Name: automated robotic liquid handling assembly of modular dna devices
Uploaded: 2017-12-01T14:00:00
Duration: 11 min 22 s
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हम इस पांडुलिपि के साथ मदद के लिए स्वप्निल भाटिया, ऐलेजैंड्रो Pelaez, और जॉनसन लाम कठपुतली परियोजना पर काम के लिए, साथ ही स्वाति कैरयर, Rachael स्मिथ, और थॉमस कोस्टा के लिए धन्यवाद । इस काम को NSF करियर अवार्ड #1253856 ने वित्तपोषित किया था. यह भी कंप्यूटिंग पुरस्कार #1522074 में NSF अभियानों द्वारा वित्त पोषित है ।

1. निर्दिष्ट भागों डीएनए डिवाइस पुस्तकालय में इस्तेमाल किया जा करने के लिए और उपयोगकर्ता उत्पंन/
<ol><li>किसी भी वेब ब्राउज़र का उपयोग करना, mocloassembly.com के लिए नेविगेट और सभी डीएनए भागों है कि मिश्रित डीएनए डिवाइस डिजाइन में शामिल किया जाएगा के लिए Genbank फ़ाइलें अपलोड करें ।</li>
	<li>एक बार सभी फ़ाइलों को अपलोड किया गया है, वांछित डीएनए भागों का चयन करें और उंहें खाली कैनवास पर खींचें, डीएनए भागों के उद्देश्य अंतिम क्रम में भाग प्रकार रखकर । नोट: भागों के संग्रह, साथ ही व्यक्तिगत भागों, चुना जा सकता है और कैनवास पर रखा । इसके अलावा, आदेश डीएनए भागों ऐसी है कि 5 ' और 3 ' प्रत्येक भाग मैच के लिए फांसी ।</li>
	<li>पृष्ठ के नीचे दाईं ओर ' इकट्ठे ' पर क्लिक करें । नोट: उपकरण केवल मान्य, बिल्ड करने योग्य असेंबली चार आधार युग्म पर आधारित BsaI एंजाइम के साथ पाचन पर प्रत्येक भाग पार्श्व हैंग हो जाएगा । यदि वैज्ञानिक द्वारा अपलोड किए गए भागों के आधार पर कोई निर्मित डीएनए डिवाइस मौजूद नहीं है, तो उपकरण यह संकेत देगा कि कोई असेंबली नहीं मिली ।</li>
	<li>
' योजनाओं ' टैब पर नेविगेट और उपकरण द्वारा उत्पंन फ़ाइलों को डाउनलोड करें । इन फ़ाइलों में शामिल होंगे:
	<ol>
<li>मानव-पठनीय प्लेट मैप्स वैज्ञानिक के लिए डीएनए नमूने तैयार करने के लिए, साथ ही प्रतिक्रियाओं के लिए आवश्यक एजेंट</li>
		<li>लिक्विड हैंडलर के लिए एक ' चयनसूची '</li>
		<li>सभी डीएनए उपकरणों के लिए पूरी तरह से व्याख्या Genbank फ़ाइलें इकट्ठे होने के लिए नोट: किसी भी नए labware तक पहुँचने पर लिक्विड हैंडलिंग आर्म पोजिशनिंग का परीक्षण किया जाना चाहिए. आवश्यक के रूप में X, Y, और Z अक्ष में pipetting arm पोजीशनिंग को समायोजित करने के लिए कैसे पर विस्तृत निर्देशों के लिए निर्माता के मैनुअल से परामर्श करें ।</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. विधानसभा के लिए प्लाज्मिड डीएनए और रिएजेंट तैयार करें [3 दिन]
<ol><li>[Day 1] एक बाँझ टीका पाश का उपयोग करना और एक खुली लौ के पास या एक लामिना प्रवाह हुड में काम कर, पौंड-आगर उपयुक्त एंटीबायोटिक के साथ पूरक प्लेटों पर बैक्टीरियल ग्लिसरॉल शेयरों बाहर लकीर. सभी आवश्यक डीएनए भागों के लिए यह सुनिश्चित करने के लिए हर नमूने के बीच पाश निष्फल । रात भर ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन प्लेट । नोट: फ्रोजन बैक्टीरियल ग्लिसरॉल स्टॉक्स बर्फ पर जितना संभव हो रखा जाना चाहिए । दोहराया फ्रीज-गल चक्र स्टॉक की व्यवहार्यता कम है और बचा जाना चाहिए ।</li>
	<li>[Day 2] एक बाँझ पिपेट टिप, दंर्तखोदनी, या टीका पाश का उपयोग करना, और एक खुली लौ के पास या एक लामिना प्रवाह हूड में काम कर, लगाना पौंड शोरबा के 3 मिलीलीटर (उचित एंटीबायोटिक के साथ पूरक) पौंड-आगर २.१ में तैयार प्लेटों से एक भी कॉलोनी के साथ । ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर संस्कृतियों जबकि ३०० RPM पर मिलाते हुए ।</li>
	<li>[Day 3] बैक्टीरियल संस्कृतियों से प्लाज्मिड डीएनए किसी भी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मिनी-तैयारी प्लाज्मिड शोधन किट का उपयोग कर शुद्ध ।</li>
	<li>प्रदान की MoClo_Setup. xlsx फ़ाइल का उपयोग कर, पानी या ते बफर में 20 fmol/µ एल की एकाग्रता के लिए प्लाज्मिड डीएनए के प्रत्येक नमूने पतला ।</li>
	<li>विधानसभा उपकरण द्वारा उत्पंन पीडीएफ फाइल के प्लेट मानचित्र के बाद, एक पूर्ण स्कर्ट ९६-अच्छी तरह से पीसीआर प्लेट पर उपयुक्त अच्छी तरह से प्रत्येक पतला डीएनए भाग के संकेत मात्रा जगह । बर्फ पर इस SetupPlate पकड़ो जब तक जरूरत है, या एक पन्नी चिपकने वाला सील और स्टोर के साथ सील-20 डिग्री सेल्सियस ।</li>
	<li>
बर्फ पर, निम्नलिखित घटकों के साथ प्रतिक्रिया mastermix तैयार: प्रत्येक 20 µ एल के लिए प्रतिक्रिया के 2 µ एल के लिए 10x टी-4 डीएनए ligase बफर, टी-4 डीएनए µ (कोर्ट) के ०.५ ligase एल, और µ एंजाइम के 1 BsaI एल जोड़ें. इस के साथ सहायता करने के लिए MoClo_Setup. xlsx फ़ाइल में कोई कैल्क्यूलेटर पत्रक शामिल है ।
	<ol>
<li>एक नया पूर्ण स्कर्ट ९६-अच्छी तरह से पीसीआर प्लेट के उपयुक्त कुओं में एंजाइम mastermix वितरित, उत्पंन पीडीएफ में ReagentPlate के लिए प्लेट नक्शे के बाद । बर्फ पर या एक ९६-अच्छी तरह से ठंडा ब्लॉक पर इस ReagentPlate रखो । नोट: ReagentPlate केवल जब तरल हैंडलर पर असेंबली चलाने के लिए तैयार होना चाहिए ।</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. तरल हैंडलर [चर] पर असेंबली स्क्रिप्ट निष्पादित करें
<ol><li>SetupPlate (ओं), ReagentPlate (ओं) (एक ९६-अच्छी तरह से ठंडा-ब्लॉक पर), और खाली पूर्ण स्कर्ट ९६-तरल हेंडलर के डेक पर अच्छी तरह से पीसीआर प्लेट की आवश्यक संख्या प्लेस । खाली थाली (ओं) OutputPlate (ओं) जहां प्रतिक्रियाओं इकट्ठे हो जाएगा ।</li>
	<li>प्रत्येक नमूना और एजेंट तैयार थाली के उदाहरण बनाने के द्वारा तरल हेंडलर नियंत्रण सॉफ्टवेयर तैयार है, उंहें ठीक नाम के रूप में वे प्लेट mocloassembly.com द्वारा उत्पंन साफ, पानी के गर्त सहित नक्शे पर प्रदर्शित सुनिश्चित करने के लेबल ' जलाशय '.</li>
	<li>नियंत्रण सॉफ्टवेयर में ' Worklist ' आदेश का उपयोग कर, हमारे सॉफ्टवेयर उपकरण द्वारा उत्पंन. gwl फ़ाइल लोड, एक और ' Worklist ' आदेश है जो. gwl पहले आदेश में भरी हुई फ़ाइल को अंजाम देगा के बाद ।</li>
	<li>नियंत्रक सॉफ्टवेयर ' भागो ' आदेश का उपयोग कर स्क्रिप्ट निष्पादित । नोट: हमेशा रोबोट तरल हैंडलर डेक स्थान तक पहुँचने का प्रयास करने से पहले एक स्क्रिप्ट के निष्पादन को पूरा करने के लिए अनुमति दें ।</li>
	<li>तरल हैंडलर डेक से सभी प्लेटों को निकालें । शेष डीएनए SetupPlate (ओं) को सील एल्यूमीनियम फिल्म सील और पर भंडारण से बचाया जा सकता है-20 ° c । OutputPlate सील चिपकने वाली फिल्म के साथ (ओं), एक thermocycler या गर्मी में जगह-ब्लॉक और निंनलिखित चक्र मापदंडों के साथ चलाने के लिए: के लिए ३७ ° c 2 ज, ५० ° c के लिए 5 मिनट, ८० ° c 10 मिनट के लिए, 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ नोट: एक बार प्रतिक्रिया thermocycling पूरा हो गया है, OutputPlate (ओं) में संग्रहित किया जा सकता है-20 ° c जब तक वे में तब्दील होने के लिए तैयार हैं ।</li>
</ol>4. प्रतिक्रियाओं को बदलने [1 दिन]
<ol><li>
गल सक्षम ई. कोलाई सेल aliquots की अपेक्षित संख्या बर्फ पर (10 µ एल प्रतिक्रिया) की जरूरत है । नोट: बाँझ बनाए रखने के लिए, निम्न चरणों का पालन एक खुली लौ के पास किया जाना चाहिए, या एक लामिना प्रवाह हुड के भीतर.<ol>
<li>जबकि कोशिकाएं गल रही हैं, पौंड-आगर प्लेट तैयार करें (उपयुक्त एंटीबायोटिक युक्त) pipetting ५० µ एल के ०.१ मीटर IPTG और ५० µ एल के 20 मिलीग्राम/एमएल एक्स-लड़की सतह पर । प्रतिक्रियाओं की एक बड़ी संख्या चढ़ाना अगर एक मास्टर मिश्रण बनाओ । कोट प्लेटें समान रूप से एक बाँझ कांच की छड़ या कांच के मोतियों का उपयोग कर और प्लेटें जीवाणुओं को चढ़ाना से पहले ३७ डिग्री सेल्सियस पर आराम करने के लिए कम से 15 मिनट के लिए अनुमति देते हैं । नोट: वैकल्पिक रूप से, जोड़ें IPTG और एक्स-लड़की तरल करने के लिए आगार से पहले प्लेटें डाल रहे हैं, पर 2 mM IPTG और ४० µ g/एमएल एक्स-लड़की अंतिम एकाग्रता । इन प्लेटों सीधे प्रकाश के एक्स के रूप में बाहर की दुकान-लड़की प्रकाश के प्रति संवेदनशील है ।</li>
	</ol>
</li>
	<li>बर्फ पर, एक नया ९६-well पीसीआर प्लेट में प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए सक्षम कोशिकाओं के 10 µ एल aliquot । यह बदलाव की थाली होगी ।</li>
	<li>जोड़ें 1-3 µ से प्रत्येक प्रतिक्रिया के एल OutputPlate (एस) के लिए इसी अच्छी तरह से परिवर्तन की थाली में और 5 मिनट के लिए बर्फ पर गर्मी ।</li>
	<li>30 एस के लिए ४२ डिग्री सेल्सियस पर एक thermocycler में चिपकने वाला फिल्म और गर्मी सदमे के साथ परिवर्तन प्लेट सील । फिर, तुरंत बर्फ पर प्लेट 2 मिनट के लिए जगह है ।</li>
	<li>परिवर्तन की थाली के एक ही कुओं के लिए, समाज मीडिया के १५० µ एल जोड़ने के लिए, एक एल्यूमीनियम चिपकने वाला सील के साथ सील, और ३७ डिग्री सेल्सियस पर गर्मी जबकि 1 hr के लिए ९०० RPM में मिलाते हुए ।</li>
	<li>प्लेट पौंड-आगर पर परिवर्तन प्लेट की एक अच्छी तरह से पूर्ण सामग्री प्लेट की सतह को समान रूप से कोट करने के लिए एक बाँझ कांच की छड़ या कांच के मोतियों का उपयोग कर शुू में तैयार प्लेटें । रात भर ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन प्लेट ।</li>
</ol>5. क्लोन सत्यापन [2 दिन]
<ol><li>
(उचित एंटीबायोटिक युक्त) पौंड शोरबा के १.५ मिलीलीटर के साथ एक या कई ९६-अच्छी तरह से गहरी संस्कृति ब्लॉकों तैयार करते हैं ।
	<ol>
<li>२.२ चरण के लिए इसी तरह, लगाना गहरी अच्छी तरह से संस्कृति ब्लॉक (एस) प्रत्येक पौंड-बदल प्रतिक्रियाओं की प्लेट से एक सफेद कालोनियों के साथ ।</li>
		<li>एक गैस के साथ संस्कृति ब्लॉक (ओं) सील पारगंय सील और ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर गर्मी जबकि ९०० RPM पर मिलाते हुए । नोट: मॉड्यूलर क्लोनिंग तकनीक नीले सफेद स्क्रीनिंग का इस्तेमाल करता है, तो सकारात्मक CFUs पौंड-आगर प्लेट पर सफेद दिखाई देगा, जबकि खाली गंतव्य वैक्टर नीला दिखाई देगा ।</li>
	</ol>
</li>
	<li>बैक्टीरियल संस्कृतियों से प्लाज्मिड डीएनए को अलग (के रूप में २.३ में) और क्लोन सत्यापित करने के लिए सैंज अनुक्रमण के लिए प्रस्तुत करते हैं ।</li>
</ol>

<ol>
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Densmore जाली स्वचालन के अध्यक्ष और सह संस्थापक है, Inc Timmons और McCarthy जाली कर्मचारी हैं । जाली सॉफ्टवेयर और सेवा वर्णित प्रक्रिया के कई के स्वचालन के लिए बनाता है ।

अंत में, पूर्ण डीएनए डिवाइस निर्माण प्रक्रिया के स्वचालन से, में-silico डिजाइन तरल हैंडलिंग के लिए, वर्तमान में मौजूदा प्रौद्योगिकी के साथ एक व्यवहार्य लक्ष्य है । सॉफ्टवेयर और आधुनिक रोबोटिक्स कार्यप्रवाह के निर्माण की अनुमति है कि लागत कुशल हैं, समय कुशल, और स्केलेबल, मैनुअल तरीके से भी अधिक लगातार प्रतिलिपि परिणाम का उत्पादन करते हुए । हालांकि स्वचालन हमेशा एक प्रोटोकॉल क्रियांवित करने के लिए सबसे अधिक लागत प्रभावी विकल्प नहीं हो सकता है, यह प्रयोगात्मक reproducibility में सुधार करता है और मूल्यवान शोधकर्ता समय को मुक्त कर देता है । हालांकि, इस्तेमाल किया हार्डवेयर पर निर्भर करता है, स्वचालन के उपयोग के लिए कभी भी लागत और निष्पादन के समय अच्छी तरह से नीचे क्या पारंपरिक मैनुअल तरीकों के माध्यम से प्राप्त कर सकते है ड्राइव कर सकते हैं । इसके अलावा, स्वचालन प्रोटोकॉल स्पष्ट रूप से एक औपचारिक रूप से तदर्थ, कारीगरी, और वास्तविक सबसे अच्छा अभ्यास आधारित प्रयोग को रोकने के तरीके में कब्जा । यहां मॉड्यूलर डीएनए उपकरणों की स्वचालित विधानसभा का प्रदर्शन किया है, और प्रोटोकॉल, इलेक्ट्रॉनिक फ़ाइलें, और शारीरिक डीएनए पाठक के लिए आवश्यक संसाधनों के लिए इन प्रदर्शन, और इसी तरह, अपने स्वयं के प्रयोगों पर प्रदान की जाती हैं । हम अपने उपकरण की उपलब्धता की उंमीद है, और इस प्रोटोकॉल के प्रकाशन के एक संसाधन के रूप में सेवा और डीएनए विधानसभा प्रक्रियाओं और तरल हैंडलिंग रोबोटिक्स के क्षेत्र में एक और अधिक पारदर्शी और सांप्रदायिक भविष्य की ओर क्षेत्र कदम होगा ।
स्वचालन हार्डवेयर की उपयोगिता काफी हद तक उस हार्डवेयर के विन्यास और क्षमताओं पर निर्भर है. उदाहरण के लिए, हमारे तरल हेंडलर अत्यधिक महाप्राण और आदेश वितरण के लिए प्रणाली द्रव विस्थापन का उपयोग करता है । पिस्टन कि प्रणाली तरल पदार्थ ड्राइव अपेक्षाकृत बड़े है 1 मिलीलीटर सीरिंज जो, जबकि मात्रा की एक सीमा के लिए उपयोगी, एक 2 µ एल रिएजेंट के सही वितरण के लिए कम सीमा लगाता है । एक परिणाम के रूप में, हम क्लोनिंग प्रतिक्रियाओं की कुल मात्रा 20 µ एल के लिए तरल हेंडलर पर स्थापित किया, के बाद से हर वितरण आदेश के लिए ≥ 2 µ एल की जरूरत है । यह प्रभावी ढंग से तरल हेंडलर के लिए प्रतिक्रिया प्रति लागत दोगुनी-prepped प्रतिक्रियाओं, लेकिन हाथों की राशि समय पर उन प्रतिक्रियाओं को निष्पादित करने की आवश्यकता काफी कम था । एक इस मुद्दे को संबोधित करने के प्रयास में, हम एक ध्वनिक तरल मशीन पर सभी ९६ प्रतिक्रियाओं के लिए प्रतिक्रिया सेटअप दोहराया । इस उपकरण के लिए ध्वनि ऊर्जा का उपयोग करता है सीधे एक थाली से दूसरे के लिए द्रव वितरण, और वितरण मात्रा को प्राप्त कर सकते है (२.५ nL) क्या मानक वायु विस्थापन के साथ संभव है आधारित मैनुअल पिपेट । इस उपकरण का उपयोग करना, हम 10 µ एल की मैन्युअल रूप से तैयार प्रतिक्रियाओं की तुलना में २५० nL, एक ४० गुना कटौती करने के लिए हमारी प्रतिक्रियाओं की कुल मात्रा नीचे पैमाने करने में सक्षम थे छोटी मात्रा में तिरस्कृत, और pipetting चरणों के बीच टिप परिवर्तन की कमी के कारण, ध्वनिक मशीन समय के एक अंश में एक ही ९६ प्रतिक्रियाओं उत्पन्न करने में सक्षम था (< 5 min). छोटे प्रतिक्रिया की मात्रा भी व्यर्थ एजेंट पर बचाने के लिए, क्योंकि हम आम तौर पर केवल 1-3 µ प्रतिक्रिया के एल बदलने । कहा जा रहा है, स्वचालन हार्डवेयर का उपयोग, सहज ज्ञान युक्त सॉफ्टवेयर के साथ संयोजन के रूप में, डीएनए विधानसभा प्रतिक्रियाओं की बड़ी संख्या की पीढ़ी एक बहुत व्यापक अकादमिक दर्शकों के लिए सुलभ बना सकते हैं.
यहां, हम अपने सॉफ्टवेयर उपकरण की उपयोगिता का प्रदर्शन, लेकिन वहां सुविधाओं जो इसकी उपयोगिता को व्यापक बनाने में मदद मिलेगी की एक संख्या हैं । सबसे पहले, हर बार उपकरण एक मिश्रित विधानसभा उत्पंन करने के लिए प्रयोग किया जाता है, नए डीएनए भाग प्लेटें उत्पंन किया जाना चाहिए, वैज्ञानिक की आवश्यकता को मैंयुअल रूप से हर विधानसभा चलाने के लिए इन प्लेटों आबाद । यह मददगार होगा, बजाय अगर वैज्ञानिक एक डीएनए थाली में भागों का स्थान निर्दिष्ट करने के लिए विधानसभा में इस्तेमाल किया जा सकता है । यह उच्च प्रवाह प्लाज्मिड डीएनए शोधन किट के उपयोग के बाद से शोधकर्ताओं CIDAR MoClo पुस्तकालय की तरह एक किट से संस्कृतियों लगाना सकता है, और सभी नमूनों को एक साथ शुद्ध जबकि प्रत्येक किट में निर्दिष्ट भाग के अच्छी तरह से स्थान को बनाए रखने की अनुमति होगी । दूसरा, उपकरण वर्तमान में केवल ९६ के उपयोग का समर्थन करता है-अच्छी तरह से प्लेटें । बड़ी परियोजनाओं के लिए जहां कई सौ डीएनए उपकरणों की जरूरत है बनाया, डीएनए की संख्या, रिएजेंट, और गंतव्य प्लेटों तरल हेंडलर की डेक क्षमता से अधिक हो सकता है । यह समस्या हो सकती है, कम से आंशिक रूप से, उच्च घनत्व प्लेट प्रारूपों (३८४ या १५३६-well) के लिए समर्थन द्वारा समाप्त । अंत में, उपकरण वर्तमान में केवल तरल हेंडलर और डीएनए विधानसभा रणनीति का एक प्रकार का समर्थन करता है । हालांकि यह अपेक्षाकृत आसान है उपकरण को बदलने के लिए एक ध्वनिक औषधि प्रारूप स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए तरल हेंडलर निर्देश का उत्पादन, हम कई अलग तरल संचालकों जो बहुत इसके लागू व्यापक होगा, के लिए देशी समर्थन का विस्तार आशा के रूप में गिब्सन विधानसभा31की तरह अंय आम डीएनए विधानसभा तकनीकों के साथ संगतता होगा ।
इस स्वचालित विधानसभा पारिस्थितिकी तंत्र का एक महत्वपूर्ण हिस्सा सॉफ्टवेयर उपकरण का एक सेट है कि स्वचालन अनुकूल प्रोटोकॉल है कि स्पष्ट रूप से तरल हैंडलिंग रोबोट पर चलने के लिए निर्धारित कर रहे है में उच्च स्तरीय विधानसभा योजनाओं का अनुवाद है । हालांकि सॉफ्टवेयर उपकरण के एक नंबर मौजूद है कि शोधकर्ताओं ने Benchling, MoClo नियोजक, और रेवेन३२सहित silico में विधानसभाओं डिजाइन करने की अनुमति है, कुछ निष्पादन योग्य निर्देश में उन डिजाइनों अनुवाद करने के लिए एक तरल पर चलाने की क्षमता है हैंडलर. कि अंत करने के लिए, पीआर-पीआर स्वचालन और कठपुतली३३,३४,३५ के रूप में काम करने के लिए इन उपकरणों को उपलब्ध कराना शुरू कर दिया है । इसके अलावा, वाणिज्यिक इस क्षेत्र में काम कर रहे संस्थाओं को "क्लाउड लैब्स" जो स्वचालन के माध्यम से अंत उपयोगकर्ताओं के बड़े समूहों के लिए प्रयोगात्मक सेवाएं प्रदान शुरू करने के तरीके देख रहे हैं । इस पत्र में उल्लिखित प्रोटोकॉल इन प्रयासों में से किसी के एक टुकड़े के रूप में सेवा कर सकते है बशर्ते वे एक सेवा के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं ।
जबकि डीएनए उपकरणों के स्वचालित विधानसभा सिंथेटिक जीव विज्ञान के लिए तत्काल और स्पष्ट मूल्य की है, हमारे प्रोटोकॉल के रूप में अच्छी तरह से आणविक जीव के बड़े समुदाय के लिए उपयोगी है । डीएनए विधानसभा स्वचालित ज्ञात की बड़ी संख्या की अनुमति देता है, लेकिन इसी तरह, आनुवंशिक उपकरणों समानांतर में बनाया जा सकता है और दवा विकास के अध्ययन में स्क्रीनिंग और परीक्षण प्रयोजनों के लिए अभिव्यक्ति पुस्तकालयों के तेजी से संश्लेषण को सक्षम कर सकते हैं । हमें उंमीद है कि हमारे सॉफ्टवेयर उपकरण बड़ा मिश्रित आधारित डीएनए विधानसभा के प्रयासों को और अधिक सुलभ बनाना होगा, और दोनों सिंथेटिक जीव विज्ञान के लिए एक उपयोगी संसाधन के रूप में सेवा, साथ ही बड़े शैक्षणिक समुदाय ।

इस तरह के कोलिंस के रूप में जल्द सिंथेटिक जैविक आनुवंशिक उपकरणों टॉगल स्विच1 और Elowitz repressilator2 का प्रदर्शन किया है कि जैविक प्रणालियों के लिए विशिष्ट है, नियतात्मक कार्यों इंजीनियर हो सकता है । तब से, सिंथेटिक जीव के लिए जैव-भौतिक3,4,5,6की सेवा में उत्तरोत्तर अधिक जटिल कार्यक्षमता बाहर ले प्रणालियों के लिए रहने वाले इंजीनियर के लिए प्रयासरत है 7,8, और संवेदन आवेदन9,10,11. विशिष्ट कार्यशीलता के साथ "उपकरणों" में मॉड्यूलर डीएनए "भागों" संयोजन के माध्यम से इन आवेदनों को प्राप्त करने सिंथेटिक जीव विज्ञान के प्रमुख लक्ष्यों में से एक रहा है । इस प्रक्रिया के लिए पैमाने पर, वहां एक तकनीक है कि एक समय में भागों के बड़े पुस्तकालयों से जटिल उपकरणों के निर्माण, कुशल लागत कुशल, और सबसे महत्वपूर्ण बात, प्रतिलिपि तरीके की अनुमति देता होना चाहिए ।
इस तरह के एक विशाल विधानसभा प्रक्रिया वारंट है क्योंकि वर्तमान में क्षेत्र सफल जैविक प्रणाली डिजाइन और संरचना मार्गदर्शक नियमों की पूरी समझ का अभाव है । यह अपर्याप्त विशेषता डीएनए भागों12, संगतता और भागों13के composability की कमी, और अप्रत्याशित, सिंथेटिक उपकरणों के भीतर आनुवंशिक घटकों के बीच14अवांछनीय बातचीत से बढ़ा है, 15. विश्वसनीय अनुमानित मॉडलिंग के अभाव में, कार्यात्मक सिंथेटिक जेनेटिक उपकरणों परीक्षण और त्रुटि है, जो दसियों, या भी सैकड़ों की मांग, एक इरादा डिवाइस के इनपुट-आउटपुट सिग्नल की शक्ति वेरिएंट के द्वारा पर आ रहे हैं और "सर्वश्रेष्ठ" 16बहाव तत्वों के साथ संरचना के लिए चुना जाता है । जबकि आधुनिक मानकीकृत डीएनए इस तरह के गोल्डन गेट17के रूप में विधानसभा तरीकों, और मॉड्यूलर क्लोनिंग18,19,20 इस प्रक्रिया को आसान बनाने के लिए, एक प्रयोगात्मक विशेषज्ञ अभी भी प्रत्येक प्रोटोकॉल प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक है । सिंथेटिक उपकरणों के आकार और जटिलता में वृद्धि के रूप में, कुल उपलब्ध डिजाइन अंतरिक्ष का निर्माण और मैंयुअल रूप से परीक्षण के लिए बहुत बड़ा हो जाएगा21, और प्रक्रिया किसी भी महत्वपूर्ण प्रगति जो क्षेत्र में किया जा replicable है के लिए भी कारीगरी होगी ।
इस तरह के iGEM भागों रजिस्ट्री (http://partsregistry.org) के रूप में सिंथेटिक जीव विज्ञान और जैविक भाग खजाने के आगमन तक, Composable तत्वों की JBEI सूची22, और SynBioHub23, आनुवंशिक भागों में संग्रहीत नहीं किया गया किसी भी मानकीकृत विधानसभा प्रारूप । केवल परियोजना के प्रति क्लोन किया जा करने के लिए आवश्यक भागों की एक छोटी सी मुट्ठी भर है, और इस प्रकार, किया क्लोनिंग की मात्रा छोटा था, और एक इकट्ठे डिवाइस की प्राप्ति प्राप्त और तुच्छ वास्तविक अनुसंधान उद्देश्यों की तुलना में था । आणविक क्लोनिंग अक्सर तदर्थ था और प्रतिबंध साइट और endonuclease उपलब्धता के बजाय किसी भी मानकीकृत प्रक्रिया का पालन पर आधारित प्रतिबंध डाइजेस्ट का उपयोग कर प्रदर्शन किया । मानकीकरण की कमी यह किसी भी क्लोनिंग प्रोटोकॉल को स्वचालित करने के रूप में यह संभावना नहीं है कि अगले क्लोनिंग प्रतिक्रिया एक समान प्रोटोकॉल का पालन करेंगे अव्यावहारिक बना दिया । इसके अलावा, डीएनए विधानसभा स्वचालित उपकरणों में महत्वपूर्ण मौद्रिक निवेश की आवश्यकता (तरल हैंडलिंग रोबोट और उनके संबद्ध सॉफ्टवेयर और labware बुनियादी ढांचे) के रूप में अच्छी तरह के रूप में निर्देश की पीढ़ी के लिए समय निवेश के लिए सही विकसित तरल पदार्थ के विभिंन वर्गों से निपटने के लिए पैरामीटर्स संसाधित किया जा रहा है और इन प्रोटोकॉल को चलाने के लिए निर्देशों की सटीक श्रृंखला । छोटे पैमाने पर क्लोनिंग के प्रयासों ने इन खर्चों का औचित्य नहीं समझा. बड़ा, अधिक जटिल आनुवंशिक डिवाइस मानकीकृत विधानसभा प्रोटोकॉल के साथ युग्मित डिजाइन के संयोजन24,25 एक वातावरण बनाता है जहां इन प्रक्रियाओं के स्वचालन बहुत व्यावहारिक है । Opentrons OT की तरह कम लागत रोबोटिक्स-एक26 भी उभर रहे है जो भी मामूली प्रयोगशालाओं वित्त पोषित करने के लिए इस तकनीक का उपयोग की अनुमति देता है । इसके अलावा, "बादल" प्रयोगशालाओं27 सहित प्रतिलेखनीय और पन्ना बादल लैब के रूप में के रूप में अच्छी तरह से शैक्षिक "biofoundries" इस तरह के रूप में एडिनबर्ग जीनोम फाउंड्री, UIUC iBioFab, और एमआईटी-व्यापक फाउंड्री, दोहन रोबोटिक्स डिजाइन के विविध सेट को इकट्ठा करने के लिए ग्राहकों की एक किस्म के लिए जल्दी और बार-समय बुनियादी डीएनए आदिमयों और भविष्य के आदेश के लिए विधानसभा प्रौद्योगिकियों के एक आम भंडार बनाए रखने ।
डीएनए विधानसभा की प्रक्रिया को स्वचालित में सबसे बड़ी चुनौतियों में से एक है तरल हेंडलर के लिए pipetting आज्ञाओं की पीढ़ी । हालांकि इन उपकरणों के लिए सॉफ्टवेयर इंटरफेस आम तौर पर उपयोग करने के लिए आसान कर रहे हैं, मिश्रित डीएनए विधानसभा के लिए आवश्यक उन जैसे जटिल pipetting निर्देश वैज्ञानिक स्पष्ट रूप से प्रत्येक महाप्राण निर्दिष्ट करने और आदेश मैन्युअल रूप से वितरित करने की आवश्यकता. यह कार्यप्रवाह में एक बड़ी अड़चन पैदा करता है, और स्क्रिप्ट पीढ़ी की प्रक्रिया को एक ही pipetting त्रुटियों को कमजोर पत्तियों के रूप में अगर विधानसभा मैंयुअल रूप से किया गया । इस आवश्यक एक सॉफ्टवेयर उपकरण है कि इस प्रक्रिया के सभी भागों को स्वचालित कर सकते हैं, डिवाइस लाइब्रेरी डिजाइनिंग से, pipetting निर्देश पैदा करने के लिए, और प्लेट/एजेंट के साथ शोधकर्ता प्रदान करने के लिए उंहें इकट्ठा करने की आवश्यकता setups । इस काम में, हम एक छोटे मिश्रित डीएनए डिवाइस पुस्तकालय के डिजाइन को स्वचालित करने के लिए हमारे सॉफ्टवेयर उपकरण का लाभ उठाने, साथ ही साथ रिएजेंट के मिश्रण (बफर, पानी, एंजाइमों) और डीएनए भागों (आंकड़ा 1b) में ९६ १-पॉट मॉड्यूलर डीएनए विधानसभा प्रतिक्रियाओं. उपकरण का उपयोग कोई पूर्व प्रोग्रामिंग अनुभव की आवश्यकता है, स्केलेबल और उच्च प्रवाह है, और डिफ़ॉल्ट रूप से मिश्रित । हम बताते है कि क्लोनिंग दो अलग स्वचालित तरल हैंडलिंग प्लेटफार्मों पर तैयार प्रतिक्रियाओं को मैन्युअल रूप से तैयार प्रतिक्रियाओं को तुलनीय आवृत्ति के साथ सही अनुक्रम सत्यापित क्लोन उपज (९५%), और काफी कम हाथ समय पर के साथ ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hardware / Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freedom EVO 150 Liquid Handling Robot</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td>Custom liquid handler fitted with an 8-channel pipetting arm 
			http://lifesciences.tecan.com/products/liquid_handling_and_robotics/freedom_evo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freedom EVOware Standard (Version 2.4 Service Pack 2)</td>
			<td>Tecan</td>
			<td></td>
			<td>Software used to control the Freedom EVO 150 liquid handler 
			http://lifesciences.tecan.com/products/software/freedom_evoware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Echo 550</td>
			<td>Labcyte</td>
			<td></td>
			<td>Acoustic Liquid Dispenser 
			http://www.labcyte.com/products/liquidhandling/echo-550-liquid-handler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend RT</td>
			<td>Sorvall</td>
			<td></td>
			<td>Large benchtop swing-bucket sentrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MasterCycler Pro</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>950040015</td>
			<td>Thermocycler with 96-well heat block 
			https://online-shop.eppendorf.us/US-en/PCR-44553/Cyclers-44554/Mastercycler-pro-PF-5193.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECHOTHERM Chilling/Heating Dry Bath</td>
			<td>Torrey Pines Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Heating/Chilling block for EVO 150 deck 
			https://www.torreypinesscientific.com/products/chilling-and-heating-dry-baths/echotherm-ric20-series-remote-controlled-chillingheating-dr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop Microcentrifuge 5418</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5418000017</td>
			<td>Stardard 18-well microcentrifuge 
			https://online-shop.eppendorf.com/OC-en/Centrifugation-44533/Centrifuges-44534/Centrifuges-5418--5418R-PF-9257.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resources</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mocloassembly.com</td>
			<td>Lattice Automation</td>
			<td></td>
			<td>Web-tool for combinatorial DNA assembly 
			mocloassembly.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CIDAR MoClo Parts Kit</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>1000000059</td>
			<td>Kit of bacterial glycerol stocks for all DNA parts used in this study 
			https://www.addgene.org/cloning/moclo/densmore/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CIDAR ICE Registry</td>
			<td>CIDAR Lab</td>
			<td></td>
			<td>Registry of plasmid DNA maps 
			https://ice.cidarlab.org/folders/8 
			https://synbiohub.programmingbiology.org/public/bubdc_ice/bubdc_ice_folder_8/current</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labware</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 &#956;L Conductive Tips</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>30 057 818</td>
			<td>Sterile 50 &#956;L conductive tips for Tecan liquid handler 
			http://lifesciences.tecan.com/products/consumables/disposable_tips/liquid_handling_disposable_tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Deep 96-well Culture Plates</td>
			<td>USA Scinetific</td>
			<td>5678-0285</td>
			<td>Bacterial culture plates used for culturing of large numbers of samples 
			http://www.thermoscientific.com/en/product/nunc-1-3-2-0ml-deepwell-plates-shared-wall-technology.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>USA Scinetific</td>
			<td>1615-5599</td>
			<td>Disposable microcentrifuge tubes 
			http://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube-colors.aspx</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breathe Easier sealing membrane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z763624-100EA</td>
			<td>Breathable sealing membrane for bacterial culture plates 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/z763624?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Full-Skirted, Low-Profile, 96-Well PCR Plates</td>
			<td>GeneMate</td>
			<td>T-3183-2</td>
			<td>PCR plates used for all steps 
			https://www.bioexpress.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=T-3183-R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alluminum Sealing Foil for PCR Plates</td>
			<td>GeneMate</td>
			<td>T-2451-1</td>
			<td>Alluminum seals for PCR plate storage 
			https://www.bioexpress.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=T-2451-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyolefin Sealing Film for PCR Plates</td>
			<td>GeneMate</td>
			<td>T-2450-1</td>
			<td>Plastic seals for PCR plates during cycling 
			https://www.bioexpress.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=T-2450-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Cooler</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22510525</td>
			<td>96-well cold block 
			https://online-shop.eppendorf.us/US-en/Temperature-Control-and-Mixing-44518/Accessories-44520/PCR-Cooler-PF-55940.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GenCatch Plasmid DNA Mini-Prep Kit</td>
			<td>Epoch Life Sciences</td>
			<td>2160250</td>
			<td>Plasmid DNA purification kit 
			http://www.epochlifescience.com/Product/PurificationKit/dna_mini.aspx</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase (HC)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M1794</td>
			<td>High concentration T4 DNA Ligase 
			https://www.promega.com/products/cloning-and-dna-markers/molecular-biology-enzymes-and-reagents/t4-dna-ligase/?catNum=M1794</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BbsI Restriction Enzyme</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0539L</td>
			<td>BbsI enzyme at 10,000 units/ml 
			https://www.neb.com/products/r0539-bbsi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BsaI Restriction Enzyme</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0535L</td>
			<td>BsaI enzyme at 10,000 units/ml 
			https://www.neb.com/products/r3535-bsai-hf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase Buffer Pack</td>
			<td>Promega</td>
			<td>C1263</td>
			<td>10x T4 DNA ligase buffer 
			https://www.promega.com/products/cloning-and-dna-markers/cloning-tools-and-competent-cells/t4-dna-ligase/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-&#223;-D-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>I1001-25</td>
			<td>0.5M IPTG Solution 
			http://www.zymoresearch.com/buffers-solutions/chemicals/isopropyl-ss-d-thiogalactopyranoside-iptg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-bromo-4-chloro-3-indolyl &#223;-D-galactopyranoside (X-GAL)</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>X1001-25</td>
			<td>20 mg/ml X-GAL solution 
			http://www.zymoresearch.com/buffers-solutions/chemicals/5-bromo-4-chloro-3-indolyl-ss-d-galactopyranoside-x-gal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin Sulfate</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>A1003-25</td>
			<td>35 mg/ml Kanamycin solution 
			http://www.zymoresearch.com/buffers-solutions/antibiotics/kanamycin-sulfate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin (Disodium Salt)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP26481</td>
			<td>1 g Carbenicillin (Ampicillin analog) 
			https://www.fishersci.com/shop/products/carbenicillin-disodium-salt-fisher-bioreagents-3/p-25005#?keyword=carbenicillin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOC Broth Media</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>S0225</td>
			<td>Powder media used to make SOC broth 
			http://www.teknova.com/SOC-BROTH-MEDIA-p/s0225.htm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth (Lennox) Media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3022-1KG</td>
			<td>Powder media used to make LB broth 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l3022?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth with agar (Lennox) Media</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2897-1KG</td>
			<td>LB with agar mix used for making solid media plates 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l2897?lang=en&#38;region=US</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha-Select Gold Efficiency Competent Cells</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-85027</td>
			<td>High efficiency chemically competent E. coli cells 
			http://www.bioline.com/us/alpha-select-gold-efficiency.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer VF</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-TGCCACCTGACGTCTAAGAA-3&#39; 
			Primers used for Sanger sequencing and colony PCRs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer VR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-ATTACCGCCTTTGAGTGAGC-3&#39; 
			Primers used for Sanger sequencing and colony PCRs</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated robotic liquid handling assembly of modular dna devices

मॉड्यूलर डीएनए विधानसभा तकनीक में हाल ही में अग्रिमों सिंथेटिक जीव के लिए उपलब्ध "डिजाइन अंतरिक्ष" "उपकरणों" व्यक्तिगत आनुवंशिक घटकों के संयोजन के रूप में बनाया द्वारा प्रतिनिधित्व की काफी अधिक परीक्षण सक्षम है । हालांकि, उपकरणों की इतनी बड़ी संख्या के मैनुअल विधानसभा समय गहन, त्रुटि प्रवण, और महंगा है । बढ़ती परिष्कार और सिंथेटिक जीव विज्ञान अनुसंधान के पैमाने आवश्यक एक कुशल, प्रतिलिपि के लिए बड़े पैमाने पर समायोजित करने के लिए रास्ता, जटिल, और उच्च प्रवाह डिवाइस निर्माण ।
यहां, एक डीएनए असेंबली प्रोटोकॉल प्रकार-IIS प्रतिबंध endonuclease आधारित मॉड्यूलर क्लोनिंग (MoClo) तकनीक का उपयोग कर दो तरल पर स्वचालित है रोबोट प्लेटफार्मों से निपटने । स्वचालित तरल हैंडलिंग रोबोटों सावधान, अक्सर बार विभिंन viscosities के तरल पदार्थ के लिए pipetting मापदंडों के थकाऊ अनुकूलन (जैसे एंजाइमों, डीएनए, पानी, बफर), के रूप में के रूप में अच्छी तरह से स्पष्ट प्रोग्रामिंग सही आकांक्षा और वितरण सुनिश्चित करने की आवश्यकता डीएनए भागों और रिएजेंटों की । इस मैनुअल स्क्रिप्ट सिर्फ मैनुअल डीएनए विधानसभा के रूप में समस्याग्रस्त के रूप में जटिल विधानसभाओं के लिए लेखन, और आवश्यक एक सॉफ्टवेयर उपकरण है कि स्क्रिप्ट पीढ़ी को स्वचालित कर सकते है बनाता है । इस अंत करने के लिए, हम बुनियादी डीएनए Genbank फ़ाइलों के रूप में अपलोड भागों से मिश्रित डीएनए डिवाइस पुस्तकालयों पैदा करने के लिए एक वेब आधारित सॉफ्टवेयर उपकरण, http://mocloassembly.com, विकसित किया है । हम उपकरण के लिए उपयोग प्रदान करते हैं, और हमारे तरल हेंडलर सॉफ्टवेयर है जो तरल कक्षाएं, labware मानकों, और डेक लेआउट अनुकूलित शामिल है से एक निर्यात फ़ाइल । सभी डीएनए इस्तेमाल किया भागों Addgene के माध्यम से उपलब्ध हैं, और उनके डिजिटल नक्शे बोस्टन विश्वविद्यालय BDC बर्फ रजिस्ट्री के माध्यम से पहुंचा जा सकता है । साथ में, इन तत्वों को अंय संगठनों के लिए एक नींव मॉड्यूलर क्लोनिंग प्रयोगों और इसी तरह के प्रोटोकॉल को स्वचालित प्रदान करते हैं ।
स्वचालित डीएनए विधानसभा कार्यप्रवाह यहां प्रस्तुत दोहराया, स्वचालित, डीएनए उपकरणों के उच्च प्रवाह उत्पादन में सक्षम बनाता है, और मानव दोहराए मैनुअल pipetting से उत्पंन होने वाली त्रुटि के जोखिम को कम कर देता है । sequencing डेटा स्वचालित डीएनए विधानसभा प्रतिक्रियाओं इस कार्यप्रवाह से उत्पंन दिखा रहे है ~ ९५% सही है और के रूप में कम के रूप में 4% के रूप में ज्यादा हाथ समय पर, मैनुअल प्रतिक्रिया तैयारी की तुलना में की आवश्यकता होती है ।

यहां हम विभिंन बुनियादी डीएनए भागों से ९६ डीएनए उपकरणों की स्वचालित मॉड्यूलर विधानसभा का प्रदर्शन (आंकड़ा 1b) दो स्वचालित रोबोटिक तरल हैंडलिंग प्लेटफार्मों का उपयोग कर । प्रत्येक transcriptional इकाई प्रवर्तक, राइबोसोमल बंधन साइट, जीन, और transcriptional टर्मिनेटर, एक विशिष्ट गंतव्य वेक्टर में क्लोन की एक रैखिक व्यवस्था है । तूस कई पदानुक्रमित आनुवंशिक सर्किट डिजाइन28,29,30 में एक महत्वपूर्ण घटक है और इसलिए इस दृष्टिकोण के लिए अवधारणा का एक प्राकृतिक सबूत हैं । अनुक्रम सत्यापित क्लोन शुरू से समाप्त करने के लिए ~ 5 दिनों में प्राप्त किया जा सकता है, और प्रस्तुत कार्यप्रवाह का एक सिंहावलोकन चित्र 1aमें प्रस्तुत किया जाता है ।
वर्णित उपकरण और प्रोटोकॉल का उपयोग कर, हम कई इष्टतम विधानसभा क्लोनिंग प्रतिक्रियाओं की एक परिभाषित संख्या को देखते हुए मंच का निर्धारण करने में उपयोगी मैट्रिक्स पर कब्जा कर लिया वैज्ञानिक द्वारा उत्पंन किया जाएगा । चित्र 2a सभी तीन मोडलों में प्रतिक्रिया असेंबली बार के बीच तुलना दिखाता है । निष्पादन समय ९६ प्रतिक्रियाओं को इकट्ठा करने के लिए आवश्यक सभी pipetting चरणों को पूरा करने के लिए कुल समय है, जिसमें सभी डीएनए भागों और रिएजेंटों का वितरण शामिल है । हाथ पर समय कुल समय एक मानव मैन्युअल क्लोनिंग प्रतिक्रियाओं की तैयारी में शामिल किया गया था करने के लिए संदर्भित करता है, या तरल हैंडलर चल रहे सॉफ्टवेयर का सेटअप. चित्र b विभिंन पद्धतियों के बीच लागत की तुलना करता है । प्रस्तुत लागत एक एक विधि द्वारा तैयार प्रतिक्रिया के लिए कर रहे है और एंजाइमों और प्रयोज्य पिपेट युक्तियों की कीमत शामिल हैं, सबसे कम ठेठ प्रतिक्रिया की मात्रा (तरल हेंडलर के लिए 20 µ एल, मैनुअल के लिए 10 µ एल, ध्वनिक मशीन के लिए २५० nL) दिया । दोनों मैनुअल और तरल हैंडलर के लिए सभी ९६ प्रतिक्रियाओं से एकल क्लोनों-तैयार सेट, ध्वनिक मशीन प्रतिक्रियाओं (चित्रा 2c) के लिए अनुक्रम 12 का एक सबसेट के साथ अनुक्रम थे. सही अनुक्रम ९६ मैनुअल और तरल हैंडलर सेट के ९५% के लिए प्राप्त किए गए थे । ध्वनिक मशीन नमूना सबसेट का ८३% सही थे, लेकिन अंतिम दो प्रतिक्रियाओं के लिए किसी भी सफेद कालोनियों उपज में विफल रहा है, की संभावना अपर्याप्त मिश्रण बूंदों के कारण डीएनए और रिएजेंट के वितरण के बाद पूरा किया गया । चित्रा 2 डी की प्रतिक्रिया क्षमता क्लोनिंग दिखाता है, के रूप में कालोनियों, जो मैंयुअल रूप से (९४%) और तरल हेंडलर इकट्ठे (८४%) प्रतिक्रियाओं की कुल संख्या के लिए सफेद कालोनियों के अनुपात से मापा । दिलचस्प है, जब ध्वनिक मशीन के साथ अंतिम प्रतिक्रिया की मात्रा नीचे स्केलिंग, हम प्रतिक्रिया दक्षता में एक के रूप में चिह्नित छोड़ जब प्रतिक्रियाओं 1 µ l (पूरक चित्रा 1 और पूरक तालिका 2) से छोटे संस्करणों पर तैयार किया गया देखा. यह प्रतिक्रिया thermocycling, जो प्रतिक्रिया में नमक सांद्रता में वृद्धि पैदा कर सकता है के दौरान वाष्पीकरण के कारण की संभावना है ।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54703/54703fig1.jpg"> चित्र 1. स्वचालित डीएनए डिवाइस लाइब्रेरी असेंबली कार्यप्रवाह । (a) इस कार्य में प्रस्तुत प्रयोगात्मक कार्यप्रवाह का अवलोकन । (1) शोधकर्ताओं ने पहले सभी डीएनए भागों और गंतव्य वैक्टर वे उपयोग करना चाहते है के लिए Genbank फ़ाइलें अपलोड करें । (२) अगला, डीएनए भागों को विधानसभा में शामिल किया जाना चुना गया है. (3) उपकरण तो एक स्वचालित तरल हेंडलर के लिए एक चयनसूची पैदा करेगा, साथ ही साथ प्लेट नक्शे डीएनए भागों और एंजाइम mastermix के साथ मैनुअल जनसंख्या के साथ सहायता के लिए । (४) डीएनए एवं रिएजेंट प्लेटों का प्रयोग, साथ ही जेनरेट की गई चयनसूची, शोधकर्ताओं द्वारा तरल हैंडलर पर क्लोनिंग प्रतिक्रियाओं के असेंबली को निष्पादित करना. (5) एक बार पूरा, प्रतिक्रियाओं और बदल रहे है बहाव विश्लेषण के लिए चढ़ाया । (ख) इस काम में प्रयुक्त डीएनए भागों की सूची । तीन प्रमोटरों की कुल, तीन राइबोसोमल बंधन साइटों, चार कोडन दृश्यों, और एक transcriptional टर्मिनेटर इस्तेमाल किया गया ९६ तूस के मिश्रित पुस्तकालय उत्पंन करते हैं । <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54703/54703fig1large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54703/54703fig2.jpg"> चित्र 2. तीन अलग प्रतिक्रिया विधानसभा मोडल भर तुलना. (एक) ९६ प्रतिक्रियाओं के लिए प्रतिक्रिया सेटअप समय मैन्युअल रूप से इकट्ठे, एक तरल हैंडलर के माध्यम से, और एक ध्वनिक मशीन द्वारा. मैनुअल विधानसभा 2 ज 10 मिनट, जो सभी हाथ समय पर था लिया । तरल हेंडलर समय की एक समान राशि ले लिया (2 ज 6 मिनट) pipetting आज्ञाओं को क्रियांवित करने के लिए, लेकिन उस समय का केवल एक अंश (5 मिनट) पर हाथ था । ध्वनिक मशीन तरल स्थानांतरण निष्पादित करने के लिए काफी कम समय लिया (5 मिनट) और समय पर न्यूनतम हाथ ले लिया (5 मिनट). (ख) प्रत्येक विधानसभा विधि के लिए एकल क्लोनिंग प्रतिक्रिया प्रति मूल्य । यह कीमत एंजाइमों का इस्तेमाल किया, साथ ही साथ पिपेट सुझावों की लागत भी शामिल है । (ग) सभी ९६ इकट्ठे तूस की एकल कालोनियों से अनुक्रमण परिणाम । सही क्लोन का प्रतिशत सभी विधानसभा विधियों में तुलनीय था । ध्यान दें कि केवल एक सबसेट (12) पूर्ण ९६ सभाओं के ध्वनिक मशीन तैयार नमूनों से बदल रहे थे । दो प्रतिक्रियाओं किसी भी सफेद कालोनियों उपज में विफल रहा है, संभावना अपर्याप्त डीएनए और एंजाइम mastermix बूंदों के OutputPlate में मिश्रण के कारण । (घ) क्लोनिंग रिएक्शन की तुलना मैनुअल और तरल हैंडलर के बीच क्षमता-तैयार प्रतिक्रियाओं से की जाती है । <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54703/54703fig2large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
पूरक चित्रा 1. प्रतिक्रिया क्षमता कम प्रतिक्रिया मात्रा के साथ कम हो जाती है । प्रतिक्रिया क्षमता ड्रॉप स्पष्ट रूप से नीचे 1 µ एल नीचे प्रतिक्रिया संस्करणों स्केलिंग जब इस प्रवृत्ति दो अलग अंतिम डीएनए सांद्रता के साथ देखा जाता है; हालांकि, वैज्ञानिकों छोटे संस्करणों का उपयोग करने के लिए एजेंट लागत पर बचाने के विकल्प अगर कम क्षमता बर्दाश्त किया जा सकता है चुन सकते हैं । <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54703/Supplemental_Figure_1.pdf">इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.</a>
पूरक तालिका 1। विभिंन pipetting संस्करणों के लिए डीएनए और एंजाइम तरल वर्ग मापदंडों की तालिका । <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54703/Supplemental_Table_1_V2.xlsx">इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.</a>
पूरक तालिका 2। प्रतिक्रिया दक्षता गणना । कच्चे CFU संख्या 12 के लिए दिया जाता है ९६ रूपांतरित प्रतिक्रियाओं को मैंयुअल रूप से तैयार है और तरल हेंडलर के द्वारा । CFU संख्या भी ध्वनिक मशीन पर छोटे अंतिम प्रतिक्रिया संस्करणों के परीक्षण के लिए प्रदान की जाती हैं । <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54703/Supplemental_Table_2.xlsx">इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.</a>

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Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

यहां, एक स्वचालित कार्यप्रवाह मॉड्यूलर डीएनए प्रदर्शन करने के लिए "उपकरण" विधानसभा तरल हैंडलिंग रोबोट पर एक मॉड्यूलर क्लोनिंग डीएनए विधानसभा विधि का उपयोग कर प्रस्तुत किया है । प्रोटोकॉल मिश्रित डीएनए डिवाइस पुस्तकालय पीढ़ी, जो हम दो तरल हैंडलिंग प्लेटफार्मों का उपयोग कर प्रदर्शन के लिए तरल हैंडलर चयनसूची पैदा करने के लिए एक सहज ज्ञान युक्त सॉफ्टवेयर उपकरण का उपयोग करता है ।

स्वचालित रोबोट तरल हैंडलिंग मॉड्यूलर डीएनए उपकरणों की विधानसभा

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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अर्द्ध कृत्रिम आण्विक मशीन और इसके उपयोग के डीएनए नुकसान की जांच के लिए इन विट्रो विधानसभा में

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