We would like to thank the vivarium manager and staff at San Diego State University for support with animal husbandry. During this work, K.A.P. was supported by an ARCS scholarship and a fellowship from the Inamori Foundation. K.S.D. is supported by an R01 grant, NS051247, from the National Institutes of Health.

כל העבודה בבעלי החיים אושרה על ידי משרד טיפול בבעלי חי מעבדה בסן דייגו סטייט ועורך תחת סטנדרטי וטרינרים קבלו. עכברים נקבה, גיל 8 - 16 שבועות, שימשו לפיתוח שיטה זו. 1. הזרקת הכנה Intraperitoneal של β-אסטרדיול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את β-אסטרדיול (0.5 מ&quot;ג / עכבר) על לשקול נייר כשהוא לבוש בציוד מגן אישי מתאים (PPE). זהירות: β-אסטרדיול יכול להיספג דרך העור ומשטחים ריריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר β-אסטרדיול לצינור מערבולת חרוטי 15 מ&quot;ל עד שכל הגושים יוסרו β-אסטרדיול הוא אבקה דקה. צייר את שמן שומשום (100 μl / עכבר) לתוך מזרק 10 מ&quot;ל. מזרק-מסנן שמן שומשום לתוך צינור חרוטי 15 מ&quot;ל המכיל את-אסטרדיול β באמצעות מסנן 0.45-מיקרומטר. וורטקס צינור חרוטי 15 מ&quot;ל עד-אסטרדיול β הוא תרחיף הומוגני בשמן שומשום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר את β-esההשעיה tradiol לתוך מזרק 10 מ&quot;ל חדש. עם 18 G, 1-ב. מחט, aliquot 100 μl של ההשעיה לתוך מזרקים טוברקולין 1 מ&quot;ל. הכן מזרק אחד עבור כל עכבר. מניח 26 חדש, הסטרילי G, ½-ב. מחט על מזרק אחד טוברקולין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נהל 0.5 מ&quot;ג של β-אסטרדיול המרחפים 100 μl של שמן שומשום (5 מ&quot;ג / מ&quot;ל) לכל עכבר 24 שעות לפני חיסון חיידקי. להזריק כל עכבר בתוך החלל הצפק, ב רביעי הבטן התחתונים, רק בצד ימין או שמאל של קו האמצע, כפי שתואר לעיל 28. הערה: אין ניקוי או הגזיזה של הזריקה הוא הכרחי. </li></ol> 2. נרתיקי הרכבה עם GBS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום אחד לפני חיסון, לגדל תרבית נוזל לילה 5 מ&quot;ל של זן של עניין GBS, כגון A909 (סרוטיפ Ia), במרק טוד יואיט (THB) על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תת תרבות GBS הלילה בווליום 01:10 לתוך THB הטרי לדגור על 37 מעלות צלזיוס. לגדל אתחיידקים לשלב יומן אמצע (OD 600 = 0.4-0.5). הערה: זה בדרך כלל ייקח 2 - 3 שעות, בהתאם לזן של GBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את תת-התרבות על חיידקי צינור גלול חרוטי 15 מיליליטר סטרילי ב 3000 g × למשך 5 דקות. לשאוב supernatant. Resuspend גלולה חיידקי 200 μl של בופר פוספט סטרילית (PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות הגלולה המושעית, להביא 3 - 5 מיליליטר של PBS (1 מיליליטר לכל 10 עכברים) בדיוק OD 600 = 0.4 בתוך שפופרת תרבות של 5 מיליליטר חדשה. זה יהיה ריכוז של ~ 1 × 10 8 יחידות המושבה להרכיב (CFU) / מ&quot;ל. מעבירים צינור חרוטי 15 מ&quot;ל חדש מחדש גלולה החיידקים 3,000 גרם × למשך 5 דקות. לשאוב supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה ב PBS ב 1/10 נפח המקורי. לדוגמה, אם 3 מ&quot;ל של OD 600 = 0.4 היה pelleted, ואז resuspend אותו 300 μl של PBS. הערה: זהו השעית החיידקים הסופית (~ 1 × 10 9 CFU / ml) המשמשת חיסון בעלי חיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Reserve 50 μl של השעיה זו דילול סדרתי ציפוי על אגר THB לקבוע את הבידוד מדויק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן כל עכבר עם 10 μl של השעית החיידקים הסופית כך 1 × 10 7 CFU ניתנת כל עכבר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לחסן, לרסן את העכבר באופן ידני על ידי הבטחת העור הרפוי על בעורפו בין של האגודל ואצבע מורה המטפלים ולאחר מכן לשתק את הזנב, כפי שתואר לעיל 28. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר את 10 μl של GBS מוכן בשלב 2.6 לתוך קצה פיפטה טעינת ג&#39;ל 200 μl. הכנס את קצה 5 עד 10 מ&quot;מ לתוך לומן בנרתיק לוותר על 10 μl של הבידוד. הערה: טיפי טעינת ג&#39;ל עדיפים על טיפי 200 μl סטנדרטיים כדי למזער את הסיכון של טראומה או פציעת איברים, במיוחד עכברים צעירים יותר או קטנים יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לאחר חיסון, לשחרר את בעורף ולרומם את הקצה האחורי של העכבר, הרמת העכבר בזנבו walking את רגליו הקדמיות על משטח קשה עבור ~ 1 דק &#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראייה לבדוק את פתח הנרתיק לכל backflow של בידוד. אם backflow הוא ציין, קצה פיפטה טרי ניתן להשתמש כדי לתפעל או להגדיל את פתח הנרתיק, דבר המקל על ספיגה של הזרימה חוזר לתוך לומן. בנוסף, backflow ניתן aspirated דרך פיפטה מחדש מחוסן. הערה: אם מתן סוכנים אקטואליים, אורגניזמים פרוביוטיים, או חלבונים בעלי עניין, בהיקף של עד 20 μl חיץ פיסיולוגי יכול להינתן בדרכי נרתיקית. </li></ol></li></ol> 3. שטיפת לומן בנרתיק לכמת טען GBS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן אחד צינור מיקרו צנטריפוגות 1.5 מ&quot;ל לכל עכבר על ידי הוספת 100 μl של PBS. זמן קצר לפני בניקוי, טרום להרטיב את הספוגית ב PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרסן את העכבר כמתואר בשלב 2.7.1 והכנס את ספוגית 10 מ&quot;מ לתוך לומן הנרתיק. בעדינות לסובב את ספוגית 4 פעמים עם כיוון השעון ו -4 פעמים נגד כיוון השעון, הפעלת לחץ קל על קיר הנרתיק.</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את ספוגית אל הצינור microcentrifuge 1.5 מ&quot;ל עם 100 μl של PBS. לפני הציפוי, מערבולת צינור microcentrifuge עבור ~ 15 שניות כדי לשחרר את חיידקי מהמקלון. סדרתי לדלל מדגם ב PBS צלחת 20 μl של דילולים 1:10 דרך 1: 10,000 על צלחות אגר בינוני ההפרש מוכן לפי הוראות היצרן. דגירת הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. מושבות GBS יופיעו גם ורוד או סגול בהיר בצבע. פלורה אנדוגני אחרת תהיה עכבות, או תופיע מושבות כחולות, לבנות או אפורות. </li></ol> 4. איסוף נוזלים בנרתיק שטיפה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרסן את העכבר כמתואר בשלב 2.7.1. בעזרת קצה פיפטה טעינת ג&#39;ל 200-μl, pipet 20 μl של PBS לתוך לומן הנרתיק. בעדינות pipet את הווליום כולו ולמטה 4 פעמים בתוך לומן, ולאחר מכן למשוך את כל נפח באותו קצה פיפטה. הערה: אם נוזל השטיפה הוא עבה עם רירי, קצה פיפטה תקן 200 μlניתן להשתמש כדי לאסוף את נוזל השטיפה הסופי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם חיסכון נוזל שטיפה לניתוח ציטוקינים או כימות CFU, לוותר לתוך צינור microcentrifuge 0.7 מ&quot;ל. אם קביעת השלב של ייחום, לוותר לפחות 5 μl של נוזל שטיפה לשקופית זכוכית ולבחון את התאים בהגדלה 100X על מיקרוסקופ אור. הערה: לקבלת דוגמאות של שלבי הייחום, ראה איור 1. </li></ol> Dissection רקמות 5. המגון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל עכבר, להכין שלושה צינורות מתברגים 2 מיליליטר (אחד לכל רקמות: נרתיק, צוואר רחם, ורחם). ממלא כל צינור עם מספיק (0.4 - 0.5 גרם) 1.0 מ&quot;מ חרוזי zirconia כדי לכסות את תחתית החרוטים בצורה של הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיטוי הצינורות המוכנים לפני איסוף רקמות במשך 30 דקות ב 121 מעלות צלזיוס, במיוחד אם לכימותי עומס חיידקים. הוסף 500 μl של PBS סטרילי כדי צינור אחד. לשקול כל צינור לאחר מעוקר ולהקליט לשימוש עתידי כדי לחשב משקל רקמה התאושש. </li><li&gt; להקריב את העכבר באמצעות אישרה שיטות מוסדיים כגון מחנק CO 2 ו נקע בצוואר הרחם. תרסיס לאורך הבטן הגחון עם 70% EtOH. במספריים סטריליות, לפתוח את חלל abdominopelvic, להרים את העור שרירי הגב ועל הבטן, ואת מקומו המעיים כך במערכת הרבייה חשופה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את המספריים עם 70% EtOH, לנגב לנקות במידת הצורך, והעביר את שני קרני הרחם באורך אמצע בין הגוף הרחם והשחלות. בעזרת מספרי מלקחיים, שומן קרבי נפרד, ממברנות, ואת שלפוחית ​​השתן מן במערכת הרבייה, נע caudally. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר מספריים כמתואר בשלב 5.4. רוחבי לחתוך את הנרתיק קרוב הפות ככל האפשר כדי להפריד את מערכת הרבייה מהגוף. הרם והוצא את מערכת הרבייה השלמה ולמקם אותו בצלחת פטרי סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות סכין גילוח חדש, להפריד את הרחם מצוואר הרחם ב קיצוץ רוחבי אחד. לעקר את סכין הגילוח עם 70%EtOH, ולאחר מכן להפריד את צוואר הרחם מהנרתיק ב קיצוץ רוחבי אחד. הערה: לא תהיה כמות מינימלית של רקמת הרחם עדיין מחוברת אל צוואר הרחם. תהיה כמות מינימאלית של רקמת נרתיק עדיין מחוברת אל צוואר הרחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים סטריליות, להעביר את כל הרקמות לתוך צינורות 2 מ&quot;ל של כל אחד מהם המכיל PBS ו שמאחד חרוזים. נקה את המלקחיים עם 70% EtOH בין טיפול בכל רקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול כל צינור כובע בורג 2 מ&quot;ל ולחסר את המשקל המקורי של צינור כדי לקבוע את משקל רקמות. משקולות רקמות בדרך כלל להשתנות בין 20 - 100 מ&quot;ג. בחוזקה לאטום את צינורות כובע בורג homogenize הרקמות עבור 1 דקות במהירות המרבית ב homogenizer רקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לכמת עומס חיידקי, סדרתי לדלל 25 μl של homogenate רקמות דילולים צלחת 01:10 דרך 1: 10,000 על צלחות אגר בינוני ההפרש. דגירה צלחות כמתואר בשלב 3.3. כדי לאחסן דגימות כימות ציטוקינים, להקפיא homogenates רקמה על -20 ° C. </li></ol>

החוקרים אין לי מה לחשוף.

כדי לקדם את קידום ההבנה של אינטראקציות GBS עם שני מארח חיידקים אחרים בהקשר של המארח, במודל חיה נדרש. עבודה זו מתארת ​​את ההיבטים הטכניים של הקמת קולוניזציה וגינלית GBS בעכברים. פרוטוקול זה משיג&gt; 90% קולוניזציה של עכברים ללא שימוש בהרדמה לחסן חיידקים או לאסוף דגימות ספו?...

סטרפטוקוקוס agalactiae, מקבוצה B Streptococcus (GBS), הוא חיידק כמוס, גראם חיוביים אשר מבודד לעתים קרובות מהבטן בדרכי המין והשתן של מבוגרים בריאים. בשנות ה -1970, GBS התגלה בתור הסוכן המוביל לתמותה בילוד זיהומיות, עם למעלה מ -7,000 מקרים של המחלה בילוד בשנה 1. מחלה מוקדמת GBS (סוף יום) מתרחשת בשעות או בימים הראשונים של החיים, נשאלת דלקת ריאות או מצוקה נשימתית, ולעתים קרובות מתפתח אלח דם, ואילו מחלות בגיל מאוחר (לוד) מתפתח לאחר מספר חודשים ומציג עם בקטרמיה, אשר לעתים קרובות ומקדמות דלקת קרום המוח 2. החל משנת 2002, המרכז לבקרת מחלות ומניעתן ממליץ על בדיקה אוניברסלית עבור קולוניזציה וגינלית GBS ב הריון מאוחר וטיפול מונע אנטיביוטי במהלך הלידה (IAP) כדי GBS חיובי אמהות 1. למרות הירידה של המחלה מוקדמת בכ -1,000 מקרים בארצות הברית מדי שנה בשל IAP,GBS נשאר הגורם המוביל של אלח דם בילוד מוקדם, ו התרחשות מאוחרת נשארת 1 מעושה. בין אם ברחם, בזמן הלידה, או אפילו במקרים בגיל מאוחר, חשיפה לידתי עד GBS דורשת הישרדות, משוכל באמצעות מספר סביבות מארחות ומחסומים, התחמקות חיסונית, וכן, במקרה של דלקת קרום מוח, חציית דם הפיקוח ההדוק מוח 2. Upstream של אינטראקציות הארסיות אלה בתוך הילוד הוא קולוניזציה הראשונית של מערכת הנרתיק האימהית. אימהי שיעורי קולוניזציה וגינלית GBS נעים בין 8-18% במדינות מפותחות ומתפתחות, עם שיעור ממוצע מוערך של 12.7% 3,4. קולוניזציה GBS בדרך בנרתיק במהלך ההריון יכולה להיות קבועה, לסירוגין, או בעלת אופי ארעי בקרב נשים בודדות 5. נקודה מעניינת הוא אימהית גיל&gt; 36 שנים קשורות קולוניזציה המתמשכת 6. גורמי סיכון ביולוגי סוציו אקונומי רבים להתיישבות הנרתיק GBSזוהה. גורמים ביולוגיים כוללים קולוניזציה GBS העיכול והיעדר לקטובצילוס בתוך הבטן. עם זאת, מוצא אתני, השמנת יתר, היגיינה, פעילות מינית גם קושרו עם מרכבת 7 נרתיק GBS. למרות לשמצה בגרימת זיהומים בילוד, GBS גורם גם מגוון של זיהומים אימהיים הוא peripartum ולאחר לידה. מרכבת GBS היא גדלה אצל נשים עם הצגת דלקת נרתיק 8 ו, במקרים מסוימים, יכולה להיות אפילו את ישות מחל 9. בנוסף, התרוממות GBS באיברי הרבייה במהלך ההריון עלולה לגרום זיהום תוך-שפיר או chorioamnionitis 10. יתר על כן, ב עד 3.5% מכלל ההריונות, GBS מפיצה לשלפוחית השתן לגרום לזיהום בדרכי השתן או בקטרוריה אסימפטומטית 11. בקטרוריה GBS במהלך ההריון קשורה לסיכון מוגבר של קדחת לידתית, chorioamnionitis, לידה מוקדמת, ואת prematurקרע הדואר של ממברנות 12. יחדיו, בנוכחות GBS בתוך מערכת הנרתיק קשורה לזיהומים של רקמות מארחים מרובים, ואת היכולת לבטל GBS מן הנישה הזו הוא הכרחי עבור שניהם בריאות האם בילוד. עד לאחרונה, רוב העבודה בחינת אינטראקציות GBS עם מערכת הצרויקו הוגבל מודלים תא במבחנה 13-15. ניסויים במבחנה אלה חשפו גורמי חיידקיים שחשובים לדבקות, כוללים חלבוני משטח כזה חוזר פילים ו סרין עשיר 17,18, כמו גם מערכות רגולטוריות דו רכיבים 15,19 ותגובת התעתיק העולמית של האפיתל נרתיקית GBS 19. עם זאת, על מנת להבהיר את מארח חיידק האינטראקציות באופן מלא בתוך מערכת הנרתיק, במודל חיה חזק הכרחי. עבודה מוקדמת הראתה כי GBS ניתן להשבה מתוך בדרכי הנרתיק של עכברים מחוסנים 20,21 וחולדות &lt;sup&gt; 22 בשני תנאים בהריון שאינן בהריון. בשנת 2005, קולוניזציה וגינלית GBS לטווח קצר הייתה דגם בעכברים כדי לבחון את היעילות של אנזים ממס הפאג לטיפול GBS בנרתיק פני תקופה של 24 שעות 23. מספר שנים לאחר מכן, במודל של עכברי קולוניזציה וגינלית לטווח ארוך GBS פותח ללמוד גורמים המארח חיידקי מסדירי התמדת GBS. מודל זה זיהה מספר גורמים GBS תורם קולוניזציה, כולל הנספחים משטח 17,18 ומערכות דו רכיבי GBS 19,24. מודל זה תרם לזיהוי מנגנוני התגובה מארח 19,25 ו שימש כדי לבדוק אסטרטגיות טיפוליות שונות, כולל פפטידים אימונו-26 ו פרוביוטיקה 27. פרוטוקול זה נותן את ההדרכה הדרושה כדי לחסן GBS לדרכי עכבר הנרתיק ולאחר מכן לעקוב קולוניזציה ולאסוף דגימות עבור ניתוחים נוספים.

<table><tbody><tr><td>Sesame oil&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3547-250ML</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-Estradiol&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E8875-1G</td><td>CAUTION: Wear appropriate PPE. &amp;beta;-estradiol can be absorbed through the skin and mucosal surfaces.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>200 &amp;mu;l gel loading pipette tips&amp;nbsp;</td><td>USA Scientific</td><td>1252-0610</td><td></td></tr><tr><td>Urethro-genital, sterile, calcium alginate swabs</td><td>Puritan</td><td>25-801 A 50</td><td></td></tr><tr><td>CHROMagar StrepB</td><td>DRG International</td><td>SB282</td><td></td></tr><tr><td>Todd Hewitt Broth</td><td>Hardy Diagnostics</td><td>7161C</td><td></td></tr><tr><td>18 G, 1.5 inch needles</td><td>BD</td><td>305199</td><td></td></tr><tr><td>26 G, 0.5 inch needles</td><td>BD</td><td>305111</td><td></td></tr><tr><td>10 ml syringes</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>1 ml syringes</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &amp;mu;m PVDF syringe filters</td><td>Whatman</td><td>6900-2504</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Phosphate-Buffered Salt Solution 1x</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr></tbody></table>

a murine model of group b streptococcus vaginal colonization

סטרפטוקוקוס agalactiae (מהקבוצה B Streptococcus, GBS), הוא למעצמה קולוניאלית גראם חיובי, ללא תסמינים של מערכת העיכול האנושית ודרכי נרתיק של 10 - 30% ממבוגרים. אצל אנשים החיסון נפגעת, בילודים כולל, נשים בהריון, קשישים, GBS עלול לעבור פתוגן פולשנית גרימת אלח דם, דלקת פרקים, דלקת ריאות, דלקת קרום המוח. בגלל GBS הוא הפתוגן חיידקי מובילה של ילודים, מניעה הנוכחית מורכבת ההקרנה הריון מאוחר לגרורות GBS בנרתיק וטיפול אנטיביוטי שלאחר מכן peripartum של אמהות GBS חיובי. נטלו נרתיק GBS כבד הוא גורם סיכון למחלה והתנחלות בילוד. למרבה הצער, מעט מאוד ידוע על המארח וגורם חיידקי מקדמים או להתיר GBS קולוניזציה וגינלית. פרוטוקול זה מתאר טכניקה להקמת קולוניזציה וגינלית GBS המתמשכת באמצעות דגימה אחת β-אסטרדיול טרום טיפול יומי לקבוע לואה חיידקיםד. זה שיטות לפרטים נוספים כדי לנהל סוגי טיפולים נוספים או ריאגנטים עניין לאסוף נוזל שטיפה וגינלית ורקמות במערכת הרבייה. במודל עכבר זה יהיה עוד יותר את ההבנה של יחסי הגומלין GBS-המארח בתוך סביבת הנרתיק, אשר יוביל טיפולית מעניינת פוטנציאל לשלוט קולוניזציה הנרתיק של האם במהלך ההריון כדי למנוע העברת לגבי הילוד פגיע. זה גם יהיה עניין להגדיל את הבנתנו אינטראקציות חיידקי מארח כלליות בדרכי הנרתיק הנשיות.

במהלך הפיתוח של המודל הזה, תצפיות מרובות נעשו לגבי הגורמים המשפיעים על משך קולוניזציה וגינלית GBS. כדי לקבוע כיצד לשלב הייחום בבית משפיע חיסון התמדה חיידקי GBS, עכברים בוימו ביום של חיסון באמצעות נוזל שטיפה וגינלית. איור 1 מדגים את ארבעת השלבי?...

Watch this Scientific Journal Video about A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization at JoVE.com

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

מטרת פרוטוקול זה היא לחקות קבוצה אנושית B Streptococcus (GBS) קולוניזציה וגינלית במודל בעכברים. שיטה זו עשויה לשמש כדי לחקור תגובות מארחות חיסוניות וגורם חיידקי תורם התמדת נרתיק GBS, כמו גם לבחון אסטרטגיות טיפוליות.

מודל Murine של הקבוצה B<em&gt; סטרפטוקוקוס</em&gt; נרתיקי Colonization

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...

a-murine-model-of-group-b-streptococcus-vaginal-colonization

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

14.2K Views.  University of California San Diego School of Medicine.  מטרת פרוטוקול זה היא לחקות קבוצה אנושית B Streptococcus (GBS) קולוניזציה וגינלית במודל בעכברים. שיטה זו עשויה לשמש כדי לחקור תגובות מארחות חיסוניות וגורם חיידקי תורם התמדת נרתיק GBS, כמו גם לבחון אסטרטגיות טיפוליות. 

Video: A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

Protocols for Vaginal Inoculation and Sample Collection in the Experimental Mouse Model of Candida vaginitis

Vulvovaginal candidiasis (VVC), caused by Candida species, is a fungal infection of the lower female genital tract that affects approximately 75% of otherwise healthy women during their reproductive years18,32-34. Predisposing factors include antibiotic usage, uncontrolled diabetes and disturbance in reproductive hormone levels due to pregnancy, oral contraceptives or hormone replacement therapies33,34. Recurrent VVC (RVVC), defined as three or more episodes per year, affects a separate 5 to 8% of women with no predisposing factors33.
An experimental mouse model of VVC has been established and used to study the pathogenesis and mucosal host response to Candida3,4,11,16,17,19,21,25,37. This model has also been employed to test potential antifungal therapies in vivo13,24. The model requires that the animals be maintained in a state of pseudoestrus for optimal Candida colonization/infection6,14,23. Under such conditions, inoculated animals will have detectable vaginal fungal burden for weeks to months. Past studies show an extremely high parallel between the animal model and human infection relative to immunological and physiological properties3,16,21. Differences, however, include a lack of Candida as normal vaginal flora and a neutral vaginal pH in the mice.
Here, we demonstrate a series of key methods in the mouse vaginitis model that include vaginal inoculation, rapid collection of vaginal specimens, assessment of vaginal fungal burden, and tissue preparations for cellular extraction/isolation. This is followed by representative results for constituents of vaginal lavage fluid, fungal burden, and draining lymph node leukocyte yields. With the use of anesthetics, lavage samples can be collected at multiple time points on the same mice for longitudinal evaluation of infection/colonization. Furthermore, this model requires no immunosuppressive agents to initiate infection, allowing immunological studies under defined host conditions. Finally, the model and each technique introduced here could potentially give rise to use of the methodologies to examine other infectious diseases of the lower female genital tract (bacterial, parasitic, viral) and respective local or systemic host defenses.

Protocols for Vaginal Inoculation and Sample Collection in the Experimental Mouse Model of Candida vaginitis

Key techniques to be used in the evaluation of Candida vaginitis in an experimental animal model are described. The methods will allow rapid collection of vaginal specimens and lymphocytes from draining lumbar lymph nodes. These techniques could give rise to mouse models of other diseases in the female lower genital tract.

הפרוטוקולים עבור הרכבת חיסון וגינלי אוסף דוגמאות במודל ניסיוני של עכבר קנדידה דלקת הנרתיק

Vulvovaginal candidiasis (VVC), caused by Candida species, is a fungal infection of the lower female genital tract that affects approximately 75% of ...

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing the mucosal surface of the nasopharynx, where it can reside, multiply and eventually overcome host defences to invade to other tissues of the host. Establishment of an infection in the normally lower respiratory tract results in pneumonia. Alternatively, the bacteria can disseminate into the bloodstream causing bacteraemia, which is associated with high mortality rates2, or else lead directly to the development of pneumococcal meningitis. Understanding the kinetics of, and immune responses to, nasopharyngeal colonization is an important aspect of S. pneumoniae infection models.
Our mouse model of intranasal colonization is adapted from human models3 and has been used by multiple research groups in the study of host-pathogen responses in the nasopharynx4-7. In the first part of the model, we use a clinical isolate of S. pneumoniae to establish a self-limiting bacterial colonization that is similar to carriage events in human adults. The procedure detailed herein involves preparation of a bacterial inoculum, followed by the establishment of a colonization event through delivery of the inoculum via an intranasal route of administration. Resident macrophages are the predominant cell type in the nasopharynx during the steady state. Typically, there are few lymphocytes present in uninfected mice8, however mucosal colonization will lead to low- to high-grade inflammation (depending on the virulence of the bacterial species and strain) that will result in an immune response and the subsequent recruitment of host immune cells. These cells can be isolated by a lavage of the tracheal contents through the nares, and correlated to the density of colonization bacteria to better understand the kinetics of the infection.

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Colonization of the murine nasopharynx with Streptococcus pneumoniae and the subsequent extraction of adherent or recruited cells is described. This technique involves flushing the nasopharynx and collection of the fluid through the nares and is adaptable for various readouts, including differential cell quantification and analysis of mRNA expression in situ.

אפיון של תגובות דלקתיות במהלך קולוניזציה תוך-אפית עם דלקת ריאות סטרפטוקוקוס

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Humanized Mouse Model to Study Bacterial Infections Targeting the Microvasculature

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood vessels resulting in vascular leak, the development of purpuric rashes and eventual tissue necrosis. Studying the pathogenesis of this infection was previously limited by the human specificity of the bacteria, which makes in vivo models difficult. In this protocol, we describe a humanized model for this infection in which human skin, containing dermal microvessels, is grafted onto immunocompromised mice. These vessels anastomose with the mouse circulation while maintaining their human characteristics. Once introduced into this model, N. meningitidis adhere exclusively to the human vessels, resulting in extensive vascular damage, inflammation and in some cases the development of purpuric rash. This protocol describes the grafting, infection and evaluation steps of this model in the context of N. meningitidis infection. The technique may be applied to numerous human specific pathogens that infect the blood stream.

Neisseria meningitidis is a human specific pathogen that infects blood vessels. In this protocol human microvessels are introduced into a mouse by grafting human skin onto immunocompromised mice. Bacteria adhere extensively to the human vessels, leading to vascular damage and development of the purpuric rash typically observed in human cases.

אנושי עכבר מודל ללמוד זיהומים חיידקיים מיקוד microvasculature

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood ...

A Mouse Model for Pathogen-induced Chronic Inflammation at Local and Systemic Sites

Chronic inflammation is a major driver of pathological tissue damage and a unifying characteristic of many chronic diseases in humans including neoplastic, autoimmune, and chronic inflammatory diseases. Emerging evidence implicates pathogen-induced chronic inflammation in the development and progression of chronic diseases with a wide variety of clinical manifestations. Due to the complex and multifactorial etiology of chronic disease, designing experiments for proof of causality and the establishment of mechanistic links is nearly impossible in humans. An advantage of using animal models is that both genetic and environmental factors that may influence the course of a particular disease can be controlled. Thus, designing relevant animal models of infection represents a key step in identifying host and pathogen specific mechanisms that contribute to chronic inflammation.
Here we describe a mouse model of pathogen-induced chronic inflammation at local and systemic sites following infection with the oral pathogen Porphyromonas gingivalis, a bacterium closely associated with human periodontal disease. Oral infection of specific-pathogen free mice induces a local inflammatory response resulting in destruction of tooth supporting alveolar bone, a hallmark of periodontal disease. In an established mouse model of atherosclerosis, infection with P. gingivalis accelerates inflammatory plaque deposition within the aortic sinus and innominate artery, accompanied by activation of the vascular endothelium, an increased immune cell infiltrate, and elevated expression of inflammatory mediators within lesions. We detail methodologies for the assessment of inflammation at local and systemic sites. The use of transgenic mice and defined bacterial mutants makes this model particularly suitable for identifying both host and microbial factors involved in the initiation, progression, and outcome of disease. Additionally, the model can be used to screen for novel therapeutic strategies, including vaccination and pharmacological intervention.

Animal models have proven to be invaluable tools in defining host and pathogen specific mechanisms that contribute to the development of chronic inflammation. Here we describe a mouse model of oral infection with the human pathogen Porphyromonas gingivalis and detail methodologies to assess the progression of inflammation at local and systemic sites.

מודל של עכברים של דלקת כרונית הנגרם על ידי פתוגן באתרים מקומיים ומערכתיים

Chronic inflammation is a major driver of pathological tissue damage and a unifying characteristic of many chronic diseases in humans including ...

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal features of the natural infection. This protocol describes procedures for the establishment and evaluation of systemic infection due to neuropathogenic Escherichia coli K1 in the neonatal rat. Colonization of the gastrointestinal tract leads to dissemination of the pathogen along the gut-lymph-blood-brain course of infection and the model displays strong age dependency. A strain of E. coli O18:K1 with enhanced virulence for the neonatal rat produces exceptionally high rates of colonization, translocation to the blood compartment and invasion of the meninges following transit through the choroid plexus. As in the human host, penetration of the central nervous system is accompanied by local inflammation and an invariably lethal outcome. The model is of proven utility for studies of the mechanism of pathogenesis, for evaluation of therapeutic interventions and for assessment of bacterial virulence.

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Here, a procedure is described for the establishment of systemic infection in the neonatal rat with cultures of Escherichia coli K1. This non-invasive procedure permits colonization of the gastrointestinal tract, translocation of the pathogen to the systemic circulation, and invasion of the central nervous system at the choroid plexus.

דגם לא פולשנית של Neuropathogenic<em&gt; Coli Escherichia</em&gt; זיהום בעכברוש הילודים

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal ...

Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice

Recurrent urinary tract infections (rUTI) caused by uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are common and costly. Previous articles describing models of UTI in male and female mice have illustrated the procedures for bacterial inoculation and enumeration in urine and tissues. During an initial bladder infection in C57BL/6 mice, UPEC establish latent reservoirs inside bladder epithelial cells that persist following clearance of UPEC bacteriuria. This model builds on these studies to examine rUTI caused by the emergence of UPEC from within latent bladder reservoirs. The urogenital bacterium Gardnerella vaginalis is used as the trigger of rUTI in this model because it is frequently present in the urogenital tracts of women, especially in the context of vaginal dysbiosis that has been associated with UTI. In addition, a method for in situ bladder fixation followed by scanning electron microscopy (SEM) analysis of bladder tissue is also described, with potential application to other studies involving the bladder.

Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice

A mouse model of uropathogenic E. coli (UPEC) transurethral inoculation to establish latent intracellular bladder reservoirs and subsequent bladder exposure to G. vaginalis to induce recurrent UPEC UTI is demonstrated. Also demonstrated are the enumeration of bacteria, urine cytology, and in situ bladder fixation and processing for scanning electron microscopy.

זיהום חוזר בדרכי השתן של Escherichia coli שנגרם על ידי גרדנרלה וגינליס חשיפה לשלפוחית השתן בעכברים

Recurrent urinary tract infections (rUTI) caused by uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are common and costly. Previous articles describing models of ...

C-section of Preclinical Animal Model of Chorioamnionitis Triggered by Group B Streptococcus (GBS)

Group B Streptococcus (GBS) is one of the most common bacteria isolated during human pregnancy. It is a leading cause of placental infection/inflammation, termed chorioamnionitis. Chorioamnionitis exposes the developing fetus to a high risk of organ injuries, perinatal morbidity, and mortality, as well as life-long neurobehavioral impairments and other non-neurological developmental issues. The two most frequent subtypes of GBS isolates from maternal and fetal tissues are serotypes Ia (13%-23%) and III (25%-53%). Our lab has developed and characterized a rat model of GBS-induced chorioamnionitis to study subsequent impacts on the central nervous system of the developing fetus and to understand underlying mechanistic aspects. This article presents the design as well as uses of the preclinical rat model, which closely reproduces the hallmark of GBS-induced chorioamnionitis in humans. This article aims to help scientists reproduce the experimental design as well as to provide support through examples of troubleshooting. The present model may also contribute to potential discoveries through uncovering causes, mechanisms, and novel therapeutic avenues, which remain unsettled in many developmental impairments arising from chorioamnionitis. Furthermore, the use of this model may be extended to the studies of perinatal non-neurological common and severe morbidities affecting, for instance, the retina, bowel, lung, and kidney. The main interest of this research is in the field of GBS-induced fetal neurodevelopmental impairments such as cerebral palsy (CP), attention deficit hyperactivity disorder (ADHD), and autism spectrum disorder (ASD). The rationale supporting this model is presented in this article, followed by procedures and results.

C-section of Preclinical Animal Model of Chorioamnionitis Triggered by Group B Streptococcus GBS

The goal of this protocol is to describe a preclinical animal model of Group B Streptococcus (GBS)-induced chorioamnionitis. The study is designed to investigate mechanistic processes, potential causal links with developmental impairments, and finally to develop translational anti-inflammatory placento- and neuro-protective treatments.

Group B Streptococcus (GBS) is one of the most common bacteria isolated during human pregnancy. It is a leading cause of placental infection/inflammation, ...

שבב נרתיק מיקרופלואידי לחקר המיקרוביום בנרתיק

Modeling Healthy and Dysbiotic Vaginal Microenvironments in a Human Vagina-on-a-Chip

Women's health, and particularly diseases of the female reproductive tract (FRT), have not received the attention they deserve, even though an unhealthy reproductive system may lead to life-threatening diseases, infertility, or adverse outcomes during pregnancy. One barrier in the field is that there has been a dearth of preclinical, experimental models that faithfully mimic the physiology and pathophysiology of the FRT. Current in vitro and animal models do not fully recapitulate the hormonal changes, microaerobic conditions, and interactions with the vaginal microbiome. The advent of Organ-on-a-Chip (Organ Chip) microfluidic culture technology that can mimic tissue-tissue interfaces, vascular perfusion, interstitial fluid flows, and the physical microenvironment of a major subunit of human organs can potentially serve as a solution to this problem. Recently, a human Vagina Chip that supports co-culture of human vaginal microbial consortia with primary human vaginal epithelium that is also interfaced with vaginal stroma and experiences dynamic fluid flow has been developed. This chip replicates the physiological responses of the human vagina to healthy and dysbiotic microbiomes. A detailed protocol for creating human Vagina Chips has been described in this article.

Author Spotlight: מהפכה במחקר על אינטראקציות מיקרוביום בנרתיק באמצעות שבב נרתיקי

This article describes a protocol for creating a microfluidic vagina-on-a-chip (Vagina Chip) culture device that enables the study of human host interactions with a living vaginal microbiome under microaerophilic conditions. This chip can be used as a tool to investigate vaginal diseases as well as to develop and test potential therapeutic countermeasures.

מידול מיקרו-סביבות נרתיקיות בריאות ודיסביוטיות בנרתיק אנושי על שבב

Women's health, and particularly diseases of the female reproductive tract (FRT), have not received the attention they deserve, even though an unhealthy ...

מודל Murine של הקבוצה B

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

הפרוטוקולים עבור הרכבת חיסון וגינלי אוסף דוגמאות במודל ניסיוני של עכבר קנדידה דלקת הנרתיק

אפיון של תגובות דלקתיות במהלך קולוניזציה תוך-אפית עם דלקת ריאות סטרפטוקוקוס

אנושי עכבר מודל ללמוד זיהומים חיידקיים מיקוד microvasculature

מודל של עכברים של דלקת כרונית הנגרם על ידי פתוגן באתרים מקומיים ומערכתיים

דגם לא פולשנית של Neuropathogenic

זיהום חוזר בדרכי השתן של Escherichia coli שנגרם על ידי גרדנרלה וגינליס חשיפה לשלפוחית השתן בעכברים

C-section of Preclinical Animal Model of Chorioamnionitis Triggered by Group B Streptococcus (GBS)

מידול מיקרו-סביבות נרתיקיות בריאות ודיסביוטיות בנרתיק אנושי על שבב

מידול מיקרו-סביבות נרתיקיות בריאות ודיסביוטיות בנרתיק אנושי על שבב

מידול מיקרו-סביבות נרתיקיות בריאות ודיסביוטיות בנרתיק אנושי על שבב