חייב להיבדק. עיין בספר ההדרכה של היצרן לקבלת הוראות מפורטות כיצד להתאים את הזרוע pipetting ממקמים X, Y ו- Z צירים לפי הצורך.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. מכינים דנ א פלסמיד, ריאגנטים עבור הרכבה [3 ימים]
<ol><li>[יום 1] באמצעות לולאה חיסון סטרילי, לעבוד ליד להבה פתוחה או בכל תא למינארי, פס החוצה גליצרול חיידקי מניות על גבי לוחות LB-אגר בתוספת אנטיביוטיקה מתאימה. . עושה את זה בשביל כל החלקים DNA הכרחי, מקפיד לעקר את הלולאה בין כל דגימה. דגירה צלחות ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. הערה: קפוא גליצרול חיידקי מניות יש לשמור על הקרח ככל האפשר. מחזורים ההקפאה חוזרות ונשנות-הפשרה להנמיך את הכדאיות של המניה, יש להימנע.</li>
	<li>[יום 2] באמצעות פיפטה סטרילי עצה, קיסם, או חיסון לולאה, והוא פועל ליד להבה פתוחה או בכל תא למינארי, לחסן 3 מ ל מרק ליברות (בתוספת אנטיביוטיקה מתאימה) עם מושבה בודדת של הלוחות LB-אגר המבושלות 2.1. דגירה תרבויות בין לילה ב 37 מעלות צלזיוס תוך טלטול-300 סל ד.</li>
	<li>[יום 3] לטהר DNA פלסמיד חיידקי תרבויות באמצעות ערכת טיהור כל הכנה מיני זמינים מסחרית פלסמיד.</li>
	<li>באמצעות הקובץ MoClo_Setup.xlsx מסופקים, לדלל כל דגימה של פלסמיד דנ א כדי ריכוז של 20 fmol µL במים או מאגר טה.</li>
	<li>בעקבות המפה צלחת של קובץ PDF שנוצר על-ידי הכלי הרכבה, למקם את עוצמת הקול המצוין של כל חלק DNA מדולל לתוך הבאר המתאים על צלחת המתנוצץ PCR 96-ובכן. החזק הזה SetupPlate על הקרח עד הצורך, או לסגור עם נייר דבק חותם ולאחסן ב-20 ° C.</li>
	<li>
על קרח, להכין את התגובה mastermix עם הרכיבים הבאים: עבור כל µL 20 של תגובה הוסף 2 µL של 10 x T4 DNA ליגאז מאגר, 0.5 µL של T4 DNA ליגאז (HC), ו µL 1 של האנזים BsaI. גיליון מחשבון נכלל בקובץ MoClo_Setup.xlsx כדי לסייע עם זה.
	<ol>
<li>להפיץ את האנזים mastermix לתוך הבארות המתאים של המתנוצץ 96-ובכן PCR צלחת חדשה, בעקבות המפה צלחת עבור ReagentPlate בקובץ PDF שנוצר. שמור את ReagentPlate על הקרח או על 96-ובכן קר-בלוק. הערה: ReagentPlate צריך רק להיות מוכן כשאתה מוכן להפעיל את מכלול המטפל נוזלי.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. לבצע את ההרכבה Script על המטפל נוזלי [משתנה]
<ol><li>מקם את SetupPlate(s) את ReagentPlate(s) (על הקור 96-ובכן-בלוק), את המספר הדרוש של המתנוצץ לוחות ה-PCR של 96-ובכן ריק על סיפונה של המטפל נוזלי. Plate(s) ריק יהיה OutputPlate(s) שבו התגובות הם מורכבים.</li>
	<li>להכין את המטפל נוזלי לשלוט תוכנה על-ידי יצירת מופעים של ריאגנט ולדגום שהלוח מוכן, מקפיד לתת להם שמות. בדיוק כפי שהם מופיעים על מפות צלחת נוצר על ידי mocloassembly.com, כולל שוקת של נקי, מים יונים שכותרתו ' מאגר '.</li>
	<li>באמצעות הפקודה 'Worklist' בתוכנה שליטה, לטעון את הקובץ .gwl שנוצר על ידי כלי התוכנה שלנו, ואחריו עוד פקודה 'Worklist' אשר יבצע את הקובץ .gwl טעון בפקודה הראשונה.</li>
	<li>לבצע את ה-script באמצעות הפקודה 'הפעל' של התוכנה בקר. הערה: אפשר תמיד המטפל נוזלי רובוטית להשלמת הביצוע של קובץ script לפני שתנסה לגשת אל החלל הסיפון.</li>
	<li>הסר את כל הצלחות סיפון נוזלי המטפל. הנותרים דנ א יכול להיוושע על ידי איטום את SetupPlate(s) עם סרט איטום אלומיניום ואחסון ב-20 ° C. לסגור את OutputPlate(s) עם סרט דביק, מקום thermocycler או חום-בלוק ולהפעיל עם הפרמטרים הבאים מחזור: 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים, 50 מעלות למשך 5 דקות, 80 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, להחזיק ב 4 ° C הערה: לאחר השלמת התגובה thermocycling, OutputPlate(s) ניתן לאחסן ב-20 ° C עד שהם יהיו מוכנים להשתנות.</li>
</ol>4. להפוך את התגובות [יום 1]
<ol><li>
להפשיר את מספר המחוייבים המוסמכת e. coli תא aliquots צריך (10 µL-תגובה) על קרח. הערה: כדי לשמור על עקרות, השלבים הבאים יש לבצעו ליד להבה פתוחה, או בתוך תא למינארי.<ol>
<li>בעוד תאים הם מפשיר, הכן LB-אגר צלחות (המכיל אנטיביוטיקה מתאימה) על ידי pipetting 50 µL של 0.1 M IPTG, µL 50 של 20 מ"ג/מ"ל של X-גל על גבי המשטח. להפוך את תערובת הבסיס אם ציפוי מספר רב של תגובות. מעיל הלוחות באופן אחיד בעזרת מוט זכוכית סטריליים או חרוזי זכוכית ומאפשרים את הצלחות לנוח ב 37 מעלות צלזיוס למשך לפחות 15 דקות לפני ציפוי חיידקים. הערה: לחלופין, הוסף IPTG, X-גל אגר נוזלי לפני הצלחות הם שפכו, 2 מ מ IPTG, µg/mL 40 X-גל הריכוז הסופי. אחסן את הצלחות האלה מחוץ לאורות ישירים כמו X-גל רגישים לאור.</li>
	</ol>
</li>
	<li>על קרח, aliquot 10 µL של תאים המוסמכים עבור כל תגובה לתוך צלחת חדשה של ה-PCR 96-ובכן. זה יהיה הצלחת השינוי.</li>
	<li>להוסיף 1-3 µL של כל תגובה OutputPlate(s) אל המתאימה היטב הצלחת השינוי, דגירה על קרח למשך 5 דקות.</li>
	<li>לאטום את הצלחת השינוי עם דבק הלם חום ו קולנוע ב- thermocycler ב- 42 ° C ל 30 s. לאחר מכן, מיד במקום את הצלחת על קרח למשך 2 דקות.</li>
	<li>לבארות באותה צלחת טרנספורמציה, להוסיף 150 µL של התקשורת SOC, החותם בחותם דבק אלומיניום, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס תוך טלטול-900 סל"ד עבור 1שעות.</li>
	<li>צלחת את התוכן המלא של כל טוב של הצלחת השינוי על לוחות LB-אגר המבושלות 4.1.1 באמצעות מוט זכוכית סטריליים או חרוזי זכוכית כדי להרגיע באופן אחיד על פני הצלחת. דגירה צלחות ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.</li>
</ol>5. לשבט אימות [2 ימים]
<ol><li>
להכין אחד או כמה התרבות 96-ובכן-באר רחובות עם 1.5 מ ל מרק ליברות (המכיל אנטיביוטיקה מתאימה).
	<ol>
<li>דומה צעד 2.2, לחסן את גושי-באר תרבות עם מושבות לבן יחיד של כל צלחת אגר ליברות של תגובות טרנספורמציה.</li>
		<li>לאטום את גושי תרבות גושפנקה גז-חדיר, דגירה בין לילה ב 37 מעלות צלזיוס תוך טלטול-900 סל"ד. הערה: מודולרי שיבוט טכניקה מנצל כחול-לבן הקרנה, לכן CFUs חיובי יופיעו לבן על הצלחת LB-אגר, ואילו יעד ריק וקטורים יופיעו כחול.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לבודד דנ א פלסמיד מתרבויות חיידקי (כמו 2.3) ולהגיש עבור סנגר רצף כדי לוודא שיבוטים.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Gardner, T. S., Cantor, C. R., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+a+genetic+toggle+switch+in+Escherichia+coli.">Construction of a genetic toggle switch in Escherichia coli.</a> Nature. 403 (6767), 339-342 (2000).</li><li>Elowitz, M. B., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+oscillatory+network+of+transcriptional+regulators.">A synthetic oscillatory network of transcriptional regulators.</a> Nature. 403 (6767), 335-338 (2000).</li><li>Lutolf, M. P., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+biomaterials+as+instructive+extracellular+microenvironments+for+morphogenesis+in+tissue+engineering.">Synthetic biomaterials as instructive extracellular microenvironments for morphogenesis in tissue engineering.</a> Nat Biotechnol. 23 (1), 47-55 (2005).</li><li>Anderson, J. C., Clarke, E. J., Arkin, A. P., Voigt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmentally+controlled+invasion+of+cancer+cells+by+engineered+bacteria.">Environmentally controlled invasion of cancer cells by engineered bacteria.</a> J Mol Biol. 355 (4), 619-627 (2006).</li><li>Xie, Z., Wroblewska, L., Prochazka, L., Weiss, R., Benenson, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-input+RNAi-based+logic+circuit+for+identification+of+specific+cancer+cells.">Multi-input RNAi-based logic circuit for identification of specific cancer cells.</a> Science. 333 (6047), 1307-1311 (2011).</li><li>Ro, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+the+antimalarial+drug+precursor+artemisinic+acid+in+engineered+yeast.">Production of the antimalarial drug precursor artemisinic acid in engineered yeast.</a> Nature. 440 (7086), 940-943 (2006).</li><li>Georgianna, D. R., Mayfield, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+diversity+and+synthetic+biology+for+the+production+of+algal+biofuels.">Exploiting diversity and synthetic biology for the production of algal biofuels.</a> Nature. 488 (7411), 329-335 (2012).</li><li>Savage, D. F., Way, J., Silver, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defossiling+fuel:+how+synthetic+biology+can+transform+biofuel+production.">Defossiling fuel: how synthetic biology can transform biofuel production.</a> ACS Chem Biol. 3 (1), 13-16 (2008).</li><li>Fussenegger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptogramin-based+gene+regulation+systems+for+mammalian+cells.">Streptogramin-based gene regulation systems for mammalian cells.</a> Nat Biotechnol. 18 (11), 1203-1208 (2000).</li><li>Boorsma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+temperature-regulated+replicon-based+DNA+expression+system.">A temperature-regulated replicon-based DNA expression system.</a> Nat Biotechnol. 18 (4), 429-432 (2000).</li><li>Malphettes, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mammalian+expression+system+derived+from+components+coordinating+nicotine+degradation+in+arthrobacter+nicotinovorans+pAO1.">A novel mammalian expression system derived from components coordinating nicotine degradation in arthrobacter nicotinovorans pAO1.</a> Nucleic Acids Res. 33 (12), e107 (2005).</li><li>Brophy, J. A., Voigt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+genetic+circuit+design.">Principles of genetic circuit design.</a> Nat Methods. 11 (5), 508-520 (2014).</li><li>Lou, C., Stanton, B., Chen, Y. J., Munsky, B., Voigt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribozyme-based+insulator+parts+buffer+synthetic+circuits+from+genetic+context.">Ribozyme-based insulator parts buffer synthetic circuits from genetic context.</a> Nat Biotechnol. , (2012).</li><li>Cardinale, S., Arkin, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contextualizing+context+for+synthetic+biology--identifying+causes+of+failure+of+synthetic+biological+systems.">Contextualizing context for synthetic biology--identifying causes of failure of synthetic biological systems.</a> Biotechnol J. 7 (7), 856-866 (2012).</li><li>Carr, S. B., Beal, J., Densmore, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+DNA+context+dependence+in+bacterial+promoters.">Reducing DNA context dependence in bacterial promoters.</a> PLoS One. 12 (4), e0176013 (2017).</li><li>Yeung, E., Ng, A., Kim, J., Sun, Z. Z., Murray, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Decision and Control (CDC), 2014 IEEE 53rd Annual Conference on. , 5405-5412 (2014).</li><li>Engler, C., Gruetzner, R., Kandzia, R., Marillonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Golden+gate+shuffling:+a+one-pot+DNA+shuffling+method+based+on+type+IIs+restriction+enzymes.">Golden gate shuffling: a one-pot DNA shuffling method based on type IIs restriction enzymes.</a> PLoS One. 4 (5), e5553 (2009).</li><li>Weber, E., Engler, C., Gruetzner, R., Werner, S., Marillonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modular+cloning+system+for+standardized+assembly+of+multigene+constructs.">A modular cloning system for standardized assembly of multigene constructs.</a> PLoS One. 6 (2), e16765 (2011).</li><li>Iverson, S. V., Haddock, T. L., Beal, J., Densmore, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CIDAR+MoClo:+Improved+MoClo+Assembly+Standard+and+New+E.+coli+Part+Library+Enable+Rapid+Combinatorial+Design+for+Synthetic+and+Traditional+Biology.">CIDAR MoClo: Improved MoClo Assembly Standard and New E. coli Part Library Enable Rapid Combinatorial Design for Synthetic and Traditional Biology.</a> ACS Synth Biol. 5 (1), 99-103 (2016).</li><li>Casini, A., Storch, M., Baldwin, G. S., Ellis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bricks+and+blueprints:+methods+and+standards+for+DNA+assembly.">Bricks and blueprints: methods and standards for DNA assembly.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (9), 568-576 (2015).</li><li>Bhatia, S. P., Smanski, M., Voigt, C. A., Densmore, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+design+via+combinatorial+constraint+specification.">Genetic design via combinatorial constraint specification.</a> ACS Synth Biol. , (2017).</li><li>Ham, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design,+implementation+and+practice+of+JBEI-ICE:+an+open+source+biological+part+registry+platform+and+tools.">Design, implementation and practice of JBEI-ICE: an open source biological part registry platform and tools.</a> Nucleic Acids Res. 40 (18), e141 (2012).</li><li>Madsen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SBOL+Stack:+A+Platform+for+Storing,+Publishing,+and+Sharing+Synthetic+Biology+Designs.">The SBOL Stack: A Platform for Storing, Publishing, and Sharing Synthetic Biology Designs.</a> ACS Synth Biol. 5 (6), 487-497 (2016).</li><li>Knight, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Draft standard for BioBrick biological parts. , (2007).</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>Ma, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FusX:+A+Rapid+One-Step+Transcription+Activator-Like+Effector+Assembly+System+for+Genome+Science.">FusX: A Rapid One-Step Transcription Activator-Like Effector Assembly System for Genome Science.</a> Hum Gene Ther. 27 (6), 451-463 (2016).</li><li>Check Hayden, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+automated+lab.">The automated lab.</a> Nature. 516 (7529), 131-132 (2014).</li><li>Nielsen, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+circuit+design+automation.">Genetic circuit design automation.</a> Science. 352 (6281), aac7341 (2016).</li><li>Woodruff, L. B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Registry+in+a+tube:+multiplexed+pools+of+retrievable+parts+for+genetic+design+space+exploration.">Registry in a tube: multiplexed pools of retrievable parts for genetic design space exploration.</a> Nucleic Acids Res. 45 (3), 1553-1565 (2017).</li><li>Hasty, J., McMillen, D., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+gene+circuits.">Engineered gene circuits.</a> Nature. 420 (6912), 224-230 (2002).</li><li>Gibson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+overlapping+DNA+fragments.">Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments.</a> Methods Enzymol. 498, 349-361 (2011).</li><li>Appleton, E., Tao, J., Haddock, T., Densmore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactive+assembly+algorithms+for+molecular+cloning.">Interactive assembly algorithms for molecular cloning.</a> Nat Methods. 11 (6), 657-662 (2014).</li><li>Vasilev, V., Liu, C., Haddock, T., Bhatia, S., Adler, A., Yaman, F., Beal, J., Babb, J., Weiss, R., Densmore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Software+Stack+for+Specification+and+Robotic+Execution+of+Protocols+for+Synthetic+Biological+Engineering.">A Software Stack for Specification and Robotic Execution of Protocols for Synthetic Biological Engineering.</a> SynBERC Fall Retreat, Harvard University. , (2011).</li><li>Beal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+end-to-end+workflow+for+engineering+of+biological+networks+from+high-level+specifications.">An end-to-end workflow for engineering of biological networks from high-level specifications.</a> ACS Synth Biol. 1 (8), 317-331 (2012).</li><li>Bhatia, S., Densmore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pigeon:+a+design+visualizer+for+synthetic+biology.">Pigeon: a design visualizer for synthetic biology.</a> ACS Synth Biol. 2 (6), 348-350 (2013).</li></ol>

דנסמור נשיא ומייסד שותף של סריג אוטומיישן טימונס, סריג של מקארתי עובדים. סריג הופך תוכנה ושירותים עבור האוטומציה של התהליך שמתואר רבים.

לסיכום, אוטומציה מלאה DNA התקן תהליך היצירה, החל ב- silico בתכנון וכלה טיפול בנוזלים, היא מטרה מעשית עם הקיימת כיום הטכנולוגיה. תוכנה ורובוטיקה מודרניות לאפשר יצירת זרימות עבודה הינם חסכוניים, היעילה, מדרגי, תוך שהיא גם תוצאות לשחזור באופן עקבי יותר מאשר בשיטות ידניות. בעוד אוטומציה עשוי להיות לא תמיד הבחירה הכי חסכונית עבור ביצוע פרוטוקול, היא לשפר את ניסיוני הפארמצבטית, חוקר בעל ערך זמן פנוי. עם זאת, תלוי בחומרה מנוצל, השימוש באוטומציה לפעמים נסיעה עלות וזמן ביצוע מתחת מה יכולה להיות מושגת באמצעות שיטות קונבנציונליות ידנית. יתר על כן, אוטומציה לוכדת פרוטוקולים באופן מפורש באופן פורמאלי מניעת אד-הוק, artisanal, ומבוססות מומלצת אנקדוטיים ניסויים. כאן הוכח הרכבה אוטומטית של מכשירי ה-DNA מודולרי, פרוטוקול, קבצים אלקטרוניים ומשאבים פיזיים דנ א הדרוש עבור הקורא לבצע אלה, דומה, ניסויים על עצמם הינם מסופקים. אנו מקווים הזמינות של הכלי שלנו, פרסום פרוטוקול זה לשמש משאב ולהזיז את השדה לקראת עתיד שקוף יותר, קהילתיים באזור של ה-DNA מכלול התהליכים ונוזלים טיפול רובוטיקה.
התועלת של אוטומציה החומרה תלויה ברובה תצורת & היכולות של הציוד הזה. למשל, המטפל נוזלי שלנו משתמשת הזחה נוזל מערכת כדי להניע וביופסיה ולא לוותר על פקודות. ה פיסטונס כי הכונן הנוזל המערכת הם גדולים יחסית 1 מ"ל מזרקים של אשר, בזמן שימושי עבור מגוון רחב של אמצעי אחסון, מטיל מגבלה נמוכה יותר 2 µL עבור dispensing מדויק של ריאגנטים. כתוצאה מכך, אנו מדורגים את הנפח הכולל של שיבוט תגובות להגדיר על המטפל נוזלי כדי 20 µL, מאז כל לוותר על הפקודה צריך להיות ≥2 µL. זה יעיל הוכפל העלות לכל תגובה לתגובות נוזלי מוכן המטפל, אולם הקטינה באופן משמעותי משך הזמן על הידיים נדרש לבצע את התגובות האלה. במאמץ כדי לטפל בבעיה זו, אנחנו חזר על הגדרת תגובה עבור כל 96 תגובות על מתקן נוזלי אקוסטית. מכשיר זה משתמש באנרגיה קול כדי לשלול נוזל ישירות מתוך לוח אחד למשנהו, והוא יכול להשיג לוותר על אמצעי אחסון הרחק למטה (2.5 nL) מה אפשרי עם עקירה אוויר רגיל המבוסס על פיפטות ידנית. שימוש במכשיר זה, היינו מסוגלים לטפס למטה את הנפח הכולל של התגובות שלנו 250 nL, ירידה 40-fold בהשוואה מוכן באופן ידני תגובות של 10 µL. בגלל אמצעי האחסון קטן בגליל, העדר טיפ שינויים בין שלבים pipetting, מנפק אקוסטית היה מסוגל לייצר לאותן תגובות 96 בשבריר מהזמן (< 5 דקות). אמצעי האחסון התגובה קטן יותר גם לשמור על ריאגנטים מבוזבז, מאז אנחנו בדרך כלל רק שינוי צורה 1-3 µL של התגובה. זאת, השימוש של חומרה אוטומציה, יחד עם תוכנה אינטואיטיבית, באפשרותך להפוך הדור של מספרים גדולים של ה-DNA הרכבה תגובות נגיש קהל אקדמי הרבה יותר רחב.
. הנה, נדגים את התועלת של כלי התוכנה שלנו, עם זאת ישנם מספר תכונות אשר יסייעו להרחיב את השימושיות שלה. ראשית, בכל פעם שהכלי משמש להפקת אסיפה קומבינטורית, לוחיות הרישוי של החלק ה-DNA להפיקם, הדורשים המדען לאכלוס הצלחות האלה באופן ידני עבור כל הרכבה לרוץ. זה יהיה מועיל, במקום זאת, אם המדען יכול לציין את המיקום של חלקים בצלחת דנ א כדי לשמש בהרכבה. זה יאפשר השימוש תפוקה גבוהה פלסמיד ערכות טיהור DNA כיוון חוקרים יכולים לחסן תרבויות ערכה כמו הספרייה MoClo CIDAR, לטהר כל דוגמאות יחד תוך שמירה על מיקום טוב של כל חלק שצוין בערכה. שנית, הכלי תומך כעת רק את השימוש 96-ובכן צלחות. לפרויקטים גדולים יותר שבו מספר התקנים DNA מאות צריך להיות בנוי, המספר של ה-DNA, ריאגנט היעד צלחות עשוי לעלות על הסיפון קיבולת של המטפל נוזלי. בעיה זו, ניתן להקל לפחות חלקית, על ידי תמיכה עבור תבניות צלחת צפיפות גבוהה יותר (384 או ובכן 1536). לבסוף, הכלי תומך כעת רק סוג אחד של המטפל נוזלי ואסטרטגיה הרכבה הדנ א. אמנם זה יחסית קל להמיר את ההוראות המיוצר כלי המטפל נוזלי לתבנית מנפק אקוסטיים באמצעות תוכנת הגיליון האלקטרוני, אנו מקווים להרחיב תמיכה מקורית רבים המטפלים נוזלי שונים אשר ירחיב במידה רבה את תחולתן, כמו תאימות עם טכניקות הרכבה נפוצות אחרות DNA רוצה גיבסון הרכבה31.
חלק חיוני של המערכת האקולוגית הזו הרכבה אוטומטית הוא סט של כלי תוכנה שמתרגמת הרכבה ברמה גבוהה תוכניות פרוטוקולים ידידותי אוטומציה המתוזמנים באופן מפורש על נוזל טיפול רובוטים. על פי מספר כלי תוכנה קיימים לאפשר לחוקרים עיצוב הרכבות ב- silico כולל Benchling, MoClo המתכנן של רייבן32, למעטים יש את היכולת לתרגם את התכניות לתוך הוראות הפעלה להפעיל נוזל המטפל. לזה קץ, עבודה כגון יחסי ציבור-יח צ אוטומציה, בובנאי33,34,35 החלו להפוך כלים אלה זמינים. בנוסף, ישויות מסחריות עובד באזור זה הם בחינת דרכים להציג את "ענן" labs המספקים שירותי ניסיוני לקבוצות גדולות של משתמשי קצה באמצעות אוטומציה. פרוטוקול המתוארים במאמר זה יכול לשמש כאמור חתיכה של כל המאמצים הללו שהן מוצגות כשירות.
בעוד הרכבה אוטומטית של התקני ה-DNA הוא בעל ערך מיידי וברור ביולוגיה סינתטית, פרוטוקול שלנו שימושי עבור הקהילה גדול פיצחו גם. אוטומציה של מכלול ה-DNA מאפשר מספר רב של ידועים, אך מכשירים דומים, גנטי ליצור במקביל והוא יכול לאפשר סינתזה מהירה של הביטוי ספריות הקרנת ולבדיקה למטרות בלימודי פיתוח התרופה. אנו מקווים כי-כלי תוכנה שלנו מאמצים גדולים קומבינטורית מבוססי DNA הרכבה נגיש יותר, לשמש משאב שימושי הן ביולוגיה סינתטית, כמו גם הקהילה האקדמית גדול יותר.

המוקדם סינתטי ביולוגיים גנטיים המכשירים של דו-מצבי מתג קולינס1 ו repressilator Elowitz2 הראו כי מערכות ביולוגיות יכול להיות קדימה מתוכנן יש פונקציות ספציפיות, דטרמיניסטי. מאז, ביולוגים סינתטי יש חתרו מהנדס חיים מערכות לבצע את הפונקציונליות מסובכת יותר בשירות biomaterials3, חברת4,5,6, דלק ביולוגי 7,8, ו biosensing יישומים9,10,11. להשגת יישומים אלה באמצעות שילוב מודולרי DNA 'חלקים' לתוך 'מכשירים' עם פונקציונליות מסוימת כבר אחת ממטרותיה העיקריות של ביולוגיה סינתטית. לתהליך הזה קנה המידה, חייב להיות טכניקה המאפשרת היצירה של מכשירים מורכבים מספריות גדול של חלקים היעילה, חסכוניים, הדבר החשוב ביותר, באופן לשחזור.
כזה תהליך ההרכבה ולקיבולת היא מוצדקת כי כיום השדה חסר הבנה מלאה של החוקים המנחה מוצלח מערכת ביולוגית עיצוב ו הלחנה. זה היא מתעצמת על דיו מאופיין DNA חלקים12, חוסר תאימות composability של חלקים13, ואינטראקציות צפוי, לא רצוי בין רכיבים גנטיים בתוך מכשירים סינתטי14, 15. בהיעדר דגמי ניבוי אמין, פונקציונלי התקנים גנטי סינתטי הם הגיעו על ידי ניסוי וטעייה, אשר דורש עשרות או אפילו מאות, עוצמת אות קלט-פלט וריאנטים של התקן המיועד מוקרנים "הכי טוב" נבחרה עבור הרכב עם אלמנטים במורד הזרם16. בעוד מודרנית סטנדרטית דנ א שיטות הרכבה כמו שער הזהב17, שיבוט מודולרי18,19,20 להקל על תהליך זה, מומחה ניסיוני עדיין נדרשת לביצוע כל פרוטוקול. ולגדול התקנים סינטטי בגודל ואת המורכבות, השטח הכולל עיצוב זמין יגדל יתר על המידה כדי לבנות ולבדוק באופן ידני21, והתהליך יהיה artisanal מדי עבור כל התקדמות משמעותית אשר ניתן לשכפול להתבצע בשטח.
עד כניסתו של ביולוגיה סינתטית, חלק ביולוגיות למאגרים כגון iGEM חלקים הרישום (http://partsregistry.org), JBEI מלאי של Composable אלמנטים גנטיים22, ואת SynBioHub23, החלקים לא אוחסנו באף תבנית סטנדרטית הרכבה. רק קומץ קטן של חלקים צריכים להיות משובטים לכל פרוייקט, לפיכך, הנפח של שיבוט עשה היה קטן, ואת המימוש של התקן שהורכב היה השגה, טריוויאלי בהשוואה מטרות המחקר בפועל. שיבוט מולקולרי היה לעתים קרובות אד הוק , המבוצעת באמצעות הגבלת מעכל מבוסס על אתר ההגבלה וזמינות endonuclease ולא בעקבות כל תהליך סטנדרטית. היעדר סטנדרטיזציה הגיע מעשית כדי להפוך לאוטומטי בכל פרוטוקול שיבוט כפי שהיה סביר כי התגובה הבא שיבוט יעקבו פרוטוקול זהה. יתר על כן, אוטומציה של ה-DNA הרכבה נדרש השקעה כספית משמעותית בציוד (נוזל טיפול רובוטים והתשתית המשויכת אליהם מכשור מעבדתי ותוכנה) וכן הזמן וההשקעה לדור של ההוראות כדי לפתח מדויק פרמטרים עבור טיפול המעמדות השונים נוזלים המעובדות הסדרה מדויק של ההוראות להפעלת פרוטוקולים אלה. שיבוט המאמצים בקנה מידה קטן אינו מצדיק הוצאות אלו. השילוב של עיצובים התקן גנטי גדול יותר, מורכבים יותר בשילוב עם הרכבה מתוקננת פרוטוקולים24,25 יוצר סביבה איפה מאוד פרקטי האוטומציה של תהליכים אלה. רובוטיקה בעלות נמוכה כמו Opentrons OT-אחד26 מתגלים גם מה שמאפשר מעבדות ממומן אפילו בצניעות לגשת טכנולוגיה זו. בנוסף, "ענן" מעבדות27 כולל Transcriptic, הברקת ענן מעבדה, כמו גם אקדמית "biofoundries" כגון אדינבורו הגנום היציקה, iBioFab UIUC, וקובע היציקה MIT-רחבה, רובוטיקה לרתום להרכיב מגוון של עיצובים למגוון רחב של לקוחות במהירות, שוב ושוב תוך שמירה על מאגר משותף של בסיסי DNA פרימיטיביים וטכנולוגיות הרכבה עבור הזמנות עתידיות.
אחד האתגרים הגדולים ביותר של מיכון התהליך של מכלול ה-DNA הוא הדור של הפקודות pipetting עבור המטפל נוזלי. אמנם ממשקי תוכנה עבור התקנים אלה בדרך כלל קל לשימוש, מורכבים pipetting הוראות כאלה הדרושים להרכבה DNA קומבינטורית דורשים המדען במפורש לציין כל וביופסיה, לוותר על הפקודה באופן ידני. זה יוצר שמכבידות בזרימת העבודה, ומשאיר את תהליך יצירת קובץ script לפגיע השגיאות pipetting אותו כאילו ההרכבה בוצעו באופן ידני. זה מצריך כלי תוכנה שיכולות להפוך כל החלקים של תהליך זה, מעיצוב הספרייה המכשיר, כדי לייצר את ההוראות pipetting, ולספק החוקר הכיוונונים צלחת/ריאגנט נדרש להרכיב אותם. בעבודה זו, אנו ממנפים את כלי התוכנה שלנו כדי להפוך לאוטומטי את העיצוב של ספרייה קטנה DNA קומבינטורית המכשיר, וכן ערבוב של ריאגנטים (מאגר מים, אנזימים) וחלקים דנ א (איור 1b) לתוך 96 סיר אחד מודולרי DNA מכלול התגובות. השימוש בכלי דורש ניסיון בתכנות מראש, היא מדרגית וגבוה תפוקת, ואת קומבינטורית כברירת מחדל. אנו מראים כי שיבוט תגובות שהוכנו בפלטפורמות שונות טיפול בנוזלים אוטומטית שני התשואה הנכונה תבדוק-רצף שיבוטים עם תדר דומה כדי תגובות שהוכנו באופן ידני (95%), ועם הפעם תרגולים באופן משמעותי פחות.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hardware / Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freedom EVO 150 Liquid Handling Robot</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td>Custom liquid handler fitted with an 8-channel pipetting arm 
			http://lifesciences.tecan.com/products/liquid_handling_and_robotics/freedom_evo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freedom EVOware Standard (Version 2.4 Service Pack 2)</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td>Software used to control the Freedom EVO 150 liquid handler 
			http://lifesciences.tecan.com/products/software/freedom_evoware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Echo 550</td>
			<td>Labcyte</td>
			<td></td>
			<td>Acoustic Liquid Dispenser 
			http://www.labcyte.com/products/liquidhandling/echo-550-liquid-handler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend RT</td>
			<td>Sorvall</td>
			<td></td>
			<td>Large benchtop swing-bucket sentrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MasterCycler Pro</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>950040015</td>
			<td>Thermocycler with 96-well heat block 
			https://online-shop.eppendorf.us/US-en/PCR-44553/Cyclers-44554/Mastercycler-pro-PF-5193.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECHOTHERM Chilling/Heating Dry Bath</td>
			<td>Torrey Pines Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Heating/Chilling block for EVO 150 deck 
			https://www.torreypinesscientific.com/products/chilling-and-heating-dry-baths/echotherm-ric20-series-remote-controlled-chillingheating-dr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop Microcentrifuge 5418</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5418000017</td>
			<td>Stardard 18-well microcentrifuge 
			https://online-shop.eppendorf.com/OC-en/Centrifugation-44533/Centrifuges-44534/Centrifuges-5418--5418R-PF-9257.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resources</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mocloassembly.com</td>
			<td>Lattice Automation</td>
			<td></td>
			<td>Web-tool for combinatorial DNA assembly 
			mocloassembly.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CIDAR MoClo Parts Kit</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>1000000059</td>
			<td>Kit of bacterial glycerol stocks for all DNA parts used in this study 
			https://www.addgene.org/cloning/moclo/densmore/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CIDAR ICE Registry</td>
			<td>CIDAR Lab</td>
			<td></td>
			<td>Registry of plasmid DNA maps 
			https://ice.cidarlab.org/folders/8 
			https://synbiohub.programmingbiology.org/public/bubdc_ice/bubdc_ice_folder_8/current</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labware</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 &#956;L Conductive Tips</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>30 057 818</td>
			<td>Sterile 50 &#956;L conductive tips for Tecan liquid handler 
			http://lifesciences.tecan.com/products/consumables/disposable_tips/liquid_handling_disposable_tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Deep 96-well Culture Plates</td>
			<td>USA Scinetific</td>
			<td>5678-0285</td>
			<td>Bacterial culture plates used for culturing of large numbers of samples 
			http://www.thermoscientific.com/en/product/nunc-1-3-2-0ml-deepwell-plates-shared-wall-technology.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>USA Scinetific</td>
			<td>1615-5599</td>
			<td>Disposable microcentrifuge tubes 
			http://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube-colors.aspx</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breathe Easier sealing membrane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z763624-100EA</td>
			<td>Breathable sealing membrane for bacterial culture plates 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/z763624?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Full-Skirted, Low-Profile, 96-Well PCR Plates</td>
			<td>GeneMate</td>
			<td>T-3183-2</td>
			<td>PCR plates used for all steps 
			https://www.bioexpress.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=T-3183-R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alluminum Sealing Foil for PCR Plates</td>
			<td>GeneMate</td>
			<td>T-2451-1</td>
			<td>Alluminum seals for PCR plate storage 
			https://www.bioexpress.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=T-2451-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyolefin Sealing Film for PCR Plates</td>
			<td>GeneMate</td>
			<td>T-2450-1</td>
			<td>Plastic seals for PCR plates during cycling 
			https://www.bioexpress.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=T-2450-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Cooler</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22510525</td>
			<td>96-well cold block 
			https://online-shop.eppendorf.us/US-en/Temperature-Control-and-Mixing-44518/Accessories-44520/PCR-Cooler-PF-55940.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenCatch Plasmid DNA Mini-Prep Kit</td>
			<td>Epoch Life Sciences</td>
			<td>2160250</td>
			<td>Plasmid DNA purification kit 
			http://www.epochlifescience.com/Product/PurificationKit/dna_mini.aspx</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase (HC)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M1794</td>
			<td>High concentration T4 DNA Ligase 
			https://www.promega.com/products/cloning-and-dna-markers/molecular-biology-enzymes-and-reagents/t4-dna-ligase/?catNum=M1794</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BbsI Restriction Enzyme</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0539L</td>
			<td>BbsI enzyme at 10,000 units/ml 
			https://www.neb.com/products/r0539-bbsi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsaI Restriction Enzyme</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0535L</td>
			<td>BsaI enzyme at 10,000 units/ml 
			https://www.neb.com/products/r3535-bsai-hf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase Buffer Pack</td>
			<td>Promega</td>
			<td>C1263</td>
			<td>10x T4 DNA ligase buffer 
			https://www.promega.com/products/cloning-and-dna-markers/cloning-tools-and-competent-cells/t4-dna-ligase/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-&#223;-D-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>I1001-25</td>
			<td>0.5M IPTG Solution 
			http://www.zymoresearch.com/buffers-solutions/chemicals/isopropyl-ss-d-thiogalactopyranoside-iptg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-bromo-4-chloro-3-indolyl &#223;-D-galactopyranoside (X-GAL)</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>X1001-25</td>
			<td>20 mg/ml X-GAL solution 
			http://www.zymoresearch.com/buffers-solutions/chemicals/5-bromo-4-chloro-3-indolyl-ss-d-galactopyranoside-x-gal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin Sulfate</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>A1003-25</td>
			<td>35 mg/ml Kanamycin solution 
			http://www.zymoresearch.com/buffers-solutions/antibiotics/kanamycin-sulfate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin (Disodium Salt)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP26481</td>
			<td>1 g Carbenicillin (Ampicillin analog) 
			https://www.fishersci.com/shop/products/carbenicillin-disodium-salt-fisher-bioreagents-3/p-25005#?keyword=carbenicillin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOC Broth Media</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>S0225</td>
			<td>Powder media used to make SOC broth 
			http://www.teknova.com/SOC-BROTH-MEDIA-p/s0225.htm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth (Lennox) Media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3022-1KG</td>
			<td>Powder media used to make LB broth 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l3022?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth with agar (Lennox) Media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2897-1KG</td>
			<td>LB with agar mix used for making solid media plates 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l2897?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha-Select Gold Efficiency Competent Cells</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-85027</td>
			<td>High efficiency chemically competent E. coli cells 
			http://www.bioline.com/us/alpha-select-gold-efficiency.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer VF</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-TGCCACCTGACGTCTAAGAA-3&#39; 
			Primers used for Sanger sequencing and colony PCRs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer VR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-ATTACCGCCTTTGAGTGAGC-3&#39; 
			Primers used for Sanger sequencing and colony PCRs</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated robotic liquid handling assembly of modular dna devices

ההתקדמות בטכניקות להרכבה מודולרית DNA אפשרו ביולוגים סינתטי לבחון באופן משמעותי יותר זמינים "עיצוב חלל" המיוצג על-ידי "התקני" שנוצר כמו שילובים של רכיבים גנטיים בודדים. אולם, הרכבה ידנית מספר כה גדול של התקנים היא אינטנסיבית, מועדת לטעויות, ויקר. קנה המידה של מחקר בביולוגיה סינתטית תחכום הגוברת מחייבת דרך יעילה, לשחזור כדי להכיל את התפוקה בקנה מידה גדול, מורכב וגבוה התקן הבנייה.
כאן, פרוטוקול האסיפה DNA בטכניקה סוג-IIS endonuclease ההגבלה מבוססת מודולרי שיבוט (MoClo) היא אוטומטית בפלטפורמות רובוטית נוזלי-טיפול שני. רובוטים אוטומטיים נוזל-טיפול דורשים זהירות, לעתים קרובות פעמים אופטימיזציה מייגע של פרמטרים pipetting של נוזלים של צמיגויות שונים (למשל אנזימים, ה-DNA, מים, מאגרי), כמו גם תכנות מפורש על מנת להבטיח שאיפה נכונה dispensing של ה-DNA חלקים, ריאגנטים. זה הופך את התסריט ידנית כותב עבור הרכבות מורכבים רק בעייתי כמערכת ה-DNA ידנית, מחייבת כלי תוכנה שיכולות להפוך קובץ script הדור. לשם כך, פיתחנו כלי תוכנה מבוססת אינטרנט, http://mocloassembly.com, ליצירת ספריות קומבינטורית של התקן ה-DNA של החלקים הבסיסיים של הדנ א, נטען כקבצי Genbank. אנו מספקים גישה לכלי, קובץ ייצוא של התוכנה שלנו המטפל נוזלי אשר כולל אופטימיזציה מחלקות נוזלי, מכשור מעבדתי פרמטרים ופריסת הסיפון. כל חלקי דנ א המשמש זמינים דרך Addgene, מפות דיגיטליות שלהם ובבוקינג ברישום קרח BDC אוניברסיטת בוסטון. יחד, רכיבים אלה מספקים בסיס עבור ארגונים אחרים להפוך לאוטומטי ניסויים שיבוט מודולרי ופרוטוקולים דומה.
אוטומטיות DNA הרכבה זרימת העבודה המוצגת כאן מאפשר ייצור הדיר, אוטומטית, תפוקה גבוהה של מכשירי ה-DNA, מפחיתה את הסיכון של טעות אנוש הנובעות pipetting ידנית חוזרות. רצף נתונים מראים הרכבה אוטומטית ה-DNA תגובות שנוצר מזרימת עבודה זו הם ~ 95% נכון, דורשת קצת כמו 4% על הידיים הרבה זמן, לעומת הכנת התגובה ידנית.

כאן אנחנו מדגימים מכלול מודולרי אוטומטי של התקנים 96 דנ א מחלקים שונים בסיסי הדנ א (איור 1b) באמצעות שתי פלטפורמות אוטומטית רובוטית טיפול בנוזלים. כל יחידה תעתיק הוא סידור ליניארי של יחצ ן, אתר קישור ribosomal, ג'ין תעתיק שליחות קטלנית, משובטים לתוך וקטור יעד ספציפי. טאס הם מרכיב מרכזי רבים מעגל גנטי הירארכי עיצובים28,29,30 , ולכן הם הוכחה הטבעי של המושג עבור גישה זו. . תבדוק-רצף שיבוטים יכולה להיות מושגת ~ 5 ימים מתחילתו ועד סופו, סקירה של זרימת העבודה הציג מוצג איור 1a.
באמצעות הכלי שתואר פרוטוקול, לכדנו שימושי לקביעת פלטפורמת הרכבה אופטימלית נתנו לי מספר מוגדר של תגובות שיבוט להיות שנוצר על-ידי המדען מספר מדדים. איור 2a מדגים השוואה בין זמני התגובה הרכבה על פני כל שלוש שיטות. זמן הביצוע הוא הזמן הכולל כדי להשלים את כל השלבים pipetting הדרושים להרכיב את ריאקציות 96, הכולל dispensing של כל חלקי דנ א, ריאגנטים. הפעם תרגולים מתייחס הזמן הכולל שבן אנוש היה מעורב באופן ידני את הכנת התגובות שיבוט או ההתקנה של התוכנה פועל המטפל נוזלי. איור 2b השוואת עלויות בין השיטות השונות. עלויות הציג לתגובה יחיד שהוכנו על ידי כל שיטה וכוללים את המחיר של אנזימים וטיפים פיפטה חד פעמיות, נתן את העוצמה הנמוכה תגובה טיפוסית (20 µL עבור המטפל נוזלי, µL 10 עבור 250 ידנית, nL עבור מתקן אקוסטית). שיבוטים יחיד של כל 96 תגובות עבור המטפל איך מכינים ערכות הן ידנית והן נוזלי היו רציף, עם תת-ערכה של 12 וסודרו על התגובות מתקן אקוסטית (איור 2 c). רצפים נכונים התקבלו 95% של ערכות המטפל ידנית ולא נוזלי 96. 83% קבוצת מדגם המשנה מנפק האקוסטי ' היו נכונים, אולם שתי התגובות האחרון נכשל להניב כל מושבות לבן, ככל הנראה בגלל ערבוב לא מספיקות של טיפות לאחר dispensing של ה-DNA, ריאגנטים הושלמה. איור דו-ממדי ממחיש את יעילות התגובה שיבוט, כפי שהיא נמדדת על ידי היחס של מושבות לבן למספר הכולל של מושבות, אשר דומות בין באופן ידני (94%) ותגובות נוזלי שהרכבת הנדלר (84 אחוזים). מעניין, כאשר קנה המידה את הווליום התגובה האחרונה עם מנפק אקוסטית, הבחנו מסומן יעילות התגובה כאשר תגובות הוכנו בעוצמות קטן מ- 1 µL (משלימה איור 1 & 2 טבלה משלימה). . זה עשוי בשל התאיידות במהלך התגובה thermocycling, אשר יכול לגרום לעליה בריכוז המלח בעקבות התגובות.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54703/54703fig1.jpg"> איור 1. אוטומטיות DNA התקן ספריית הרכבה זרימת עבודה. (א) סקירה כללית של זרימת העבודה ניסיוני המוצג בעבודה זו. (1) חוקרים להעלות קודם Genbank קבצים עבור כל חלקי דנ א & וקטורים היעד שהם רוצים להשתמש. (2) הבא, ה-DNA חלקים כדי להיכלל באסיפה ייבחרו. (3) כלי ואז יפיק בחירה מטפל נוזלי אוטומטיות, כמו גם מפות צלחת לסייע עם האוכלוסייה ידנית עם ה-DNA חלקים של האנזים mastermix. (4) באמצעות ה-DNA & צלחות ריאגנטים, כמו גם הבחירה שנוצר, חוקרים לבצע את מכלול התגובות שיבוט על המטפל נוזלי. (5) פעם אחת להשלים, התגובות טרנספורמציה, מצופה לניתוח במורד הזרם. (b) רשימה של DNA חלקים שימוש בעבודה זו. סך של היזמים שלוש, שלוש ribosomal מחייב אתרים, ארבעה קידוד רצף, ושימשו המחסל תעתיק אחד ליצור ספריית קומבינטורית טאס 96. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54703/54703fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54703/54703fig2.jpg"> באיור 2. השוואות בין שלוש שיטות הרכבה תגובה אחרת. (א) זמן התגובה ההתקנה עבור 96 תגובות התאספו באופן ידני, באמצעות מלווה נוזלי, ועל ידי מתקן אקוסטית. הרכבה ידנית לקח 2 h 10 דקות, אשר כולם הפעם תרגולים. המטפל נוזלי לקח כמות דומה של זמן (2 שעות 6 דקות) כדי לבצע את פקודות pipetting, אולם רק שבריר של אותה תקופה (5 דקות) היה על הידיים. מנפק אקוסטית ארכה פחות באופן משמעותי לביצוע העברות נוזלי (5 דקות), לקח זמן מינימלי על הידיים (5 דקות). (b) מחיר התגובה שיבוט יחיד עבור כל שיטת ההרכבה. מחיר זה כולל את העלות של אנזימים בשימוש, כמו גם עצות פיפטה. (ג) קביעת רצף תוצאות מושבות יחיד של כל 96 התאספו טאס. האחוז של שיבוטים הנכון היה מקביל לרוחב כל שיטות ההרכבה. שימו לב כי רק ערכת משנה (12) של ההרכבות מלא 96 השתנו מ מנפק אקוסטית הכין דגימות. שתי תגובות נכשלה תשואה בכל מושבות לבן, ככל הנראה בשל ערבוב לא מספיקות של הדנ א & אנזים mastermix טיפות ב OutputPlate. (ד) השוואה של שיבוט יעילות התגובה בין ידני נוזלי מוכן המטפל תגובות. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54703/54703fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
משלימה איור 1. התגובה היעילות פוחתת עם הפחתת נפח התגובה. התגובה היעילות ירידה ניכרת כאשר להצטמצם התגובה אחסון מתחת 1 µL. מגמה זו נתפסת עם שני הסופי DNA ריכוזים שונים; עם זאת, מדענים יכול לבחור להשתמש באמצעי אחסון קטן יותר כדי לחסוך בעלויות ריאגנט אם יכול להיות נסבל נמוכה יותר. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54703/Supplemental_Figure_1.pdf">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>
משלימה טבלה 1. שולחן של פרמטרי מחלקה נוזלי DNA ואנזים עבור אמצעי אחסון pipetting שונים. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54703/Supplemental_Table_1_V2.xlsx">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>
משלימה בטבלה 2. התגובה יעילות חישובים. מספרים CFU raw מקבלים 12 של 96 תגובות טרנספורמציה שהוכנו באופן ידני, דרך המטפל נוזלי. מספרים CFU ניתנים גם בדיקה של אמצעי אחסון קטן יותר תגובה סופית על מנפק אקוסטית. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54703/Supplemental_Table_2.xlsx">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices at JoVE.com

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

. הנה, זרימת עבודה אוטומטית לבצע הרכבה "התקן" DNA מודולרי, באמצעות שיטה מודולרית DNA שיבוט הרכבה על רובוטים נוזלי-טיפול מוצג. הפרוטוקול משתמשת כלי תוכנה אינטואיטיבית ליצירת רשימות המטפל נוזלי לדור קומבינטורית DNA התקן הספרייה, אשר נדגים באמצעות שתי פלטפורמות טיפול בנוזלים.

אוטומטית רובוטית טיפול בנוזלים הרכבה של התקנים DNA מודולרי

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

בשנת העצרת במבחנה של מכונת חצי מלאכותית מולקולרית השתמש שלה עבור איתור של נזק לדנ&quot;א

Naturally occurring bio-molecular machines work in every living cell and display a variety of designs 1-6. Yet the development of artificial molecular ...

High-throughput, Automated Extraction of DNA and RNA from Clinical Samples using TruTip Technology on Common Liquid Handling Robots

הפקת תפוקה גבוהה, אוטומטית של DNA ו-RNA מדגימות קליניות באמצעות הטכנולוגיה TruTip על רובוטים טיפול נוזל נפוצים

TruTip is a simple nucleic acid extraction  technology whereby a porous, monolithic binding matrix is inserted into a  pipette tip. The geometry of the ...

Rapid and Low-cost Prototyping of Medical Devices Using 3D Printed Molds for Liquid Injection Molding

דיגום מהיר ועלות נמוכה של מכשירים רפואיים באמצעות 3D מודפס תבניות להזרקת נוזלים

Biologically inert elastomers such as silicone are favorable materials for medical device fabrication, but forming and curing these elastomers using ...

Fabricating Cotton Analytical Devices

בודה כותנה התקנים אנליטית

A robust, low-cost analytical device should be user-friendly, rapid, and affordable. Such devices should also be able to operate with scarce samples and ...

Preparation of Monodomain Liquid Crystal Elastomers and Liquid Crystal Elastomer Nanocomposites

הכנת Monodomain Liquid Crystal אלסטומרים גביש נוזלי Nanocomposites אלסטומר

LCEs are shape-responsive materials with fully reversible shape change and potential applications in medicine, tissue engineering, artificial muscles, and ...

Rod-based Fabrication of Customizable Soft Robotic Pneumatic Gripper Devices for Delicate Tissue Manipulation

רוד מבוססי ייצור של מכשירים גריפר פניאומטיים רובוטית להתאמה אישית רך עבור מניפולציה רקמה עדינה

Soft compliant gripping is essential in delicate surgical manipulation for minimizing the risk of tissue grip damage caused by high stress concentrations ...

Automated Robotic Dispensing Technique for Surface Guidance and Bioprinting of Cells

טכניקת Dispensing רובוטיות אוטומטית להכוון משטחים Bioprinting של תאים

This manuscript describes the introduction of cell guidance features followed by the direct delivery of cells to these features in a hydrogel bioink using ...

Synthesis of Biocompatible Liquid Crystal Elastomer Foams as Cell Scaffolds for 3D Spatial Cell Cultures

סינתזה של ביולוגית Liquid Crystal אלסטומר קצף כמו פיגומים Cell עבור תא תרבויות מרחבי 3D

Here, we present a step-by-step preparation of a 3D, biodegradable, foam-like cell scaffold. These scaffolds were prepared by cross-linking star block ...

Optimizing the Use of a Liquid Handling Robot to Conduct a High Throughput Forward Chemical Genetics Screen of Arabidopsis thaliana

Optimizing the Use of a Liquid Handling Robot to Conduct a High Throughput Forward Chemical Genetics Screen of Arabidopsis thaliana

אופטימיזציה של השימוש של רובוט טיפול נוזלי לנהל גבוהה תפוקה קדימה כימי גנטיקה מסך של תודרנית לבנה

Chemical genetics is increasingly being employed to decode traits in plants that may be recalcitrant to traditional genetics due to gene redundancy or ...

Handling and Assessment of Human Primary Prostate Organoid Culture

הטיפול והערכה של התרבות האנושית תא צורב הערמונית ראשי

This paper describes a detailed protocol for three-dimensional (3D) culturing, handling, and evaluation of human primary prostate organoids. The process ...