We would like to thank the vivarium manager and staff at San Diego State University for support with animal husbandry. During this work, K.A.P. was supported by an ARCS scholarship and a fellowship from the Inamori Foundation. K.S.D. is supported by an R01 grant, NS051247, from the National Institutes of Health.

Tüm hayvan çalışmaları, San Diego Eyalet Üniversitesi Lab Hayvan Bakım Dairesi tarafından onaylanmış ve kabul edilmiş veteriner standartlar altında gerçekleştirilmiştir. Dişi fareler, yaş 8-16 hafta, bu yöntemin geliştirilmesi için kullanılmıştır. β-estradiyol hazırlanması 1. ve periton içi enjeksiyon <ol><li> Uygun kişisel koruyucu ekipman (KKE) giyerek kağıt tartmak üzerinde β-estradiol (0.5 mg / fare) dışarı ölçün. DİKKAT: β-estradiyol deri ve mukoza yüzeylerinden absorbe edilebilir. </li><li> Tüm topaklar kaldırıldı ve β-östradiol ince bir toz kadar 15 ml konik tüp ve vorteks β-östradiol aktarın. 10 ml&#39;lik bir şırınga içine susam yağı (100 ul / fare) hazırlayın. 0.45 um filtre kullanılarak β-estradiol ihtiva eden 15 ml&#39;lik konik bir tüp içine şırınga filtresi susam yağı. β-estradiyol susam yağı içinde, homojen bir süspansiyon olana kadar 15 ml konik tüp vorteksleyin. </li><li> β-es çizinYeni 10 ml&#39;lik enjektöre tradiol süspansiyon. 18 G, 1-in ile. İğne, kısım 1 ml tüberkülin şırınga içine süspansiyon 100 ul. Her fare için bir şırınga hazırlayın. Yeni, steril 26 G ½-in yerleştirin. Her tüberkülin şırınga iğnesi. </li><li> önce bakteriyel aşılama için her bir fare, 24 saat için, susam yağı (5 mg / ml) 100 ul içinde süspansiyon haline β-estradiyol 0.5 mg yönetme. Sadece sağa, alt karın kadran, periton boşluğuna içinde her fare enjekte veya daha önce 28 açıklandığı gibi, orta hat bıraktı. NOT: enjeksiyon yerinde hiçbir temizlik ya da kırpma gereklidir. </li></ol> GBS ile 2. Vajinal aşılama <ol><li> Bir gün inokülasyondan önce, 37 ° C&#39;de, Todd Hewitt brotu (THB), bu tür A909 (serotip Ia) halinde çıkar, bir GBS soyunun 5 ml gece boyunca sıvı bir kültürün büyür. </li><li> Taze THB içine 1:10 hacimde GBS gecede kültür altkültürü ve 37 ° C&#39;de inkübe edin. büyümekorta log fazına bakteriler (= 0.4-0.5 OD 600). NOT: - GBS gerginlik bağlı olarak, 3 saat Bu genellikle 2 alacaktır. </li><li> 5 dakika için 3000 x g &#39;de, steril bir 15 mL konik tüp ve topak bakterilere alt kültür aktarın. süpernatant aspire. Steril bir fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) 200 ul bakteri pelletini. </li><li> Yeni 5-ml kültür tüpü içinde 5 ml PBS (10 fare başına 1 mi) tam olarak OD 600 = 0.4 - topak, yeniden süspanse kullanılarak, 3 getir. Bu yaklaşık 1 x 10 8 koloni oluşturan birim (CFU) / ml bir konsantrasyon olacaktır. Yeni 15-ml konik tüp ve transfer 5 dakika boyunca 3.000 x g&#39;de bakteri yeniden pelet. süpernatant aspire. </li><li> 1/10 orijinal ses PBS içinde pelletini. Örneğin, OD 600 = 0.4, 3 ml pellet haline getirilmiştir, daha sonra PBS, 300 ul içinde tekrar süspansiyon. NOT: Bu hayvan aşılama için kullanılan nihai bakteriyel süspansiyon (~ 1 × 10 9 CFU / ml) &#39;dir. </li><li> RSeri seyreltme için bu süspansiyondan 50 ul eserve THB agar üzerine kaplama tesisinin inokulum belirlenmesi. </li><li> Bu durum, 1 x 10 7 cfu her fareye tatbik edilir, böylece nihai bakteriyel süspansiyonun 10 | il her bir fare inoküle. <ol><li> , Aşılamak, daha önce 28 açıklandığı gibi, eylemcinin başparmak ve işaret parmağı ve sonra kuyruk immobilize arasındaki ensesinden gevşek cilt güvence altına alarak elle fareyi dizginlemek için. </li><li> 200 ul jel yükleme pipet içine adım 2.6 hazırlanan GBS 10 ul hazırlayın. bir uca vajinal lümen içine 5 ila 10 mm takın ve inokulum 10 ul dağıtmak. NOT: Jel yükleme ipuçları özellikle genç veya daha küçük farelerde, organ travma ya da yaralanma riskini en aza indirmek için standart 200-ul ipuçları tercih edilir. </li><li> Hemen aşılama ardından kuyruk ve w ile fare kaldırma, boyun ense bırakın ve fare arka ucunu yükseltmek~ 1 dakika süreyle sert bir yüzeye ön pençeleri alking. </li><li> Görme inokulum herhangi backflow vajinal açıklık inceleyin. Geri tepme görülürse, taze bir pipet lümenine backflow alımını kolaylaştıran, manipüle veya vajinal açılış büyütmek için kullanılabilir. Ayrıca, geri tepme pipet aracılığıyla aspire edilebilir ve yeniden aşılandı. Not: topik maddeler, probiyotik organizmalar ya da ilgi duyulan proteinlerin tatbik için, fizyolojik tampon içinde 20 ul hacme kadar vajina sistemine verilebilir. </li></ol></li></ol> 3. GBS Load belirlememize Vajinal Lumen Swabbing <ol><li> 100 ul PBS ilave edilerek fare başına bir 1.5 ml mikro santrifüj tüpü hazırlayın. Sadece sürüntü önce, PBS içinde çubukla önceden ıslatın. </li><li> Adım 2.7.1 de açıklandığı gibi fare kısıtlamaktadır ve vajinal lümen içine çubukla 10 mm yerleştirin. Yavaşça 4 kez saat yönünde bez döndürmek ve 4 kez vajinal duvarın hafif baskı uygulayarak, saat yönünün aksine.</li><li> 100 ul PBS ile 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne bezi aktarın. kaplama öncesi, girdap sürüntü bakterilerin serbest bırakmak için 15 sn ~ için mikrosantrifüj tüpü. Seri olarak 1:10 ila 1 arasında, her PBS numune ve plaka dilüsyonları 20 ul seyreltilmiş: 10.000, üretici talimatlarına göre hazırlanmış farklı ortam agar plakaları üzerinde. 24 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. GBS kolonileri renkli parlak pembe veya leylak ya görünecektir. Diğer endojen florası inhibe olacak, ya da mavi, beyaz veya gri koloniler olarak görünecektir. </li></ol> 4. Toplama Vajinal Lavaj Sıvısı <ol><li> Adım 2.7.1 de açıklandığı gibi fare kısıtlamaktadır. 200 ul jel yükleme pipet, pipet vajinal lümen içine PBS 20 ul kullanma. Yavaşça lümen içinde tüm hacim yukarı ve aşağı 4 kez pipetlemeyin ve daha sonra aynı pipet tüm hacmi çekilme. NOT: lavaj sıvısı mukoza ile kalınsa, standart bir 200 ul pipetNihai lavaj sıvısı toplamak için kullanılabilir. </li><li> sitokin analizi veya CFU ölçümü için lavaj sıvısı tasarruf ise, 0,7 ml mikrosantrifüj tüp içine dağıtmak. kızışma aşamasını belirleyen ise, cam slayt üzerine lavaj sıvısının en az 5 ul dağıtmak ve bir ışık mikroskobu üzerinde 100X büyütme altında hücreleri gözlemlemek. NOT: östrus aşamalarında örnekler için bakınız Şekil 1. </li></ol> 5. Doku Diseksiyon ve Homojenizasyon <ol><li> Her fare için, üç 2 ml vidalı kapaklı tüpler (: vajina, serviks ve rahim her doku için bir tane) hazırlar. tüpünün konik şekilli alt kapak - (0.5 g 0,4) 1,0 mm zirkonyum boncukları geniş her tüp doldurun. </li><li> Bakteriyel yük miktarının, özellikle de 121 ° C &#39;de 30 dakika boyunca doku toplama öncesinde hazırlanan borular Otoklav. Her tüpe, steril PBS&#39;nin 500 ul ekle. kazanılan doku ağırlığını hesaplamak için ileride başvurmak üzere otoklav ve kayıt sonra her tüp tartılır. </li><li&gt; CO 2 boğulma ve servikal dislokasyon olarak kabul kurumsal yöntemler kullanılarak fare Kurban. % 70 EtOH ile ventral karın aşağı püskürtün. Steril makas, abdominopelvik boşluğu açmak arka deri ve karın kasları kaldırın ve üreme yolu açıkta kalacak şekilde bağırsakları yerinden. </li><li> % 70 EtOH ile makas sterilize gerekirse temizleyin ve her iki rahim boynuzları uterus gövdesi ve yumurtalıkların arasında orta uzunlukta kesilir. makas ve forseps, ayrı viseral yağ, membranlar ve uzak üreme yolundan mesane kullanarak, kaudal hareket. </li><li> Adım 5.4 açıklandığı gibi makas sterilize edin. Enine bedenden üreme yolu ayırmak için mümkün olduğunca vulva kadar yakın vajina kesti. Kaldırın ve bozulmamış üreme yolu kaldırmak ve steril Petri kabı yerleştirin. </li><li> Yeni bir jilet kullanarak, bir çapraz kesme serviks rahim ayırın. % 70 ile jilet sterilizeDaha sonra EtOH ve bir enine kesim vajinadan rahim ağzı ayırın. NOT: Hala serviks bağlı rahim dokusunun az miktarda olacaktır. hala serviks bağlı vajinal doku az miktarda olacaktır. </li><li> Steril forseps kullanarak, kendi 2-ml tüpler PBS içeren ve boncuk homojenize içine dokuların her aktarın. Her bir doku taşıma arasında% 70 EtOH ile forseps temizleyin. </li><li> Her bir 2-ml&#39;lik vida başlıklı bir tüp içerisinde tartılır ve doku ağırlığı belirlemek için borunun orijinal ağırlığının çıkartılması. 100 mg - Doku ağırlıkları tipik olarak 20 arasında değişmektedir. Sıkıca vidalı kapaklı tüp sızdırmaz bir doku homojenleştirici maksimum hızda 1 dakika boyunca doku homojen hale getirilir. </li><li> 10.000 diferansiyel orta agar plakaları üzerinde: bakteri yükü ölçmek için, seri doku Homojenat ve plaka seyreltileri 01:10 1 ile 25 ul sulandırmak. Adım 3.3 açıklandığı gibi inkübe edin. doku homojenatları dondurmak, sitokin ölçümü için numune saklamak için -20 ° C. </li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

ev sahibi kapsamında ana ve diğer mikropların iki GBS etkileşimlerinin anlaşılması ilerletilir, bir hayvan modeli gereklidir. Bu çalışma farelerde GBS vajinal kolonizasyonu kuran teknik yönlerini açıklar. Bu protokol, bakterilerin aşılanması veya aşının kalınlaşmasına vajinal ön yıkama ya da katkı maddeleri kolonizasyon etkinleştirme çubukla örnekleri, immün gidericiler toplamak için anestezi kullanılmadan farelerin&gt;% 90 kolonizasyon elde edilir. Ayrıca, bu model GBS sebat uzunluğu ve...

Streptococcus agalactiae Grup B Streptococcus (GBS), sıklıkla bağırsak ve sağlıklı yetişkin genitoüriner izole bir kapsüllenmiş, Gram pozitif bir bakteridir. 1970&#39;li yıllarda, GBS yılda yenidoğan hastalık 7.000 durumlarda 1 ile bulaşıcı neonatal mortalitenin önde gelen ajan olarak ortaya çıkmıştır. Erken başlangıçlı GBS hastalığı (EOD) pnömoni veya solunum sıkıntısı doğar, ilk saatlerde veya yaşam günlerinde ortaya çıkar ve genellikle geç başlangıçlı hastalık (LOD) ise, sepsis içine geliştirir birkaç ay sonra gelişir ve sıklıkla bakteriyemi, ile ortaya 2 menenjit ilerler. 2002 yılı itibariyle, Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezleri GBS-pozitif annelere 1 geç gebelik ve intrapartum antibiyotik profilaksisi (IAP) GBS vajinal kolonizasyon için evrensel tarama önermektedir. yıllık IAP nedeniyle Amerika Birleşik Devletleri&#39;nde yaklaşık 1.000 durumlarda erken başlangıçlı hastalık azalmaya rağmen,GBS erken başlangıçlı neonatal sepsis başta gelen nedenidir ve geç başlangıçlı olay 1 etkilenmez. rahimde olsun, doğum sırasında, hatta geç başlangıçlı olgularda, GBS için yenidoğan maruz menenjit, yüksek düzenlenmiş kan-kesiştiği durumunda, ev sahibi ortamları ve engelleri, bağışıklık kaçırma bir numara ile hayatta kalma, enine gerektirir ve beyin bariyeri 2. Yenidoğanda olan bu öldürücü etkileşimlerin Memba anne vajinal kanalın ilk kolonizasyonu olduğunu. GBS vajinal kolonizasyon oranları% 12.7 3,4 olarak tahmin ortalama oranı ile gelişmiş ve gelişmekte olan ülkelerde 8-18% aralığında anne. Gebelik sırasında vajinal kanalın GBS kolonizasyonu bireysel kadınlar 5 arasında doğada, sabit aralıklı veya geçici olabilir. İlginçtir, bir anne yaşı&gt; 36 yıl kalıcı kolonizasyon 6 ile ilişkilidir. GBS vajinal kolonizasyon için çok sayıda biyolojik ve sosyo-ekonomik risk faktörleritespit edilmiştir. Biyolojik faktörler gastrointestinal GBS kolonizasyonu ve bağırsak içinde Lactobacillus yokluğunu içerir. Bununla birlikte, etnik köken, obezite, hijyen ve cinsel aktivitesi GBS vajinal taşıyıcı 7 ile ilişkilendirilmiştir. Yenidoğan enfeksiyonlara neden için kötü şöhretli olsa da, GBS de anne enfeksiyonları hem peripartum ve postpartum çeşitli neden olur. GBS taşıyıcılığı bile hastalık varlık 9 olabilir, bazı durumlarda, vajinit 8 ile başvuran kadınlarda artmış ve. Buna ek olarak, gebelik sırasında üreme sisteminin GBS yükseliş içi amniyotik enfeksiyon veya korioamnionit 10 ile sonuçlanabilir. Ayrıca, gebeliklerin% 3.5&#39;e varan, GBS bir idrar yolu enfeksiyonu ya da asemptomatik bakteriüri 11 neden mesaneye yaymaktadır. Hamilelik sırasında GBS bakteriüri İntrapartum ateş, korioamnionit, erken doğum ve prematür riski ile ilişkilidirmembranların 12 e rüptürü. Birlikte ele alındığında, vajinal kanalın içinde GBS varlığı birden çok ana bilgisayar dokuların enfeksiyona bağlı ve bu niş GBS ortadan kaldırmak için yeteneği hem anne ve yenidoğan sağlığı açısından zorunludur edilir. Yakın zamana kadar, servikovaginal yolu ile GBS etkileşimlerini incelemek çalışma çoğunluğu in vitro hücre modellerinin 13-15 sınırlıydı. Bu in vitro deneyler dahil olmak üzere yüzey proteinleri yapışma için önemli olan bakteriyel faktörler ortaya çıkarmıştır bir pili ve serin bakımından zengin tekrarlar 17,18 yanı sıra, iki bileşenli düzenleyici sistemler 15,19 ve vajinal epitelinin genel transkripsiyon yanıtı GBS 19. Bununla birlikte, tam olarak vajina yolu içinde ana Mikrop Etkileşimleri aydınlatmak için, sağlam bir hayvan modeli gereklidir. Erken çalışma GBS inoküle edilmiş fareler, 20,21 ve sıçanların vajinal kanalın elde edilebilir olduğunu göstermiştir &lt;sup&gt; hem gebe ve gebe olmayan koşullarda 22. 2005 yılında, kısa vadeli GBS vajinal kolonizasyon 24 saat süre üzerinde 23 vajinal GBS tedavisinde bir faj litik enzimin etkinliğini incelemek için farelerde modellenmiştir. Birkaç yıl sonra, uzun vadeli bir GBS vajinal kolonizasyon fare modeli GBS sebat yöneten ana ve bakteriyel faktörleri incelemek için geliştirilmiştir. Bu model yüzey uzantıları 17,18 ve GBS iki bileşenli sistemlerde 19,24 dahil kolonizasyon katkıda sayısız GBS faktörleri tespit etmiştir. Bu model konak yanıtı mekanizmalarının 19,25 belirlenmesine katkıda bulunmuş ve immünomodülatör peptidler 26 ve probiyotikler 27 dahil olmak üzere birçok tedavi stratejilerinin, test etmek için kullanıldı. Bu protokol, fare vajinal kanalın içine GBS aşılamak için ve daha sonra kolonizasyonu izlemek ve daha fazla analizler için numune toplamak için gerekli yönlendirmeyi verir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="592">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Sesame oil&#160;</td>
			<td style="width:91px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S3547-250ML</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:216px;">&#946;-Estradiol&#160;</td>
			<td style="width:91px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E8875-1G</td>
			<td>CAUTION: Wear appropriate PPE. &#946;-estradiol can be absorbed through the skin and mucosal surfaces.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">200 &#956;L gel loading pipette tips&#160;</td>
			<td style="width:91px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1252-0610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Urethro-genital, sterile, calcium alginate swabs</td>
			<td style="width:91px;">Puritan</td>
			<td style="width:119px;">25-801 A 50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CHROMagar StrepB</td>
			<td style="width:91px;">DRG International</td>
			<td style="width:119px;">SB282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Todd Hewitt Broth</td>
			<td style="width:91px;">Hardy Diagnostics</td>
			<td style="width:119px;">7161C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">18 G, 1.5 inch needles</td>
			<td style="width:91px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">305199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">26 G, 0.5 inch needles</td>
			<td style="width:91px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">305111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">10 mL syringes</td>
			<td style="width:91px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1 mL syringes</td>
			<td style="width:91px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.45 &#956;m PVDF syringe filters</td>
			<td style="width:91px;">Whatman</td>
			<td style="width:119px;">6900-2504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Salt Solution 1X</td>
			<td style="width:91px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a murine model of group b streptococcus vaginal colonization

Yetişkin% 30 - Streptococcus agalactiae (Grup B Streptococcus, GBS), insan mide-bağırsak sistemi ve 10 vajinal kanalın bir Gram-pozitif asemptomatik colonizer olup. Bağışıklık tehlikeye bireyler de dahil olmak üzere yenidoğanlar, hamile kadınlar ve yaşlılar, GBS sepsis, artrit, pnömoni, ve menenjite neden olan istilacı patojene geçebilir. GBS yenidoğanlarda lider bakteriyel patojen olduğu için, mevcut profilaksi GBS vajinal kolonizasyon ve GBS-pozitif annelerin sonraki peripartum antibiyotik tedavisi için geç gebelik taraması oluşur. Ağır GBS vajinal yük yenidoğan hastalık ve kolonizasyon her ikisi için de risk faktörüdür. Ne yazık ki, çok az ev sahibi ve teşvik veya vajinal kolonizasyon GBS izin bakteriyel faktörler hakkında bilinmektedir. Bu protokol, bakteriyel uzunlu belirlemek için tek bir β-estradiyol, tedavi öncesi ve günlük olarak örnekleme yöntemiyle sürekli GBS vajinal kolonizasyonu kurulması için bir yöntem açıklanırd. Ayrıca ayrıntılar yöntemleri ek tedaviler veya ilgi reaktifler yönetmek ve vajinal lavaj sıvısı ve üreme yolu dokuları toplamak için. Bu fare modeli gebelik sırasında annenin vajinal kolonizasyonu kontrol etmek ve savunmasız bebeğe bulaşmasını önlemek için potansiyel terapötik hedeflere götürecek vajinal ortamında GBS-host etkileşimi, anlaşılması daha fazla olacaktır. Aynı zamanda kadın vajinal kanalın genel bakteriyel-konak etkileşimleri anlayışımızı artırmak ilgi olacaktır.

Bu modelin geliştirilmesi sırasında, birden gözlemler GBS vajinal kolonizasyon süresini etkileyen faktörler konusunda yapılmıştır. Aşılama etkiler GBS bakteriyel kalıcılık de nasıl östrus evresini belirlemek için, fareler vajinal lavaj sıvısının yoluyla aşılama günü sahnelenmiştir. Şekil 1 ile belirlendiği gibi, fare östrus döngüsü dört aşamadan göstermektedir ıslak montaj vajinal lavaj sıvısı, iyi kurulmuş bir yöntem 29.</s...

Watch this Scientific Journal Video about A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization at JoVE.com

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

Bu protokolün amacı bir murin modelinde insan Grup B Streptococcus (GBS), vajinal kolonizasyonu taklit etmektir. Bu yöntem konak bağışıklık yanıtlarını ve GBS vajinal sebat katkıda bakteriyel faktörleri araştırmak için, yanı sıra tedavi stratejileri test etmek için kullanılabilir.

B Grubu bir murin modelinde<em&gt; Streptococcus</em&gt; Vajinal Kolonizasyon

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...

a-murine-model-of-group-b-streptococcus-vaginal-colonization

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

14.1K Görüntüleme.  University of California San Diego School of Medicine.  Bu protokolün amacı bir murin modelinde insan Grup B Streptococcus (GBS), vajinal kolonizasyonu taklit etmektir. Bu yöntem konak bağışıklık yanıtlarını ve GBS vajinal sebat katkıda bakteriyel faktörleri araştırmak için, yanı sıra tedavi stratejileri test etmek için kullanılabilir. 

Video: A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

Murine Model of CD40-activation of B cells

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L), human B cells can be expanded without difficulties from small amounts of peripheral blood within 14 days to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients1-4. CD40-B cells express important lymph node homing molecules and can attract T cells in vitro5. Furthermore they efficiently take up, process and present antigens to T cells6,7. CD40-B cells were shown to not only prime na&iacute;ve, but also expand memory T cells8,9. Therefore CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been studied as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cell-based immunotherapy1,5,10. In order to further study whether CD40-B cells induce effective T cell responses in vivo and to study the underlying mechanism we established a cell culture system for the generation of murine CD40-activated B cells. Using splenocytes or purified B cells from C57BL/6 mice for CD40-activation, optimal conditions were identified as follows: Starting from splenocytes of C57BL/6 mice (haplotype H-2b) lymphocytes are purified by density gradient centrifugation and co-cultured with HeLa cells expressing recombinant murine CD40 ligand (tmuCD40L HeLa)11. Cells are recultured every 3-4 days and key components such as CD40L, interleukin-4, -Mercaptoethanol and cyclosporin A are replenished. In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated murine CD40-B cells (mCD40B) with similar APC-phenotype to human CD40-B cells (Fig 1a,b). CD40-stimulation leads to a rapid outgrowth and expansion of highly pure (&gt;90%) CD19+ B cells within 14 days of cell culture (Fig 1c,d). To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the murine CD40 ligand on the transfectants has to be controlled regularly (Fig 2). Murine CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation and differentiation as well as to investigate their potential to function as APC in vitro and in vivo. Moreover, they represent a promising tool for establishing therapeutic or preventive vaccination against tumors and will help to answer questions regarding safety and immunogenicity of this approach12.

In this video, we demonstrate the procedure of CD40-activation and expansion of murine B cells from splenocytes of C57BL/6 mice, which can be used as a model antigen-presenting cell (APC) to study induction of immunity.

Murin Model B hücreleri CD40 aktivasyonu

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Induction and Assessment of Class Switch Recombination in Purified Murine B Cells

Humoral immunity is the branch of the immune system maintained by B cells and mediated through the secretion of antibodies. Upon B cell activation, the immunoglobulin locus undergoes a series of genetic modifications to alter the binding capacity and effector function of secreted antibodies. This process is highlighted by a genomic recombination event known as class switch recombination (CSR) in which the default IgM antibody isotype is substituted for one of IgG, IgA, or IgE. Each isotype possesses distinct effector functions thereby making CSR crucial to the maintenance of immunity. Diversification of the immunoglobulin locus is mediated by the enzyme activation-induced cytidine deaminase (AID). A schematic video describing this process in detail is available online (http://video.med.utoronto.ca/videoprojects/immunology/aam.html). AID's activity and the CSR pathway are commonly studied in the assessment of B cell function and humoral immunity in mice. The protocol outlined in this report presents a method of B cell isolation from murine spleens and subsequent stimulation with bacterial lipopolysaccharide (LPS) to induce class switching to IgG3 (for other antibody isotypes see Table 1). In addition, the fluorescent cell staining dye Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) is used to monitor cell division of stimulated cells, a process crucial to isotype switching 1, 2. The regulation of AID and the mechanism by which CSR occurs are still unclear and thus in vitro class switch assays provide a reliable method for testing these processes in various mouse models. These assays have been previously used in the context of gene deficiency using knockout mice 3. Furthermore, in vitro switching of B cells can be preceded by viral transduction to modulate gene expression by RNA knockdown or transgene expression 4-6. The data from these types of experiments have impacted our understanding of AID activity, resolution of the CSR reaction, and antibody-mediated immunity in the mouse.

Following antigen exposure, subpopulations of activated B cells undergo a process known as class switch recombination (CSR) to produce antibody isotypes with distinct effector functions. The protocol outlined in this report explains how CSR can be induced and analyzed in vitro for the purposes of studying B cell function.

Sınıf Anahtarı Rekombinasyon murin B Hücreleri Saf İndüksiyon ve Değerlendirme

Humoral immunity is the branch of the immune system maintained by B cells and mediated through the secretion of antibodies. Upon B cell activation, the ...

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not representative of the behavior, status or phenotype of single cells. Due to this new insight the number of single cell studies rises continuously (for recent reviews see 1,2,3). However, many of the single cell techniques applied do not allow monitoring the development and behavior of one specific single cell in time (e.g. flow cytometry or standard microscopy).
Here, we provide a detailed description of a microscopy method used in several recent studies 4, 5, 6, 7, which allows following and recording (fluorescence of) individual bacterial cells of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae through growth and division for many generations. The resulting movies can be used to construct phylogenetic lineage trees by tracing back the history of a single cell within a population that originated from one common ancestor. This time-lapse fluorescence microscopy method cannot only be used to investigate growth, division and differentiation of individual cells, but also to analyze the effect of cell history and ancestry on specific cellular behavior. Furthermore, time-lapse microscopy is ideally suited to examine gene expression dynamics and protein localization during the bacterial cell cycle. The method explains how to prepare the bacterial cells and construct the microscope slide to enable the outgrowth of single cells into a microcolony. In short, single cells are spotted on a semi-solid surface consisting of growth medium supplemented with agarose on which they grow and divide under a fluorescence microscope within a temperature controlled environmental chamber. Images are captured at specific intervals and are later analyzed using the open source software ImageJ.

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

This protocol provides a step-by-step procedure to monitor single cell behavior of different bacteria in time using automated fluorescence time-lapse microscopy. Furthermore, we provide guidelines how to analyze the microscopy images.

Canlı Hücre Görüntüleme Bacillus subtilis Ve Streptococcus pneumoniae Otomatik Zaman atlamalı Mikroskopi

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

Quantification of Fungal Colonization, Sporogenesis, and Production of Mycotoxins Using Kernel Bioassays

The rotting of grains by seed-infecting fungi poses one of the greatest economic challenges to cereal production worldwide, not to mention serious risks to human and animal health. Among cereal production, maize is arguably the most affected crop, due to pathogen-induced losses in grain integrity and mycotoxin seed contamination. The two most prevalent and problematic mycotoxins for maize growers and food and feed processors are aflatoxin and fumonisin, produced by Aspergillus flavus and Fusarium verticillioides, respectively.
Recent studies in molecular plant-pathogen interactions have demonstrated promise in understanding specific mechanisms associated with plant responses to fungal infection and mycotoxin contamination1,2,3,4,5,6. Because many labs are using kernel assays to study plant-pathogen interactions, there is a need for a standardized method for quantifying different biological parameters, so results from different laboratories can be cross-interpreted. For a robust and reproducible means for quantitative analyses on seeds, we have developed in-lab kernel assays and subsequent methods to quantify fungal growth, biomass, and mycotoxin contamination. Four sterilized maize kernels are inoculated in glass vials with a fungal suspension (106) and incubated for a predetermined period. Sample vials are then selected for enumeration of conidia by hemocytometer, ergosterol-based biomass analysis by high performance liquid chromatography (HPLC), aflatoxin quantification using an AflaTest fluorometer method, and fumonisin quantification by HPLC.

The devastation of cereal crops by seed-infecting fungi has prompted numerous research efforts to better understand plant-pathogen interactions. To study seed-fungal interactions in a laboratory setting, we developed a robust method for the quantification of fungal reproduction, biomass, and mycotoxin contamination using kernel bioassays.

Çekirdek biyoanalizlerin kullanarak Fungal Kolonizasyon, Sporogenesis ve Mikotoksin Üretimi Kantitasyonu

The rotting of grains by seed-infecting fungi poses one of the greatest economic challenges to cereal production worldwide, not to mention serious risks ...

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing the mucosal surface of the nasopharynx, where it can reside, multiply and eventually overcome host defences to invade to other tissues of the host. Establishment of an infection in the normally lower respiratory tract results in pneumonia. Alternatively, the bacteria can disseminate into the bloodstream causing bacteraemia, which is associated with high mortality rates2, or else lead directly to the development of pneumococcal meningitis. Understanding the kinetics of, and immune responses to, nasopharyngeal colonization is an important aspect of S. pneumoniae infection models.
Our mouse model of intranasal colonization is adapted from human models3 and has been used by multiple research groups in the study of host-pathogen responses in the nasopharynx4-7. In the first part of the model, we use a clinical isolate of S. pneumoniae to establish a self-limiting bacterial colonization that is similar to carriage events in human adults. The procedure detailed herein involves preparation of a bacterial inoculum, followed by the establishment of a colonization event through delivery of the inoculum via an intranasal route of administration. Resident macrophages are the predominant cell type in the nasopharynx during the steady state. Typically, there are few lymphocytes present in uninfected mice8, however mucosal colonization will lead to low- to high-grade inflammation (depending on the virulence of the bacterial species and strain) that will result in an immune response and the subsequent recruitment of host immune cells. These cells can be isolated by a lavage of the tracheal contents through the nares, and correlated to the density of colonization bacteria to better understand the kinetics of the infection.

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Colonization of the murine nasopharynx with Streptococcus pneumoniae and the subsequent extraction of adherent or recruited cells is described. This technique involves flushing the nasopharynx and collection of the fluid through the nares and is adaptable for various readouts, including differential cell quantification and analysis of mRNA expression in situ.

Streptococcus pneumoniae ile İntranazal Kolonizasyon Sırasında İnflamatuar Yanıtların Karakterizasyonu

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal features of the natural infection. This protocol describes procedures for the establishment and evaluation of systemic infection due to neuropathogenic Escherichia coli K1 in the neonatal rat. Colonization of the gastrointestinal tract leads to dissemination of the pathogen along the gut-lymph-blood-brain course of infection and the model displays strong age dependency. A strain of E. coli O18:K1 with enhanced virulence for the neonatal rat produces exceptionally high rates of colonization, translocation to the blood compartment and invasion of the meninges following transit through the choroid plexus. As in the human host, penetration of the central nervous system is accompanied by local inflammation and an invariably lethal outcome. The model is of proven utility for studies of the mechanism of pathogenesis, for evaluation of therapeutic interventions and for assessment of bacterial virulence.

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Here, a procedure is described for the establishment of systemic infection in the neonatal rat with cultures of Escherichia coli K1. This non-invasive procedure permits colonization of the gastrointestinal tract, translocation of the pathogen to the systemic circulation, and invasion of the central nervous system at the choroid plexus.

Neuropathogenic olmayan İnvaziv Modeli<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Yenidoğan Sıçan Enfeksiyon

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of causing systemic disease in both fish and humans. A better understanding of S. iniae disease pathogenesis requires an appropriate model system. The genetic tractability and the optical transparency of the early developmental stages of zebrafish allow for the generation and non-invasive imaging of transgenic lines with fluorescently tagged immune cells. The adaptive immune system is not fully functional until several weeks post fertilization, but zebrafish larvae have a conserved vertebrate innate immune system with both neutrophils and macrophages. Thus, the generation of a larval infection model allows the study of the specific contribution of innate immunity in controlling S. iniae infection.
The site of microinjection will determine whether an infection is systemic or initially localized. Here, we present our protocols for otic vesicle injection of zebrafish aged 2-3 days post fertilization as well as our techniques for fluorescent confocal imaging of infection. A localized infection site allows observation of initial microbe invasion, recruitment of host cells and dissemination of infection. Our findings using the zebrafish larval model of S. iniae infection indicate that zebrafish can be used to examine the differing contributions of host neutrophils and macrophages in localized bacterial infections. In addition, we describe how photolabeling of immune cells can be used to track individual host cell fate during the course of infection.

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Here, we present a protocol for the generation and imaging of a localized bacterial infection in the zebrafish otic vesicle.

Bir Zebra balığı Larva Modeli Doğuştan Bağışıklık Tepki Non-invaziv Görüntüleme<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Enfeksiyon

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model

Vibrio cholerae is best known as the infectious agent that causes the human disease cholera. Outside the human host, V. cholerae primarily exists in the aquatic environment, where it interacts with a variety of higher aquatic species. Vertebrate fish are known to be an environmental host and are a potential V. cholerae reservoir in nature. Both V. cholerae and the teleost fish species Danio rerio, commonly known as zebrafish, originate from the Indian subcontinent, suggesting a long-standing interaction in aquatic environments. Zebrafish are an ideal model organism for studying many aspects of biology, including infectious diseases. Zebrafish can be easily and rapidly colonized by V. cholerae after exposure in water. Intestinal colonization by V. cholerae leads to the production of diarrhea and the excretion of replicated V. cholerae. These excreted bacteria can then go on to colonize new fish hosts. Here, we demonstrate how to assess V. cholerae-intestinal colonization in zebrafish and how to quantify V. cholerae-induced zebrafish diarrhea. The colonization model should be useful to researchers who are studying whether genes of interest may be important for host colonization and/or for environmental survival. The quantification of zebrafish diarrhea should be useful to researchers studying any intestinal pathogen who are interested in exploring zebrafish as a model system.

Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model

Zebrafish are a natural Vibrio cholerae host and can be used to recapitulate and study the entire infectious cycle from colonization to transmission. Here, we demonstrate how to assess V. cholerae colonization levels and quantify diarrhea in zebrafish.

Vibrio cholerae kolonizasyon ve ishal yetişkin zebra balığı modelindeki miktarının

Vibrio cholerae is best known as the infectious agent that causes the human disease cholera. Outside the human host, V. cholerae primarily exists in the ...

Analysis of Shear Flow-induced Migration of Murine Marginal Zone B Cells In Vitro

Marginal zone B cells (MZBs) are a population of B cells that reside in the mouse splenic marginal zones that envelop follicles. To reach the follicles, MZBs must migrate up the shear force of blood flow. We present here a method for analyzing this flow-induced MZB migration in vitro. First, MZBs are isolated from the mouse spleen. Second, MZBs are settled on integrin ligands in flow chamber slides, exposed to shear flow, and imaged under a microscope while migrating. Third, images of the migrating MZBs are processed using the MTrack2 automatic cell tracking plugin for ImageJ, and the resulting cell tracks are quantified using the Ibidi chemotaxis tool. The migration data reveal how fast the cells move, how often they change direction, whether the shear flow vector affects their migration direction, and which integrin ligands are involved. Although we use MZBs, the method can easily be adapted for analyzing migration of any leukocyte that responds to the force of shear flow.

Marginal zone B cells (MZBs) respond to the force of shear flow by re-orienting their migration path up the flow. This protocol shows how to record and analyze the migration using a fluidics unit, pump, microscope imaging system, and free software.

Yamultma akış kaynaklı geçiş antikorundan marjinal bölge B hücrelerinin in Vitro analizine

Marginal zone B cells (MZBs) are a population of B cells that reside in the mouse splenic marginal zones that envelop follicles. To reach the follicles, ...

Isolation of Single Intracellular Bacterial Communities Generated from a Murine Model of Urinary Tract Infection for Downstream Single-cell Analysis

In this article, we outline a procedure used to isolate individual intracellular bacterial communities from a mouse that has been experimentally infected in the urinary tract. The protocol can be broadly divided into three sections: the infection, bladder epithelial cell harvesting, and mouth micropipetting to isolate individual infected epithelial cells. The isolated epithelial cell contains viable bacterial cells and is nearly free of contaminating extracellular bacteria, making it ideal for downstream single-cell analysis. The time taken from the start of infection to obtaining a single intracellular bacterial community is about 8 h. This protocol is inexpensive to deploy and uses widely available materials, and we anticipate that it can also be utilized in other infection models to isolate single infected cells from cell mixtures even if those infected cells are rare. However, due to a potential risk in mouth micropipetting, this procedure is not recommended for highly infectious agents.

This protocol describes a simple method of isolating single, infected-bladder epithelial cells from a murine model of urinary tract infection.

İdrar yolu enfeksiyonu aşağı akım tek hücreli analiz için bir fare modelinden oluşturulan tek hücre içi bakteriyel toplulukların yalıtım

In this article, we outline a procedure used to isolate individual intracellular bacterial communities from a mouse that has been experimentally infected ...

B Grubu bir murin modelinde

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler