Name: flow cytometric analysis of particle-bound bet v 1 allergen in pm10
Uploaded: 2016-11-19T13:00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10 at JoVE.com

The authors would like to thank Katrin Bossmann, Anett Neumann and Eike Wolter (German Environment Agency) for their valuable preparatory work.

Opmerking: Dit protocol beschrijft de indirecte kleuring van PM10 met een monoklonaal antilichaam (monoklonaal muizen IgG1 antilichaam kloon 3B4-MA) tegen Bet v 1, grote berkenpollen antigeencomponent, plus een allofycocyanine (APC) gemerkt secundair antilichaam (anti -mouse IgG1 antilichaam, kloon A85-1) en de daaropvolgende analyse op een flowcytometer. Met geschikte andere antilichamen beschikbaar zijn, kan deze werkwijze worden uitgebreid tot de detectie van andere antigenen gebonden aan omgevingslucht deeltjes. 1. PM10 Sampling <ol><li> PM10 verzamelen van lucht met polytetrafluorethyleen (PTFE) filters met een laag volume sampler met een stroomsnelheid van 2,3 m 3 / uur (figuur 1). Een karakterisering van de sampler toegepast voor de hier beschreven experimenten is gevonden in 16. Looptijd afhankelijk is van de hoeveelheid die nodig PM10 (meestal tussen 1 en 10 dagen). </li><li> Aan het einde van de incubatietijd, verwijder het filter uit de sampler en bevriezen bij-20 ° C tot gebruik. </li></ol><img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/54721/54721fig1.jpg" /> Figuur 1. Lage volume PM10 sampler. Voorbeeld van een laag volume PM10 sampler. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54721/54721fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> 2. PM10 verwijderen en Particle Count <ol><li> Laat de PTFE filter dooi gedurende ongeveer 5 minuten. Vervolgens zet de filter in een schone polystyreen petrischaal (Figuur 2A). Neem een ​​nieuwe petrischaal voor elk filter, indien meer dan één filter verwerkt. </li><li> Vervolgens bedekken de PTFE filter met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Dit protocol is opgesteld voor een laatste PM10-concentratie van 8x10 6 deeltjes per ml (zie stap 3.3). Voor het verkrijgen van tenminste dat concentratie, gebruik dan de volgende empirische volume van PBS om het filter overlay met: Als de PM10-collectie keer was &lt;<html> 2 dagen, gebruik maken van 2 ml. Voor incubatietijden ≥2 dagen, gebruik maken van 4 ml. Opmerking: Om de deeltjesconcentratie van de PM10 suspensie verhogen, kunnen suspensies van verschillende filters worden samengevoegd, indien dit wenselijk is. </li><li> Houd het PTFE filter met een pincet en bestrijk ze met een elektrische tandenborstel met een gevoelige opzetborstel voor 1 min (Figuren 2B, 2C). Transfer het deeltje-PBS-ophanging, hierna aangeduid als PM10 schorsing, een schone reageerbuis. </li></ol><img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/54721/54721fig2.jpg" /> Figuur 2. PM10 verwijdering van een elektrische tandenborstel. Een polytetrafluoretheen filter met PM10 bemonsterd wordt in een petrischaal polystyrol (A) en is bedekt met 4 ml PBS. Vervolgens PM10 wordt verwijderd met een elektrische tandenborstel (B: voor borstelen en C: na het poetsen gedurende 1 min).= &quot;Http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54721/54721fig2large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken. <ol start="4"><li> Meet de concentratie van PM10, bijvoorbeeld door toepassing van een deeltjesteller. Verdun een toereikende hoeveelheid PM10 suspensie zoals 50 ul in 10 ml isotone buffer meten, meet drie keer en berekent het gemiddelde totale aantal deeltjes per ml. Zorg ervoor dat u een deeltje teller die deeltjes van het betreffende formaat kan detecteren gebruiken. </li></ol> 3. Bet v 1 kleuring <ol><li> Bereken het aantal reactiebuizen voor de analyse van het monster ten minste drie reageerbuisjes nodig: (i) een buis met alleen monster (natief controle) (ii) een cuvet met plus secundair antilichaam (negatieve controle), en ( iii) één buis met het monster plus primaire en secundaire antilichaam (specifiek monster). Gemeten voor het eerst bereiden tenminste twee reactiebuizen voor (i) (ii),en (iii) voldoende materiaal goed aan te passen cytometer instellingen (zie stap 4,1). </li><li> Bereken de hoeveelheid PM10 suspensie vereist voor het aantal reactiebuizen. Elke reactie buis moet 50 ul van de opschorting. </li><li> Stel de deeltjesconcentratie gemeten in stap 2,4 voor de hoeveelheid suspensie in stap 3,2, berekend tot een uiteindelijke concentratie van 8x10 6 deeltjes per ml door toevoeging van een geschikte hoeveelheid PBS. OPMERKING: De resterende PM10 suspensie kan worden ingevroren bij -20 ° C voor latere experimenten, hoewel voor dit protocol PM10 vers bereide suspensie wordt aanbevolen. </li><li> Blok aspecifieke binding door daaraan PM10 suspensie met runderserumalbumine (BSA) bij een uiteindelijke concentratie van 0,02%, onder toepassing van een voorraadoplossing zoals 1% BSA bereid met PBS. Kort vortexen en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Voor elk monster cytometrie geanalyseerd door flow, overdracht 50 ul van de suspensie van stap 3,4 tot aclean reactie buis. Voeg een monoklonaal muizenantilichaam tegen Bet v 1 in een eindconcentratie van 0,02 ug / ul voor de aangegeven specifieke kleuring, kort vortexen reactiebuizen en incubeer gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur. <ol><li> Laat de reactiebuizen met de PM10-BSA suspensie die voor de natieve controle en de negatieve controle ook blijven 60 minuten bij kamertemperatuur. </li></ol></li><li> Was alle monsters door toevoeging van 500 pi PBS aangevuld met 0,02% BSA aan elke reactiebuis, kort vortexen en centrifugeer de monsters vervolgens bij 4700 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant voorzichtig met behulp van een vacuümpomp. </li><li> Herhaal stap 3.6. </li><li> Bepaal de totale hoeveelheid APC-gelabeld secundair anti-muis IgG1 antilichaam nodig: 1 ug antilichaam opgelost in 50 pl PBS aangevuld met 0,02% BSA per reactiebuis. Verdun de juiste hoeveelheid antilichaam met het respectieve volume PBS aangevuld met 0,02% BSA. </li><li> Voeg 50 pl verdund secundair antilichaam alle reactiebuizen behalve de voor de natieve controle reactiebuis. Vul het laatste met 50 pl PBS aangevuld met 0,02% BSA. Vortex alle monsters gedurende een paar seconden. </li><li> Incubeer alle monsters gedurende 30 minuten in het donker. </li><li> Herhaal stap 3.6 twee keer. </li><li> Voeg 50 ul PBS aan elke reactiebuis, vortex en de monsters op een stroom cytometer geanalyseerd. </li></ol> 4. Flow cytometrische analyse <ol><li> Met behulp van de inheemse controle, pas de volgende cytometer parameters om data-analyse te optimaliseren. <ol><li> Door het gebruik van de voorwaartse verstrooiing (FSC) drempel controller weergegeven op het apparaat besturingskaart, stelt de FSC drempel voor de laagste waarde (200) en start de analyse. </li><li> Door het gebruik van de scatter spanning controller, stel de FSC en zijwaartse verstrooiing (SSC) op die manier dat alle PM10-deeltjes kunnen worden opgespoord en dat de bevolking van deeltjes ligt ongeveer in the midden van de FSC-as en in de onderste helft van het SSC as. </li><li> Via de fluorescentie spanningsregelaar, stel de APC spanning en een spanning fluorescentie zoals fluoresceïne isothiocyanaat (FITC), wat niet uitzendt op dezelfde golflengte als APC, indien nodig. Zorg ervoor, dat alle deeltjes zichtbaar in de onderste helft van een fluorescentie assen. </li></ol></li><li> Achtereenvolgens onderzoekt elk monster inclusief de natieve controle en bewaar de FSC, SSC, APC, en FITC-gegevens van ten minste 10.000 deeltjes per monster. </li><li> Evalueer de gegevens met de desbetreffende software. Geadsorbeerd allergeen-gehalte in het specifieke monster kan worden gekwantificeerd op twee manieren: <ol><li> Analyseer de APC fluorescentie-intensiteit van alle deeltjes (mediane waarde) als maat voor Bet v 1 belasting over alle PM10. LET OP: Als de specifieke steekproef bevatte allergeen, moet APC fluorescentie-intensiteit in de specifieke monster te verhogen in vergelijking met de negatieve controle. Daarentegen, andere fluorescence intensiteiten (bijv., FITC fluorescentie-intensiteit) niet significant veranderen. </li><li> Bereken het percentage van de PM10-deeltjes met gebonden anti-Bet v 1 antilichaam. Daarbij, in de negatieve controle, stel dan een hek rondom de deeltjes beschouwd APC positief, kopieer en plak deze poort in de specifieke monster en af ​​te trekken van het percentage van APC positieve deeltjes in de negatieve controle van het percentage van APC positieve deeltjes in het specifieke monster. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Cakmak, S., Dales, R. E., Coates, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+air+pollution+increase+the+effect+of+aeroallergens+on+hospitalization+for+asthma?.">Does air pollution increase the effect of aeroallergens on hospitalization for asthma?.</a> J Allergy Clin Immunol. 129 (1), 228-231 (2012).</li><li>Barraza-Villarreal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Air+pollution,+airway+inflammation,+and+lung+function+in+a+cohort+study+of+Mexico+City+schoolchildren.">Air pollution, airway inflammation, and lung function in a cohort study of Mexico City schoolchildren.</a> Environ Health Perspect. 116 (6), 832-838 (2008).</li><li>Chen, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+association+of+ambient+air+pollution+with+airway+inflammation+in+schoolchildren.">The association of ambient air pollution with airway inflammation in schoolchildren.</a> Am J Epidemiol. 175 (8), 764-774 (2012).</li><li>Cyprowski, M., Buczynska, A., Szadkowska-Stanczyk, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indoor+allergens+in+settled+dust+from+kindergartens+in+city+of+Lodz,+Poland.">Indoor allergens in settled dust from kindergartens in city of Lodz, Poland.</a> Int J Occup Med Environ Health. 26 (6), 890-899 (2013).</li><li>Brough, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+peanut+protein+in+the+home+environment.">Distribution of peanut protein in the home environment.</a> J Allergy Clin Immunol. 132 (3), 623-629 (2013).</li><li>Galli, S. J., Tsai, M., Piliponsky, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+allergic+inflammation.">The development of allergic inflammation.</a> Nature. 454 (7203), 445-454 (2008).</li><li> World Health Organisation, R. O. f. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenology+and+human+health:+allergic+disorders:+report+on+WHO+meeting+Rome,+Italy.">Phenology and human health: allergic disorders: report on WHO meeting Rome, Italy.</a> , 256 (2003).</li><li>Wuthrich, B., Schindler, C., Leuenberger, P., Ackermann-Liebrich, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+atopy+and+pollinosis+in+the+adult+population+of+Switzerland+(SAPALDIA+study).+Swiss+Study+on+Air+Pollution+and+Lung+Diseases+in+Adults.">Prevalence of atopy and pollinosis in the adult population of Switzerland (SAPALDIA study). Swiss Study on Air Pollution and Lung Diseases in Adults.</a> Int Arch Allergy Immunol. 106 (2), 149-156 (1995).</li><li>Grote, M., Valenta, R., Reichelt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abortive+pollen+germination:+a+mechanism+of+allergen+release+in+birch,+alder,+and+hazel+revealed+by+immunogold+electron+microscopy.">Abortive pollen germination: a mechanism of allergen release in birch, alder, and hazel revealed by immunogold electron microscopy.</a> J Allergy Clin Immunol. 111 (5), 1017-1023 (2003).</li><li>Namork, E., Johansen, B. V., Lovik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+allergens+adsorbed+to+ambient+air+particles+collected+in+four+European+cities.">Detection of allergens adsorbed to ambient air particles collected in four European cities.</a> Toxicol Lett. 165 (1), 71-78 (2006).</li><li>S&#252;ring, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PM10+contains+particle-bound+allergens:+Dust+analysis+by+Flow+Cytometry.">PM10 contains particle-bound allergens: Dust analysis by Flow Cytometry.</a> Env Technol Inn. 5, 60-66 (2016).</li><li>Schappi, G. F., Suphioglu, C., Taylor, P. E., Knox, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concentrations+of+the+major+birch+tree+allergen+Bet+v+1+in+pollen+and+respirable+fine+particles+in+the+atmosphere.">Concentrations of the major birch tree allergen Bet v 1 in pollen and respirable fine particles in the atmosphere.</a> J Allergy Clin Immunol. 100 (5), 656-661 (1997).</li><li>Buters, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+allergen+Bet+v+1+in+fractions+of+ambient+air+deviates+from+birch+pollen+counts.">The allergen Bet v 1 in fractions of ambient air deviates from birch pollen counts.</a> Allergy. 65 (7), 850-858 (2010).</li><li>Buters, J. T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Release+of+Bet+v+1+from+birch+pollen+from+5+European+countries.+Results+from+the+HIALINE+study.">Release of Bet v 1 from birch pollen from 5 European countries. Results from the HIALINE study.</a> Atmos Environ. 55, 496-505 (2012).</li><li>Ormstad, H., Johansen, B. V., Gaarder, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airborne+house+dust+particles+and+diesel+exhaust+particles+as+allergen+carriers.">Airborne house dust particles and diesel exhaust particles as allergen carriers.</a> Clin Exp Allergy. 28 (6), 702-708 (1998).</li><li>Brough, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peanut+protein+in+household+dust+is+related+to+household+peanut+consumption+and+is+biologically+active.">Peanut protein in household dust is related to household peanut consumption and is biologically active.</a> J Allergy Clin Immunol. 132 (3), 630-638 (2013).</li><li>Jochner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seasonal+variation+of+birch+and+grass+pollen+loads+and+allergen+release+at+two+sites+in+the+German+Alps.">Seasonal variation of birch and grass pollen loads and allergen release at two sites in the German Alps.</a> Atmos Env. , (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Een kritische stap van het protocol is het gebruik van een geschikt filter voor het verzamelen van PM10 deeltjes uit de lucht (zie stap 1,1). Het filter sterk genoeg te verduren poetsen met een elektrische tandenborstel te zijn, en niet alle filtermaterialen voldoen aan deze eis. De kleuring protocol werd opgericht met een PM10 deeltjes concentratie van 8x10 6 deeltjes per ml. Maar als het materiaal is beperkt en bundeling van de monsters niet geschikt is, zal de methode waarschijnlijk zo goed functioneren, maar het antilichaam concentraties (zie stap 3.5 en 3.8) zou moeten worden aangepast. Bet v 1 kleuring van PM10 niet tot verschillende populaties van positief en negatief gekleurde deeltjes. Dit kan veroorzaakt worden door verschillende hoeveelheden van Bet v 1 allergeen geadsorbeerd aan elk van de deeltjes van zeer kleine tot grote hoeveelheid. Dit zou kunnen leiden tot de uitbreiding van de APC signaal waardoor de bevolking richting verschuivenAPC positiviteit. Aangezien het moeilijk is de positieve scheiden van de negatieve deeltjes werden twee kwantificeringsmethoden gebruikt om de verschillen in het Bet v 1 inhoud van de PM10&gt; 0,5 specimens bepalen: (i) relatieve kwantificatie door meting van de gemiddelde APC fluorescentie-intensiteit van alle deeltjes en (ii) het bepalen van het percentage APC positieve deeltjes. Ten aanzien van de Bet v 1 lading van deeltjes uit lage en hoge pollenseizoen PM10&gt; 0.5, beide methoden openbaarde vergelijkbare resultaten. Toch is relatieve kwantificatie van gemiddelde fluorescentie-intensiteit van alle deeltjes aanbevolen omdat het onafhankelijk is van het plaatsen van de poort en daardoor waarschijnlijk minder foutgevoelig. Tot op heden zijn veel studies onderzoekt de allergeen-gehalte in de lucht zwevende deeltjes door het extraheren van het betreffende allergeen en de daaropvolgende kwantificatie met ELISA 5,12-14,17. Er is een fundamenteel verschil tussen de hier beschreven werkwijze en de quantification met ELISA ELISA kwantificeert het geëxtraheerd en opgelost antigen, terwijl doorstroomcytometrie analyseert de deeltjes gebonden antigeen. Door middel van ELISA het Bet v 1 belasting van de geteste PM10 monsters (n = 8) was beneden de detectiegrens van 1,2 ng / ml (gegevens niet getoond). Evenzo Buters en anderen die geen Bet v 1 in de PM &lt;2,5 urn fractie en slechts ongeveer 7% in de 10 urn&gt; PM&gt; 2,5 urn fractie, maar meer dan 93% in de PM&gt; 10 urn fractie van omgevingslucht 13. De contrasterende resultaten van de ELISA enerzijds en de FACS analyse anderzijds, kan worden veroorzaakt door verschillen in de detectiemethode samen met uiteenlopende gevoeligheid. Verder onderzoek is echter nodig om volledig te begrijpen dit verschil. Werkwijze voor visualiseren deeltjes gebonden antigeen scanning elektronenmicroscopie 10,14. Door scanning elektronenmicroscopie Ormstad et al. Gevisualiseerd Bet v 1 op het oppervlak van gesuspendeerde deeltjes matter roetdeeltjes bemonsterd in de hoge pollen seizoen en in mindere mate op de deeltjes bemonsterd in de lage pollenseizoen 15. Bovendien allergenen van pollen, latex en ook β-glucanen bleken adsorberen met verbrandingsdeeltjes in de lucht 10. Deze methode is echter niet kwantificering van de deeltjes gebonden allergeen mogelijk. Door gebruik van flowcytometrie kan deeltjesgebonden Bet v 1 allergeen worden gekwantificeerd. Aldus flowcytometrie kan een nieuwe manier om de 10-0,5 urn biologische fractie van PM10 karakteriseren met andere geschikte antilichamen op kant bieden, kan deze werkwijze worden uitgebreid tot het detecteren van andere antigenen op omgevingslucht deeltjes, bijvoorbeeld schimmels, huisstofmijt allergenen of LPS. PM10 deeltjes adsorberen niet alleen biologisch materiaal, maar ook chemicaliën en metalen vrij gemakkelijk, aspecifieke binding van antilichamen kan echter een probleem vormen. Als een nieuw antilichaam wordt getest, een cruciale stap is specifieke binding bewijzening. Dit kan door bijvoorbeeld blokkeren van de bindingscapaciteit van het antilichaam met het overeenkomstige antigeen voorafgaand aan kleuring 11. Zoals Bet v 1 inhoud van de lucht kan afwijken van berkenpollen count 12,13,18, kan allergische symptomen misschien beter correleren met allergeen niveau dan met stuifmeel tellen 14,18. Vandaar dat de gepresenteerde methode in combinatie met klinische gegevens in staat stelt om te onderzoeken in toekomstige experimenten of allergische reacties op berk overeenkomen met de Bet v 1 allergeen belasting van PM10&gt; 0,5.

Luchtverontreiniging wordt beschouwd als een belangrijke milieu-oorzaak van de verhoogde incidentie en de ernst van de luchtwegen allergieën waargenomen in de afgelopen decennia 1-3. Bovendien was er toenemende belangstelling voor de verspreiding van gemeenschappelijke allergenen stof 4,5. Berkenpollen kan hooikoorts veroorzaken, maar kan ook een belangrijke oorzaak van allergische astma 6-8 zijn. Hele berkstuifmeel waarschijnlijk niet het lagere ademhalingskanaal voeren of te vinden in PM10 als gevolg van zijn grootte (22 pm in diameter). Echter, berkenpollen allergenen zoals Bet v 1, de belangrijkste berkenpollen allergeen component, worden vrijgegeven na pollen breuk 9 en kan binden aan de lucht deeltjes 10, dus misschien geeft u de onderste luchtwegen. Inderdaad is aangetoond dat PM10 biologisch actieve allergenen zoals aangetoond door in vitro activatie van basofielen uit pollen allergische proefpersoon 11 kan bevatten </sup&gt;. Bet v 1 allergeengehalte in PM10 monsters werd onderzocht door het extraheren van de betreffende allergeen en daaropvolgende kwantificatie met ELISA 12-14. Met de ELISA techniek werd opgelost allergeen gemeten, maar de hoeveelheid allergeen geladen deeltjes bleef onbekend. Scanning elektronenmicroscopie openbaarde-allergeen geladen deeltjes maar kwantificering 10,15 niet toe. Deze studie maakt gebruik van stromingscytometrie met het deel van Bet v 1-PM10 geladen deeltjes in de lucht monsters te kwantificeren. Door de detectiegrens van de stromingscytometer enige deeltjes groter dan 0,5 urn kunnen worden onderzocht. De&gt; 0,5 urn fractie van PM10 zal verder worden aangeduid als PM10&gt; 0,5.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="645">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Teflon filter</td>
			<td style="width:143px;">Pall Life Sciences, USA</td>
			<td style="width:119px;">R2PL047</td>
			<td style="width:167px;">47 mm, 1.0 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">low volume sampler&#160;</td>
			<td>Sven Leckel Ingenieur B&#252;ro GmbH, Germany</td>
			<td style="width:119px;">LVS3</td>
			<td>air flow of 2.3 m3/h</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phosphate-buffered saline</td>
			<td style="width:143px;">Biochrom, Germany</td>
			<td style="width:119px;">L1825</td>
			<td>without Ca/Mg, low endotoxin</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">electrical toothbrush&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Braun, Germany</td>
			<td style="width:119px;">Oral-B Vitality Sensitive</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Casy cell counter&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Sch&#228;rfe System GmbH, Germany</td>
			<td style="width:119px;">Model TTC</td>
			<td>range of detectable particle size: 0.7 &#181;m to 45 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">FACSCanto II&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Becton Dickinson, USA</td>
			<td style="width:119px;">3-laser, 8-color (4-2-2)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FACS Diva Software v6.1.3&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">bovine serum albumin (BSA)&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td style="width:119px;">A2153-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">monoclonal mouse IgG1 antibody against Bet v 1</td>
			<td style="width:143px;">Indoor Biotechnologies, UK</td>
			<td style="width:119px;">&#160;MA-3B4</td>
			<td style="width:167px;">clone MA-3B4</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">APC (Allophycocyanin)-labeled secondary anti-Mouse IgG1 antibody&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Becton Dickinson</td>
			<td align="right" style="width:119px;">560089</td>
			<td>clone A85-1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">SPSSTM software version 18&#160;</td>
			<td style="width:143px;">PASW Statistics 18, Hongkong, China</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petri Dish</td>
			<td style="width:143px;">Gosselin, France</td>
			<td style="width:119px;">BP50-02</td>
			<td>D 55mm, H 15mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">FACS Tube&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Becton Dickinson, USA</td>
			<td style="width:119px;">REF 352054</td>
			<td>5ml Polystyrene</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CASYton</td>
			<td style="width:143px;">Roche 
			Germany</td>
			<td style="width:119px;">REF 05651808001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Matrix Blank Tubes</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Scientific, USA</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4140</td>
			<td>1,4 ml, PP</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:143px;">Heraeus, Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Megafuge 40R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Vacuum Pump</td>
			<td style="width:143px;">INTEGRA Biosciences AG, Switzerland</td>
			<td style="width:119px;">Model 158 320</td>
			<td>Inetrgra Vacusafe</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">recombinant Bet v 1a antigen&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Indoor Biotechnologies, UK</td>
			<td style="width:119px;">LTR-BV1A-1</td>
			<td>Concentration:&#160; 2.0 mg/ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometric analysis of particle-bound bet v 1 allergen in pm10

Flowcytometrie is een werkwijze op grote schaal gebruikt op gesuspendeerde stoffen zoals cellen of bacteriën in een groottebereik van 0,5 tot enkele tientallen micrometer kwantificeren. Naast een karakterisering van voorwaartse en zijwaartse verstrooiing eigenschappen, het maakt gebruik van fluorescent gemerkte merkers achtige antilichamen met respectieve structuren te detecteren. Het gebruik van indirecte antilichaam kleuring, flowcytometrie wordt hier gebruikt om berkenpollen allergeen kwantificeren (precies Bet v 1)-geladen deeltjes van 0,5 tot 10 micrometer in diameter in inhaleerbare deeltjes (PM10, deeltjesgrootte ≤10 micrometer in diameter). PM10 deeltjes kunnen fungeren als drager geadsorbeerde allergenen eventueel te transporteren naar de onderste luchtwegen, waar ze allergische reacties kunnen veroorzaken. Tot dusver is de allergeengehalte van PM10 is bestudeerd door middel van enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA&#39;s) en scanning elektronenmicroscopie. ELISA meet de opgeloste en niet het deeltje-gebonden allergeen. Vergeleken met scanning elektronenmicroscopie, te visualiseren allergeen geladen deeltjes flowcytometrie mogelijkheid om extra kwantificeren. Als allergeen gehalte van de lucht kan afwijken van berkenpollen tellen, kan allergische symptomen misschien beter correleren met blootstelling aan allergenen dan met stuifmeel tellen. Samen met klinische gegevens, de onderhavige methode biedt de mogelijkheid om te testen in toekomstige experimenten of allergische reacties op berk pollen antigenen zijn geassocieerd met de Bet v 1 allergeen gehalte PM10 deeltjes&gt; 0,5 urn.

Bet v 1 allergeen adsorptie PM10&gt; 0,5 deeltjes werd gekwantificeerd door indirecte antilichaam kleuring en daaropvolgende analyse op een flowcytometer. Een PM10 monster van hoge pollen seizoen diende als template. Zoals vermeld in stap 3.1, de negatieve controle bestond uit PM10-deeltjes geïncubeerd met APC-gelabeld secundair antilichaam alleen (figuur 3A). PM10-deeltjes gekleurd met anti-Bet v 1 antilichaam plus secundair antilichaam verschijnt het allergeen geladen deeltjes (Figuur 3B). Zoals beschreven in stap 4,3, werden twee manieren kwantificeren allergeenbelasting gebruikt: enerzijds, de mediaan van de APC fluorescentie-intensiteit van alle deeltjes werd geanalyseerd waarbij 137 voor de negatieve controle en 904 voor het specifieke monster. Anderzijds, het percentage deeltjes met gebonden anti-Bet v 1-antilichaam werd bepaald: Een poort is rondom de APC positieve deeltjes in de negatieve controle en vervolgens copied en geplakt in de specifieke monster. In de negatieve controle, 3% van de PM10&gt; 0,5 deeltjes werden als APC positief. Dit percentage valse positieve deeltjes werd afgetrokken van het percentage positieve deeltjes in de specfieke hetgeen resulteert in 77,5% APC positieve PM10&gt; 0,5 deeltjes in het specifieke monster. Om te bewijzen dat de waargenomen binding van de anti-Bet v 1-antilichaam was specifiek, werd bindingscapaciteit geblokkeerd met het overeenkomstige antigeen voorafgaand aan kleuring. Deze verminderde binding van het anti-Bet v 1-antilichaam met 69% indien gekwantificeerd door APC fluorescentie intensiteit, en 84% indien gekwantificeerd door percentage van Bet v 1 positieve PM10&gt; 0,5 deeltjes (Figuur 3C). <img alt="figuur 3" src="/files/ftp_upload/54721/54721fig3.jpg" /> Figuur 3.-Particle gebonden Bet v 1 allergeen kan worden gevisualiseerd door middel van flowcytometrie. APC fluorescentie-intensiteit van een PM10 monster van high pollen seizoen gekleurd alleen de APC gemerkt secundair antilichaam (A), gekleurd met anti-Bet v 1 primair antilichaam en vervolgens met de APC gemerkt secundair antilichaam (B), en na het blokkeren van het primaire antilichaam met recombinant Bet v 1-antigeen (C ). De poort P APC + is ingesteld rond de deeltjes beschouwd APC positief (rood weergegeven) en de respectieve percentages worden gegeven. Dit cijfer is enigszins gewijzigd ten opzichte van 11. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54721/54721fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> Om te testen of deze methode kan worden vastgesteld om de verschillen in de hoeveelheid geadsorbeerd Bet v 1 inhoud van PM10&gt; 0,5 monsters van hoge en lage pollen seizoen onthullen, 13 PM10 monsters van hoog en 6 PM10 monsters van lage pollen seizoen geanalyseerd. Figuur 4toont significante verschillen in de APC fluorescentie-intensiteit en in de verhouding van Bet v 1 positieve PM10&gt; 0,5 deeltjes van PM10 monsters van hoge pollenseizoen in vergelijking met PM10 monsters van lage pollenseizoen. Beide kwantificeringsmethoden wordt toonde vergelijkbare resultaten. <img alt="figuur 4" src="/files/ftp_upload/54721/54721fig4.jpg" /> Figuur 4. PM10 monsters van lage en hoge pollenseizoen verschillen in de hoeveelheid geadsorbeerd Bet v 1. Weinig pollen seizoen PM10 werd bemonsterd in de herfst / winter 2013 (n = 6), hoge pollenseizoen PM10 in mei 2012 en 2013 (n = 13). (A) De APC fluorescentie-intensiteit van PM10&gt; 0,5 deeltjes uit hoge pollenseizoen was significant hoger dan van lage pollenseizoen (mediaan / min / max hoge pollen seizoen: 796/313/1097; mediaan / min / max lage pollen seizoen: 197 / 85/277). (B) PM10 van hoge pollen seizoen bevatte significanTLY meer Bet v 1-positieve PM10&gt; 0,5 deeltjes dan PM10 uit lage pollenseizoen (mediaan / min / max hoge pollen seizoen: 45,2 / 18,5 / 74,5; mediane / min / max laag pollenseizoen: 11,8 / 4,4 / 19,8). Boxplots tonen mediane waarden (binnenste lijn van de doos), 25. en 75. percentielen, respectievelijk (onderste en bovenste grenzen van de doos) en de minimale en maximale waarden (snorharen). *** P &lt;0,001 versus lage pollenseizoen, Mann Whitney U test. Dit cijfer is enigszins gewijzigd ten opzichte van 11. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54721/54721fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10 at JoVE.com

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Hier presenteren we een protocol-allergeen geladen deeltjes kwantificeren flowcytometrie. Zwevende deeltjes deeltjes kunnen fungeren als dragers geadsorbeerd allergenen. We tonen hier dat flowcytometrie, een werkwijze op grote schaal gebruikt op gesuspendeerde stoffen te karakteriseren&gt; 0,5 pm in diameter, kan worden gebruikt om deze allergeen geladen deeltjes te verrichten.

Flow cytometrische analyse van deeltjes gebonden Bet v 1 allergeen in PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Murine Model of Allergen Induced Asthma

Muizenmodel van Allergen Induced Astma

Asthma is a major cause of morbidity and mortality, affecting some 300 million people throughout the world.1 More than 8% of the US population has asthma, ...

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

Whole-dierlijke Imaging en Flowcytometrische technieken voor analyse van antigeen-specifieke CD8 + T cel reacties na Nanoparticle Vaccinatie

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Isolatie en Flow cytometrische analyse van de immuuncellen van de ischemische hersenen van muizen

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

Isolatie en Flow cytometrische analyse van Glioom infiltreren perifere mononucleaire bloedcellen

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

Isolatie en Flowcytometrische karakterisatie van muizen dunne darm lymfocyten

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

Flow cytometrische analyse van de NK-cel lytische activiteit in humaan volbloed

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

Isolatie en Flow cytometrische analyse van Human Endocervicale Gamma Delta T-cellen

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

Spijsvertering van de lymfkliertest lever voor een analyse van de cytometrische stroom van lymfatische endotheliale cellen

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...

Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To Fc&#947;R Cross-linking

Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To FcÃƒÅ½Ã‚Â³R Cross-linking

Cytometrische Stroommeting van ROS productie In macrofagen In reactie op FcγR dwarsbinding

The oxidative or respiratory burst is used to describe the rapid consumption of oxygen and generation of reactive oxygen species (ROS) by phagocytes in ...

Multi-scale Analysis of Bacterial Growth Under Stress Treatments

Multi-Scale analyse van bacteriële groei onder stress behandelingen

Analysis of the bacterial ability to grow and survive under stress conditions is essential for a wide range of microbiology studies. It is relevant to ...