Name: flow cytometric analysis of particle-bound bet v 1 allergen in pm10
Uploaded: 2016-11-19T13:00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10 at JoVE.com

The authors would like to thank Katrin Bossmann, Anett Neumann and Eike Wolter (German Environment Agency) for their valuable preparatory work.

הערה: פרוטוקול זה מתאר את המכתים העקיף של חלקיקי PM10 עם נוגדנים חד שבטיים (נוגדן IgG1 עכבר חד שבטי, שיבוט MA-3B4) נגד בית V 1, רכיב אנטיגן האבקה הלבנה הגדול, בתוספת Allophycocyanin (APC) -labeled נוגדנים משני (אנטי נוגדן IgG1 -Mouse, שיבוט A85-1) ואת לניתוח שלאחר מכן על cytometer זרימה. עם נוגדנים אחרים מתאימים זמין, ששיטה זו עשויה להתארך עד זיהוי של אנטיגנים אחרים מאוגדים חלקיקים באוויר סביבה. 1. PM10 דגימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף PM10 מאוויר סביבה על polytetrafluoroethylene (PTFE) מסננים באמצעות סמפלר בנפח נמוכה עם קצב זרימה של 2.3 מ &#39;3 / hr (איור 1). אפיון של סמפלר המשמש בניסויים שתוארו כאן נמצא 16. משך הקרנה תלויה בכמות של PM10 צורך (בדרך כלל בין 1 ל -10 ימים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסוף זמן הדגירה, להסיר את המסנן מן סמפלר ולהקפיא אותו-20 ° C עד השימוש. </li></ol><img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54721/54721fig1.jpg" /> איור 1. סמפלר PM10 נפח נמוך. דוגמה של סמפלר PM10 בנפח נמוך. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54721/54721fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> הסרת 2. PM10 ו רוזן חלקיקים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בוא ההפשרה המסננת PTFE כ -5 דקות. לאחר מכן, לשים את המסנן בצלחת נקייה polystyrol פטרי (איור 2 א). קח מנה חדשה פטרי עבור כל מסנן, אם יותר מסנן אחד מעובד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהמשך לכך, כיסוי מסנן PTFE עם פוספט שנאגר מלוח (PBS). פרוטוקול זה הוא הוקם עבור ריכוז PM10 סופי של 8x10 6 חלקיקים לכל מיליליטר (ראה שלב 3.3). כדי להשיג לפחות ריכוז, השתמש הנפח האמפירי הבא של PBS כדי כיסוי מסנן עם: אם זמן איסוף PM10 היה &lt;<html> 2 ימים, להשתמש 2 מ&quot;ל. לקבלת פעמים הדגירה ≥2 ימים, השתמש 4 מ&quot;ל. הערה: על מנת להגדיל את ריכוז החלקיקים של ההשעיה PM10, השעיות מן מסננים שונים ניתן לאחד קבוצות, אם זה מתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק את מסנן PTFE עם פינצטה מברשת עם מברשת שיניים חשמלית עם ראש מברשת רגיש דקות 1 (2B הדמוי, 2C). מעביר את השעית חלקיקים-PBS, כינה להלן השעית PM10, לצינור תגובה נקי. </li></ol><img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54721/54721fig2.jpg" /> הסרת איור 2. PM10 עם מברשת שיניים חשמלית. מסנן polytetrafluoroethylene עם PM10 שנדגמו מושם בצלחת פטרי polystyrol (א) ו נשכבות עם 4 מ&quot;ל PBS. לאחר מכן, PM10 יוסר עם מברשת שיניים חשמלית (B: לפני צחצוח ו- C: לאחר צחצוח דקות 1).= &quot;Http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54721/54721fig2large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את הריכוז של חלקיקי PM10, למשל, על ידי שימוש מונה חלקיקים. לדלל נפח נאות השעית PM10 כגון 50 μl ב 10 מיליליטר חיץ מדידת איזוטוני, למדוד שלוש פעמים ולחשב את המספר כולל ממוצע של חלקיקים לכל מיליליטר. הקפד להשתמש מונה חלקיקים אשר יכול לזהות חלקיקים בגודל הרלוונטי. </li></ol> 3. בית V 1 מכתים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את מספר צינורות תגובה הנדרש לניתוח של המדגם: לפחות שלושה צינורות תגובה נדרשים: (i) צינור אחד עם מדגם בלבד (שליטה מקורית) (ii) צינור אחד עם מדגם בתוספת נוגדנים משני (שליטה שלילית), ו ( iii) צינור אחד עם מדגם בתוספת נוגדנים ראשוניים ומשניים (מדגם מסוים). אם נמדד לראשונה, להכין לפחות שני צינורות תגובה (i) (ii),וכן (iii) יש מספיק חומר כדי להתאים cytometer הגדרות כראוי (ראה שלב 4.1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את כמות ההשעיה PM10 נדרש עבור מספר צינורות התגובה. כל צינור תגובה דורש 50 μl של השעיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את ריכוז החלקיקים הנמדדים בשלב 2.4 עבור הנפח של השעיה מחושבת בשלב 3.2 לריכוז סופי של 8x10 6 חלקיקים לכל מיליליטר ידי הוספת כמות מתאימה של PBS. הערה: השעיית PM10 הנותרים ניתן קפוא ב -20 מעלות צלזיוס במשך בניסויים עתידיים, אם כי עבור פרוטוקול זה מוכן טרי השעית PM10 מומלצת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלוק מחייב נוקבים ידי להשלים את ההשעיה PM10 עם אלבומין בסרום שור (BSA) בריכוז סופי של 0.02%, באמצעות פתרון המניה כגון 1% BSA מוכן עם PBS. וורטקס בקצרה דגירה במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל דגימה להיות מנותחת על ידי cytometry זרימה, להעביר 50 μl של ההשעיה משלב 3.4 ל ACצינור תגובה רזה. הוספת נוגדן מונוקלונאלי כנגד העכבר נ בית 1 בריכוז סופי של 0.02 מיקרוגרם / μl אל צינורות התגובה המיועד מכתים ספציפיים, בקצרה מערבולת דגירה במשך 60 דקות בטמפרטורת החדר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תנו צינורות תגובה עם ההשעיה PM10-BSA המיועדים לשליטה יליד הביקורת השלילית גם להישאר במשך 60 דקות בטמפרטורת החדר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את כל דגימות על ידי הוספת 500 μl PBS בתוספת BSA 0.02% צינור כל תגובה, בקצרה מערבולת ו צנטריפוגות ובהמשך דגימות ב 4,700 XG במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. בטל supernatant בזהירות באמצעות משאבת ואקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 3.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את הסכום הכולל של נוגדן IgG1 אנטי עכבר משני שכותרתו APC הדרוש: 1 מיקרוגרם נוגדן מומס 50 μl PBS בתוספת BSA 0.02% לכל צינור התגובה. לדלל את הכמות המתאימה של נוגדן עם נפח בהתאמה של PBS בתוספת 0.02% BSA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של נוגדנים משני מדוללים לכל צינורות התגובה למעט צינור התגובה המיועדים לשליטת הילידים. מוסף האחרון עם 50 μl PBS בתוספת 0.02% BSA. וורטקס כל הדגימות למשך מספר שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה כל הדגימות במשך 30 דקות בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 3.6 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl PBS לתגובה כל צינור, מערבולת ולנתח דגימות על cytometer זרימה. </li></ol> ניתוח 4. תזרים Cytometric <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בשלט הילידים, לשנות את ההגדרות הבאות cytometer פרמטרים כדי לייעל ניתוח נתונים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות פיזור קדימה (FSC) בקר סף מוצג על לוח הבקרה של התקן, לקבוע את סף FSC לפי השווי הנמוך ביותר (200) ולהתחיל את הניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות בקר מתח פיזור, להתאים את FSC ולפזר צידה (SSC) ככה שכל חלקיקי PM10 ניתן לאתר שהאוכלוסייה של חלקיקים ממוקמות בערך הבאמצע הדואר של ציר FSC ובמחצית התחתון של ציר SSC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות בקר מתח הקרינה, להתאים את מתח APC ועוד מתח הקרינה כמו isothiocyanate והעמסת (FITC), אשר אינו פולט בבית באותו אורך גל כמו APC, במידת הצורך. ודא, שכל החלקיקים גלויים במחצית התחתונה של שני צירי הקרינה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברצף, לבחון כל דגימה כוללת בקרת היליד ולאחסן את FSC, SSC, APC, ונתוני FITC של לפחות 10,000 חלקיקים לדגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך את הנתונים עם התוכנה המתאימה. תוכן האלרגן adsorbed במדגם הספציפי ניתן לכמת בשתי דרכים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את עוצמת הקרינה APC של כל החלקיקים (ערך חציוני) כמדד עומס בית V 1 על כל חלקיקי PM10. הערה: אם המדגם המסוים כלול האלרגן, עוצמת קרינת APC צריכה להגדיל את המדגם המסוים לעומת השליטה השלילית. לעומת זאת, פלואוריד אחרעוצמות escence (למשל., FITC עוצמת הקרינה) לא צריך לשנות באופן משמעותי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב אחוזי חלקיקי PM10 עם נוגדן 1 נ אנטי-Bet כבול. ובכך, בבקרה השלילית, להגדיר שער סביב החלקיקים נחשבים APC חיובית, העתק ודבק השער הזה לתוך המדגם המסוים ולחסר אחוז החלקיקים החיוביים APC בבקרה השלילית אחוז החלקיקים החיוביים אפ&quot;ק המדגם המסוים. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Cakmak, S., Dales, R. E., Coates, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+air+pollution+increase+the+effect+of+aeroallergens+on+hospitalization+for+asthma?.">Does air pollution increase the effect of aeroallergens on hospitalization for asthma?.</a> J Allergy Clin Immunol. 129 (1), 228-231 (2012).</li><li>Barraza-Villarreal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Air+pollution,+airway+inflammation,+and+lung+function+in+a+cohort+study+of+Mexico+City+schoolchildren.">Air pollution, airway inflammation, and lung function in a cohort study of Mexico City schoolchildren.</a> Environ Health Perspect. 116 (6), 832-838 (2008).</li><li>Chen, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+association+of+ambient+air+pollution+with+airway+inflammation+in+schoolchildren.">The association of ambient air pollution with airway inflammation in schoolchildren.</a> Am J Epidemiol. 175 (8), 764-774 (2012).</li><li>Cyprowski, M., Buczynska, A., Szadkowska-Stanczyk, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indoor+allergens+in+settled+dust+from+kindergartens+in+city+of+Lodz,+Poland.">Indoor allergens in settled dust from kindergartens in city of Lodz, Poland.</a> Int J Occup Med Environ Health. 26 (6), 890-899 (2013).</li><li>Brough, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+peanut+protein+in+the+home+environment.">Distribution of peanut protein in the home environment.</a> J Allergy Clin Immunol. 132 (3), 623-629 (2013).</li><li>Galli, S. J., Tsai, M., Piliponsky, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+allergic+inflammation.">The development of allergic inflammation.</a> Nature. 454 (7203), 445-454 (2008).</li><li> World Health Organisation, R. O. f. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenology+and+human+health:+allergic+disorders:+report+on+WHO+meeting+Rome,+Italy.">Phenology and human health: allergic disorders: report on WHO meeting Rome, Italy.</a> , 256 (2003).</li><li>Wuthrich, B., Schindler, C., Leuenberger, P., Ackermann-Liebrich, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+atopy+and+pollinosis+in+the+adult+population+of+Switzerland+(SAPALDIA+study).+Swiss+Study+on+Air+Pollution+and+Lung+Diseases+in+Adults.">Prevalence of atopy and pollinosis in the adult population of Switzerland (SAPALDIA study). Swiss Study on Air Pollution and Lung Diseases in Adults.</a> Int Arch Allergy Immunol. 106 (2), 149-156 (1995).</li><li>Grote, M., Valenta, R., Reichelt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abortive+pollen+germination:+a+mechanism+of+allergen+release+in+birch,+alder,+and+hazel+revealed+by+immunogold+electron+microscopy.">Abortive pollen germination: a mechanism of allergen release in birch, alder, and hazel revealed by immunogold electron microscopy.</a> J Allergy Clin Immunol. 111 (5), 1017-1023 (2003).</li><li>Namork, E., Johansen, B. V., Lovik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+allergens+adsorbed+to+ambient+air+particles+collected+in+four+European+cities.">Detection of allergens adsorbed to ambient air particles collected in four European cities.</a> Toxicol Lett. 165 (1), 71-78 (2006).</li><li>S&#252;ring, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PM10+contains+particle-bound+allergens:+Dust+analysis+by+Flow+Cytometry.">PM10 contains particle-bound allergens: Dust analysis by Flow Cytometry.</a> Env Technol Inn. 5, 60-66 (2016).</li><li>Schappi, G. F., Suphioglu, C., Taylor, P. E., Knox, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concentrations+of+the+major+birch+tree+allergen+Bet+v+1+in+pollen+and+respirable+fine+particles+in+the+atmosphere.">Concentrations of the major birch tree allergen Bet v 1 in pollen and respirable fine particles in the atmosphere.</a> J Allergy Clin Immunol. 100 (5), 656-661 (1997).</li><li>Buters, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+allergen+Bet+v+1+in+fractions+of+ambient+air+deviates+from+birch+pollen+counts.">The allergen Bet v 1 in fractions of ambient air deviates from birch pollen counts.</a> Allergy. 65 (7), 850-858 (2010).</li><li>Buters, J. T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Release+of+Bet+v+1+from+birch+pollen+from+5+European+countries.+Results+from+the+HIALINE+study.">Release of Bet v 1 from birch pollen from 5 European countries. Results from the HIALINE study.</a> Atmos Environ. 55, 496-505 (2012).</li><li>Ormstad, H., Johansen, B. V., Gaarder, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airborne+house+dust+particles+and+diesel+exhaust+particles+as+allergen+carriers.">Airborne house dust particles and diesel exhaust particles as allergen carriers.</a> Clin Exp Allergy. 28 (6), 702-708 (1998).</li><li>Brough, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peanut+protein+in+household+dust+is+related+to+household+peanut+consumption+and+is+biologically+active.">Peanut protein in household dust is related to household peanut consumption and is biologically active.</a> J Allergy Clin Immunol. 132 (3), 630-638 (2013).</li><li>Jochner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seasonal+variation+of+birch+and+grass+pollen+loads+and+allergen+release+at+two+sites+in+the+German+Alps.">Seasonal variation of birch and grass pollen loads and allergen release at two sites in the German Alps.</a> Atmos Env. , (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

שלב קריטי של הפרוטוקול הוא השימוש של מסנן מתאים לאיסוף חלקיקי PM10 מאוויר הסביבה (ראה שלב 1.1). המסנן צריך להיות חזק מספיק כדי לשאת את הצחצוח עם מברשת שיניים חשמלית, ולא כל חומרי הסינון למלא דרישה זו. הפרוטוקול המכתים הוקם עם ריכוז חלקיקי PM10 של 8x10 6 חלקיקים לכל מיליליטר. עם זאת, אם החומר הוא מוגבל ואיגום של דגימות אינו מתאים, השיטה כנראה תתפקד כמו גם, אבל ריכוזי הנוגדנים (רואים צעדים 3.5 ו -3.8) אולי צריך להיות מותאמים. מכתים בית V 1 של חלקיקי PM10 לא לגרום אוכלוסיות נפרדות של חלקיקים מוכתמים לחיוב ולשלילה. זה עלול להיגרם על ידי כמויות משתנות של האלרגן בית V 1 שנספחו כל החלקיקים הנעים בין מעט מאוד עד לסכום גבוה. דבר זה עלול לגרום להרחבת האות APC ובכך להסיט את האוכלוסייה כלפיחיוביות APC. כמו שקשה להפריד את החיובי מן החלקיקים השליליים, שתי שיטות כימות שמשו כדי לקבוע את ההבדלים בתוכן בית V 1 של דגימות PM10&gt; 0.5: (i) כימות יחסית על ידי מדידת עוצמת קרינת APC החציוני של כל החלקיקים , וכן (ii) קביעת אחוז חלקיקים חיוביים APC. לגבי העמסת בית V 1 של חלקיקים מן PM10 עונת אבקה נמוכה וגבוהה&gt; 0.5, שתי השיטות חשפו תוצאות דומות. ובכל זאת, כימות יחסית על ידי עוצמת קרינה החציונית של כל החלקיקים מומלצות כפי שהוא אינו תלוי צבת השער ולכן כנראה פחות מועדות לטעויות. עד כה מחקרים רבים לבדוק את תוכן האלרגן של חומר חלקיקי באוויר הסביבה על ידי לחילוץ האלרגן בהתאמה וכימות הבאים עם ELISA 5,12-14,17. יש הבדל מהותי בין ההליך המתואר כאן ואת quantification עם ELISA: ELISA מכמת את אנטיגן החילוץ המומס, cytometry הזרימה מנתח את אנטיגן מאוגד-החלקיק. באמצעות ELISA העומס בית V 1 של דגימות PM10 נבדק (n = 8) היה מתחת לגבול הגילוי של 1.2 ng / ml (מידע לא מוצג). באופן דומה, Buters ואחרים לא זיהו נ בית 1 PM &lt;2.5 מיקרומטר שבריר ורק כ -7% ב -10 מיקרומטר&gt; PM&gt; 2.5 מיקרומטר שבר, אבל יותר מ -93% ב PM&gt; 10 מיקרומטר שבריר באוויר הסביבה 13. התוצאות המנוגדות של ELISA מחד ועל הניתוח FACS מצד השני, עלולות להיגרם על ידי הבדלי שיטת זיהוי בשיתוף עם רגישות מסתעפת. מחקר נוסף עם זאת יש צורך באופן מלא להבין את ההבדל הזה. שיטה לדמיין אנטיגן חלקיקים נכנסים הוא מיקרוסקופיית אלקטרונים 10,14. על ידי סריקה מיקרוסקופית אלקטרונים, Ormstad et al. בית דמיינו V 1 על פני השטח של מט חלקיקי מרחףחלקיקי פיח r שנדגמו עונת האבקה הגבוהה ובמידה פחותה על חלקיקים שנדגמו עונת האבקה הנמוכה 15. בנוסף, אלרגנים מאבקני, לטקס וגם β-glucans נמצאו שנספחו חלקיקים בעירה באוויר הסביבה 10. שיטה זו, לעומת זאת, אינה מאפשרת כימות של האלרגן כבול-החלקיק. על ידי שימוש cytometry הזרימה, v בית נכנס חלקיקי האלרגן 1 יכול להיות לכימות. לפיכך, cytometry זרימה עשויה להציע דרך חדשה לאפיין 10 עד 0.5 מיקרומטר החלק הביולוגי של PM10 כמו עם נוגדנים מתאימים אחרים על יד, ששיטה זו עשויה להתארך עד זיהוי של אנטיגנים אחרים על חלקיקים באוויר סביבה, למשל, עובש, קרדית האבק אלרגנים או LPS. כחלקיקים PM10 לספוג לא חומר ביולוגי בלבד, אלא גם כימיקלים ומתכות די בקלות, מחייב נוקבים של נוגדנים יכול, לעומת זאת, מהווה בעיה. אם נוגדן חדש נבחן, צעד קריטי הוא להוכיח לאגד ספציפיing. ניתן לעשות זאת על ידי, למשל, חוסמת את קיבולת המחייב של הנוגדן הספציפי עם האנטיגן המקביל לפני מכתים 11. כמו בית V 1 תוכן של אוויר הסביבה יכול להיות שונה ספירת אבקה לבנה 12,13,18, תופעות אלרגיות שאולי לתאם טוב יותר עם רמת האלרגנים מאשר עם אבקה לספור 14,18. לפיכך, השיטה המוצגת בשיתוף עם נתונים קליניים מאפשרת לבחון בניסויים עתידיים אם תגובות אלרגיות ליבנה מתאימות עומס האלרגן בית V 1 של PM10&gt; 0.5.

זיהום אוויר נשקל בתור גורם סביבתי חשוב של השכיחות המוגברת וחומרת האלרגיות של דרך נשימה נצפו בעשורים האחרונים 1-3. כמו כן, חל העניין הגובר בחלוקת אלרגנים נפוצים 4,5 אבק. אבקה ליבנה יכול לעורר קדחת השחת אבל גם יכול להוות טריגר חשוב של אסטמה אלרגית 6-8. אבקה לבנה כולה אינו צפוי להיכנס בדרכי הנשימה התחתונות או להימצא PM10 כתוצאה גודלו (22 מיקרומטר קוטר). עם זאת, אלרגנים אבקה לבנה כמו בית V 1, המרכיב העיקרי ליבנה אבקה האלרגן, יכול להשתחרר אחרי אבקה קרע 9 והוא יכול להיקשר חלקיקים באוויר הסביבה 10, ובכך אולי להיכנס דרכי הנשימה הנשימה התחתונות. ואכן, הוכח כי PM10 עשוי להכיל אלרגנים פעילים ביולוגית כפי שהוכח על ידי במבחנה ההפעלה של basophiles מתוך proband אבקה אלרגיות 11 </sup&gt;. בית V 1 תוכן האלרגן בדגימות PM10 נחקרה על ידי לחילוץ האלרגן בהתאמה וכימות הבאים עם ELISA 12-14. בעזרת טכניקת ELISA, האלרגן המומס נמדד, אבל כמות חלקיקים טעון האלרגן עדיין לא הייתה ידועה. במיקרוסקופ אלקטרונים סורק גילה חלקיקים טעונים האלרגן, אך לא איפשרו כימות 10,15. מחקר זה מעסיק cytometry זרימה לכמת את שיעור v בית 1 טעון חלקיקי PM10 בדגימות אוויר סביבה. בשל גבול הגילוי של cytometer את הזרימה רק חלקיקים גדולים יותר מ -0.5 מיקרומטר יכול להיבחן. &gt; 0.5 מיקרומטר שבריר PM10 יכונה בהמשך כמו PM10&gt; 0.5.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="645">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Teflon filter</td>
			<td style="width:143px;">Pall Life Sciences, USA</td>
			<td style="width:119px;">R2PL047</td>
			<td style="width:167px;">47 mm, 1.0 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">low volume sampler&#160;</td>
			<td>Sven Leckel Ingenieur B&#252;ro GmbH, Germany</td>
			<td style="width:119px;">LVS3</td>
			<td>air flow of 2.3 m3/h</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phosphate-buffered saline</td>
			<td style="width:143px;">Biochrom, Germany</td>
			<td style="width:119px;">L1825</td>
			<td>without Ca/Mg, low endotoxin</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">electrical toothbrush&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Braun, Germany</td>
			<td style="width:119px;">Oral-B Vitality Sensitive</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Casy cell counter&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Sch&#228;rfe System GmbH, Germany</td>
			<td style="width:119px;">Model TTC</td>
			<td>range of detectable particle size: 0.7 &#181;m to 45 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">FACSCanto II&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Becton Dickinson, USA</td>
			<td style="width:119px;">3-laser, 8-color (4-2-2)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FACS Diva Software v6.1.3&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">bovine serum albumin (BSA)&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td style="width:119px;">A2153-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">monoclonal mouse IgG1 antibody against Bet v 1</td>
			<td style="width:143px;">Indoor Biotechnologies, UK</td>
			<td style="width:119px;">&#160;MA-3B4</td>
			<td style="width:167px;">clone MA-3B4</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">APC (Allophycocyanin)-labeled secondary anti-Mouse IgG1 antibody&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Becton Dickinson</td>
			<td align="right" style="width:119px;">560089</td>
			<td>clone A85-1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">SPSSTM software version 18&#160;</td>
			<td style="width:143px;">PASW Statistics 18, Hongkong, China</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petri Dish</td>
			<td style="width:143px;">Gosselin, France</td>
			<td style="width:119px;">BP50-02</td>
			<td>D 55mm, H 15mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">FACS Tube&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Becton Dickinson, USA</td>
			<td style="width:119px;">REF 352054</td>
			<td>5ml Polystyrene</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CASYton</td>
			<td style="width:143px;">Roche 
			Germany</td>
			<td style="width:119px;">REF 05651808001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Matrix Blank Tubes</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Scientific, USA</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4140</td>
			<td>1,4 ml, PP</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:143px;">Heraeus, Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Megafuge 40R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Vacuum Pump</td>
			<td style="width:143px;">INTEGRA Biosciences AG, Switzerland</td>
			<td style="width:119px;">Model 158 320</td>
			<td>Inetrgra Vacusafe</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">recombinant Bet v 1a antigen&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Indoor Biotechnologies, UK</td>
			<td style="width:119px;">LTR-BV1A-1</td>
			<td>Concentration:&#160; 2.0 mg/ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometric analysis of particle-bound bet v 1 allergen in pm10

Cytometry זרימה היא שיטה נפוצה לכמת מוצקים מרחפים כגון תאים או חיידקים במגוון בגודל מ 0.5 עד כמה עשרות מיקרומטר קוטר. בנוסף אפיון של מאפייני פיזור קדימה ולצדדים, היא מאפשרת את שימוש סמנים שכותרתו ניאון כמו נוגדנים לגילוי מבני בהתאמה. באמצעות מכתים נוגדן עקיף, cytometry זרימה מועסק כאן לכמת האלרגן אבקה לבנה (בית בדיוק v 1) -loaded חלקיקים של 0.5 עד 10 מיקרומטר בקוטר של חומר חלקיקי inhalable (PM10, החלקיקים בגודל ≤10 מיקרומטר קוטר). חלקיקי PM10 יכול לשמש נשאים של אלרגנים adsorbed ואולי והובלתם אל דרכי הנשימה התחתונות, שבו יכלו לגרום לאלרגיה. עד כה התוכן האלרגן של PM10 נחקרה באמצעות מבחני immunosorbent מקושר אנזים (ELISAs) במיקרוסקופ אלקטרונים סורק. ELISA מודד את מומס ולא החלקיקהאלרגן -bound. לעומת במיקרוסקופ אלקטרונים סורק, אשר יכול לדמיין חלקיקים טעונים האלרגן, cytometry זרימה ייתכן גם לכמת אותם. כתוכן האלרגן של אוויר הסביבה יכול לסטות ספירת אבקה לבנה, תופעות אלרגיות שאולי לתאם טוב יותר עם החשיפה לאלרגן מאשר עם ספירת אבקה. בשילוב עם נתונים קליניים, השיטה המוצגת מציעה את ההזדמנות כדי לבדוק בניסויים עתידיים אם תגובות אלרגיות ליבנת אנטיגנים אבקה המתקשרות לתוכן האלרגן בית V 1 של חלקיקי PM10&gt; 0.5 מיקרומטר.

בית V 1 ספיחת האלרגן כדי PM10&gt; 0.5 חלקיקים הייתה לכמת ידי מכתים נוגדן עקיף לניתוח שלאחר מכן על cytometer זרימה. מדגם PM10 מהעונה אבקה גבוהה שימש כתבנית. כאמור בשלב 3.1, הביקורת השלילית מורכבת מחלקיקי PM10 מודגרות עם APC שכותרתו נוגדנים משני בלבד (איור 3 א). חלקיקי PM10 מוכתם נוגדן אנטי-Bet V 1 בתוספת נוגדנים משני מוצגים חלקיקים טעונים האלרגן (איור 3 ב). כפי שתואר בשלב 4.3, שתי דרכים לכימות העומס האלרגן שמשו: מצד אחד, הערך החציוני של עוצמת קרינת APC של כל החלקיקים נותח להיות 137 על הבקרה השלילית 904 עבור המדגם המסוים. מצד שני, אחוז חלקיקים עם נוגדן 1 נ אנטי-Bet כבול נקבע: שער נקבע סביב חלקיקים חיוביים APC בבקרה שלילית ובהמשך שיתוףמהמלין ולהדביק לתוך המדגם המסוים. בבקרה השלילית, 3% של חלקיקי PM10&gt; 0.5 נחשבו APC חיובית. אחוז זה של חלקיקי חיובי כוזבים נוכה אחוז החלקיקים החיוביים מדגם המסוים ובכך וכתוצאה מכך PM10 החיובי 77.5% APC&gt; 0.5 חלקיקי המדגם המסוים. כדי להוכיח כי נצפו המחייב של נוגדן V 1-Bet אנטי היה ספציפי, קיבולת מחייב נסתם האנטיגן המקביל לפני מכתים. זה פחתה המחייב של נוגדן anti-Bet נ 1 ב -69%, אם לכמת ידי עוצמת הקרינה APC, ועל ידי 84%, אם לכמת לפי אחוז PM10 חיובי בית V 1&gt; 0.5 חלקיקים (איור 3 ג). <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54721/54721fig3.jpg" /> איור 3. נכנס חלקיקים בית V 1 האלרגן יכול להיות דמיין ידי cytometry זרימה. עוצמת קרינת APC מדגם PM10 מאת Po הגבוההעונת llen מוכתמת רק עם APC שכותרתו נוגדנים משני (א), מוכתמים נ אנטי-Bet 1 הנוגדן ראשוני ולאחר מכן עם APC שכותרתו נוגדנים משני (ב &#39;), לאחר חסימת הנוגדן הראשוני עם אנטיגן 1 v בית רקומביננטי (C ). הנגמ&quot;ש P השער + נקבע סביב החלקיקים הנחשבים חיובי APC (המוצג באדום) ובאחוזים בהתאמה מקבלים. דמות זו שונתה מעט מ -11. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54721/54721fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> כדי לבדוק אם שיטה זו יכולה להיות מאומצת לחשוף הבדלים בכמות התוכן 1 v בית adsorbed של PM10&gt; 0.5 דגימות גבוהות מעונת אבקה נמוכה, 13 דגימות PM10 מגבוהים ו -6 דגימות PM10 מעונת אבקה נמוכה נותחו. איור 4מתאר הבדלים משמעותיים עוצמת קרינת APC ו בשיעור של בית V 1 PM10 החיובי&gt; 0.5 חלקיקים של דגימות PM10 מעונת אבקה גבוהה לעומת דגימות PM10 מעונת אבקה נמוכה. שיטות כימות שני בזאת הראו תוצאות דומות. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/54721/54721fig4.jpg" /> איור 4. דוגמאות PM10 מעונת אבקה נמוכה וגבוהה נבדלות הסכום שלהם נ בית adsorbed 1. PM10 עונת אבקה הנמוך נדגמה בסתיו / חורף 2013 (n = 6), אבקה גבוהה PM10 עונה מאי 2012 ו 2013 (n = 13). (א) עוצמת קרינת APC של PM10&gt; 0.5 חלקיקים מעונת אבקה גבוהה היו גבוה באופן משמעותי מאשר מהעונה אבקה נמוכה (חציון / min / max עונת אבקה גבוהה: 796/313/1097; חציון / min / max עונת אבקה נמוכה: 197 / 85/277). (ב) PM10 מעונת אבקה גבוהה כלול משמעותיtly יותר Bet נ החיובי 1 PM10&gt; 0.5 חלקיקים מ PM10 מעונת אבקה נמוכה (חציון / min / max עונת אבקה גבוהה: 45.2 / 18.5 / 74.5; חציון / min / max עונת אבקה נמוכה: 11.8 / 4.4 / 19.8). מגרשי Box להראות ערכים החציוני (קו פנימי של הקופסה), 25. ו 75. עשירונים, בהתאמה (תחתונים ועליונים גבולות המסגרת) ואת ערכי מינימום ומקסימום (שפם). *** P &lt;0.001 לעומת עונת אבקה נמוכה, מבחן מאן ויטני U. דמות זו שונתה מעט מ -11. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54721/54721fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10 at JoVE.com

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לכמת חלקיקים טעונים האלרגן על ידי cytometry הזרימה. חלקיקי חומר חלקיקי הסביבה עלולים לשמש נשאים של אלרגנים adsorbed. ונביא כאן כי cytometry זרימה, שיטה בשימוש נרחב כדי לאפיין מוצקים מרחפים&gt; 0.5 מיקרומטר קוטר, ניתן להשתמש כדי למדוד חלקיקים אלרגנים טעונות אלו.

ניתוח תזרים Cytometric נ בית נכנס חלקיקים 1 האלרגנים PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Murine Model of Allergen Induced Asthma

דגם Murine של אסטמה אלרגן מושרה

Asthma is a major cause of morbidity and mortality, affecting some 300 million people throughout the world.1 More than 8% of the US population has asthma, ...

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

טכניקות הדמיה כל-החיה והזרימה Cytometric לתגובות ניתוח של אנטיגן ספציפי CD8 + T תא לאחר Nanoparticle חיסון

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

בידוד תזרים Cytometric ניתוח של תאים חיסוניים ממוח עכבר איסכמי

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

בידוד וניתוח תזרים cytometric של תאי הדם ההיקפיים mononuclear הסתננות-Glioma

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

אפיון בידוד תזרים Cytometric של Murine קטנים מעיים לימפוציטים

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

ניתוח תזרים Cytometric של תא הטבעי Killer ממס פעילות דם מלא אנוש

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

ניתוח בידוד תזרים Cytometric של האדם תאים האנדוצרוויקאלית גמא דלתא T

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

העיכול של הכבד מאתר של ניתוח Cytometric זרימת הלימפה תאי אנדותל

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...

Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To Fc&#947;R Cross-linking

Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To FcÃƒÅ½Ã‚Â³R Cross-linking

מדידת Cytometric ROS הייצור ב מקרופאגים בתגובה FcγR cross-linking

The oxidative or respiratory burst is used to describe the rapid consumption of oxygen and generation of reactive oxygen species (ROS) by phagocytes in ...

Multi-scale Analysis of Bacterial Growth Under Stress Treatments

רב היקף ניתוח של צמיחה חיידקים תחת טיפולי סטרס

Analysis of the bacterial ability to grow and survive under stress conditions is essential for a wide range of microbiology studies. It is relevant to ...