Name: flow cytometric analysis of particle-bound bet v 1 allergen in pm10
Uploaded: 2016-11-19T13:00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10 at JoVE.com

The authors would like to thank Katrin Bossmann, Anett Neumann and Eike Wolter (German Environment Agency) for their valuable preparatory work.

Примечание: Этот протокол описывает непрямого окрашивания частиц PM10 с моноклональными антителами (мышиное моноклональное антитело IgG1, клон МА-3B4) против Bet V 1, основной компонент пыльцы березы антигена, плюс аллофикоцианин (APC), меченным вторичным антителом (анти -Мышь антитело IgG1, клон A85-1) и последующий анализ на проточном цитометре. При наличии соответствующих других антител доступны, этот способ может быть распространен на обнаружение других антигенов, связанных с частицами окружающего воздуха. 1. Отбор проб PM10 <ol><li> Сбор PM10 из окружающего воздуха на политетрафторэтилена (PTFE) фильтры с использованием низкого объема пробоотборник со скоростью потока 2,3 м 3 / ч (рисунок 1). Характеристика пробоотборника , используемого для экспериментов , описанных здесь , можно найти в 16. Продолжительность зависит от количества PM10 необходимости (как правило, от 1 до 10 дней). </li><li> В конце периода инкубации удалить фильтр из пробоотборника и заморозить его на-20 ° C до использования. </li></ol><img alt="Рисунок 1" src="/files/ftp_upload/54721/54721fig1.jpg" /> Рисунок 1. Низкий уровень громкости PM10 сэмплер. Пример низкого объема PM10 сэмплер. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54721/54721fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54721/54721fig1large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54721/54721fig1large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> 2. PM10 Снятие и количество частиц <ol><li> Пусть PTFE фильтр оттепели в течение приблизительно 5 мин. Затем поместите фильтр в чистой чашке Петри полистирола (рис 2А). Возьмем новую чашку Петри для каждого фильтра, если более чем один фильтр обрабатывается. </li><li> Затем перекрывают фильтр PTFE с фосфатным буфером (PBS). Этот протокол устанавливается для конечной концентрации РМ10 от 8x10 6 частиц на мл (см шаг 3.3). Для того, чтобы получить, по меньшей мере, концентрации, используйте следующую эмпирическую объем PBS для наложения фильтра с: Если время коллекция PM10 была &lt;<html> 2 дня, используйте 2 мл. Для времени инкубации ≥2 дней, используют 4 мл. Примечание: Для того, чтобы повысить концентрацию частиц суспензии PM10, суспензий из различных фильтров могут быть объединены, если это уместно. </li><li> Держите фильтр PTFE с помощью пинцета и щеткой с электрической зубной щеткой с чувствительной головкой щетки в течение 1 мин (рис 2б, 2в). Передача частиц-PBS-суспензии, далее называют PM10 суспензии, в чистую реакционную трубку. </li></ol><img alt="фигура 2" src="/files/ftp_upload/54721/54721fig2.jpg" /> Рисунок 2. Удаление РМ10 с электрической зубной щеткой. Политетрафторэтилена фильтр с отобранного PM10 помещают в чашку Петри полистирола (A) и перекрывается с 4 мл PBS. Затем, РМ10 удаляется с электрической зубной щеткой (B: перед чисткой и C: после чистки зубов в течение 1 мин).= &quot;Http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54721/54721fig2large.jpg&quot; целевых = &quot;_blank&quot;&gt; Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. <ol start="4"><li> Измерение концентрации частиц PM10, например, с использованием счетчика частиц. Развести достаточный объем PM10 суспензии, такие как 50 мкл в 10 мл изотонического буфера измерения, измеряют три раза и вычислить среднее общее количество частиц на мл. Обязательно использовать счетчик частиц, который может обнаруживать частицы соответствующего размера. </li></ol> 3. Ставка v 1 Окрашивание <ol><li> Подсчитайте число реакционных труб, необходимых для анализа образца: По крайней мере, три необходимы реакционные трубы: (I) одна трубка с единственным образцом (нативного контроль) (II) одна трубка с образцом плюс вторичным антителом (отрицательный контроль), и ( III) одна трубка с образцом плюс первичного и вторичного антитела (конкретного образца). Если измеренная в первый раз, готовят, по меньшей мере, двух реакционных труб для (I), (II),и (III), чтобы иметь достаточное количество материала, чтобы правильно настроить цитометр параметров (см шаг 4.1). </li><li> Рассчитать количество PM10 подвески, необходимое для числа реакционных труб. Каждая реакционная труба требует 50 мкл суспензии. </li><li> Регулировка концентрации частиц , измеренный в шаге 2.4 для объема суспензии , вычисленным на этапе 3.2 до конечной концентрации 8x10 6 частиц на мл путем добавления соответствующего количества PBS. Примечание: Оставшиеся РМ10 подвески могут быть заморожены при -20 ° С для дальнейших экспериментов, хотя для этого протокола свеже рекомендуется подготовлены РМ10 подвески. </li><li> Блок неспецифическое связывание путем дополнения приостановку PM10 с бычьим сывороточным альбумином (БСА) в конечной концентрации 0,02%, с использованием стандартного раствора, такой как 1% БСА, приготовленные из PBS. Вихревой кратко и инкубировать в течение 20 мин при комнатной температуре. </li><li> Для каждого образца для анализа с помощью проточной цитометрии, перенесите 50 мкл суспензии со стадии 3.4 к сети переменногопостное реакционную трубку. Добавление антитела против мышиного моноклонального Bet V 1 при конечной концентрации 0,02 мкг / мкл в пробирки реакции, предназначенных для специфического окрашивания, вихрем кратко и инкубировать в течение 60 мин при комнатной температуре. <ol><li> Пусть реакционные трубы с подвеской РМ10-БСА назначенный для нативного контроля и отрицательный контроль также остаются в течение 60 мин при комнатной температуре. </li></ol></li><li> Промыть все образцы путем добавления 500 мкл PBS с добавлением 0,02% БСА в каждую реакционную пробирку, вихревые кратко и центрифугировать образцы затем при 4700 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. Жидкость над осадком сливают осторожно с помощью вакуумного насоса. </li><li> Повторите шаг 3.6. </li><li> Определить общее количество АРС-меченого вторичного антитела против мышиных IgG1 антитела, необходимое: 1 мкг антитела, растворенного в 50 мкл PBS, дополненного 0,02% БСА в реакционной трубке. Развести соответствующее количество антител с соответствующим объемом PBS, дополненной 0,02% BSA. </li><li> Добавляют 50 мкл разведенной вторичного антитела для всех реакционных труб для реакционной трубки, предназначенной для нативного контроля за исключением того. Дополнение последнего с 50 мкл PBS, дополненного 0,02% BSA. Vortex все образцы в течение нескольких секунд. </li><li> Выдержите все образцы в течение 30 мин в темноте. </li><li> Повторите шаг 3,6 раза. </li><li> Добавьте 50 мкл PBS к каждой реакционной трубе, вихря и анализа образцов на проточном цитометре. </li></ol> 4. Поток Cytometric Анализ <ol><li> Используя собственные механизмы контроля доступа, настройте следующие параметры цитометр для оптимизации анализа данных. <ol><li> Используя пороговый контроллер вперед разброс (FSC), которая отображается на панели управления устройства платы, установить порог FSC по самой низкой стоимости (200) и начать анализ. </li><li> При использовании контроллера Разброс напряжения, отрегулируйте FSC и вбок разброс (SSC) таким образом, что все частицы PM10 могут быть обнаружены и что популяция частиц находится примерно в гое середина оси FSC, а в нижней половине оси SSC. </li><li> С помощью регулятора напряжения флуоресцентной, регулировки напряжения APC и другое напряжение флуоресцентной как изотиоцианат флуоресцеина (FITC), который не излучал на той же длине волны, как APC, если это необходимо. Убедитесь, что все частицы будут видны в нижней части обеих осей флуоресценции. </li></ol></li><li> Последовательная, исследовать каждый образец в том числе родного управления и хранения данных FSC, SSC, APC, и FITC, по меньшей мере, 10000 частиц в образце. </li><li> Оценить данные с соответствующим программным обеспечением. Адсорбированного содержание аллергена в конкретном образце может быть количественно определена двумя способами: <ol><li> Анализ интенсивности флуоресценции APC всех частиц (среднее значение) в качестве меры Bet v 1 нагрузки по всем частицам PM10. Примечание: Если конкретный образец содержал аллерген, интенсивность флуоресценции АРС должна возрастать в конкретном образце по сравнению с отрицательным контролем. В противоположность этому, другие плавиковогоинтенсивности ценции (например., FITC интенсивность флуоресценции) не должна существенно измениться. </li><li> Вычислить процент частиц PM10 с связанного анти-Bet V 1 антитела. Таким образом, в отрицательном контроле, установить ворота вокруг частиц считаются APC положительным, копировать и вставлять эти ворота в конкретной выборке и вычесть процент APC положительных частиц в отрицательном контроле от доли APC положительных частиц в конкретном образце. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Cakmak, S., Dales, R. E., Coates, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+air+pollution+increase+the+effect+of+aeroallergens+on+hospitalization+for+asthma?.">Does air pollution increase the effect of aeroallergens on hospitalization for asthma?.</a> J Allergy Clin Immunol. 129 (1), 228-231 (2012).</li><li>Barraza-Villarreal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Air+pollution,+airway+inflammation,+and+lung+function+in+a+cohort+study+of+Mexico+City+schoolchildren.">Air pollution, airway inflammation, and lung function in a cohort study of Mexico City schoolchildren.</a> Environ Health Perspect. 116 (6), 832-838 (2008).</li><li>Chen, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+association+of+ambient+air+pollution+with+airway+inflammation+in+schoolchildren.">The association of ambient air pollution with airway inflammation in schoolchildren.</a> Am J Epidemiol. 175 (8), 764-774 (2012).</li><li>Cyprowski, M., Buczynska, A., Szadkowska-Stanczyk, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indoor+allergens+in+settled+dust+from+kindergartens+in+city+of+Lodz,+Poland.">Indoor allergens in settled dust from kindergartens in city of Lodz, Poland.</a> Int J Occup Med Environ Health. 26 (6), 890-899 (2013).</li><li>Brough, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+peanut+protein+in+the+home+environment.">Distribution of peanut protein in the home environment.</a> J Allergy Clin Immunol. 132 (3), 623-629 (2013).</li><li>Galli, S. J., Tsai, M., Piliponsky, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+allergic+inflammation.">The development of allergic inflammation.</a> Nature. 454 (7203), 445-454 (2008).</li><li> World Health Organisation, R. O. f. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenology+and+human+health:+allergic+disorders:+report+on+WHO+meeting+Rome,+Italy.">Phenology and human health: allergic disorders: report on WHO meeting Rome, Italy.</a> , 256 (2003).</li><li>Wuthrich, B., Schindler, C., Leuenberger, P., Ackermann-Liebrich, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+atopy+and+pollinosis+in+the+adult+population+of+Switzerland+(SAPALDIA+study).+Swiss+Study+on+Air+Pollution+and+Lung+Diseases+in+Adults.">Prevalence of atopy and pollinosis in the adult population of Switzerland (SAPALDIA study). Swiss Study on Air Pollution and Lung Diseases in Adults.</a> Int Arch Allergy Immunol. 106 (2), 149-156 (1995).</li><li>Grote, M., Valenta, R., Reichelt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abortive+pollen+germination:+a+mechanism+of+allergen+release+in+birch,+alder,+and+hazel+revealed+by+immunogold+electron+microscopy.">Abortive pollen germination: a mechanism of allergen release in birch, alder, and hazel revealed by immunogold electron microscopy.</a> J Allergy Clin Immunol. 111 (5), 1017-1023 (2003).</li><li>Namork, E., Johansen, B. V., Lovik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+allergens+adsorbed+to+ambient+air+particles+collected+in+four+European+cities.">Detection of allergens adsorbed to ambient air particles collected in four European cities.</a> Toxicol Lett. 165 (1), 71-78 (2006).</li><li>S&#252;ring, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PM10+contains+particle-bound+allergens:+Dust+analysis+by+Flow+Cytometry.">PM10 contains particle-bound allergens: Dust analysis by Flow Cytometry.</a> Env Technol Inn. 5, 60-66 (2016).</li><li>Schappi, G. F., Suphioglu, C., Taylor, P. E., Knox, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concentrations+of+the+major+birch+tree+allergen+Bet+v+1+in+pollen+and+respirable+fine+particles+in+the+atmosphere.">Concentrations of the major birch tree allergen Bet v 1 in pollen and respirable fine particles in the atmosphere.</a> J Allergy Clin Immunol. 100 (5), 656-661 (1997).</li><li>Buters, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+allergen+Bet+v+1+in+fractions+of+ambient+air+deviates+from+birch+pollen+counts.">The allergen Bet v 1 in fractions of ambient air deviates from birch pollen counts.</a> Allergy. 65 (7), 850-858 (2010).</li><li>Buters, J. T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Release+of+Bet+v+1+from+birch+pollen+from+5+European+countries.+Results+from+the+HIALINE+study.">Release of Bet v 1 from birch pollen from 5 European countries. Results from the HIALINE study.</a> Atmos Environ. 55, 496-505 (2012).</li><li>Ormstad, H., Johansen, B. V., Gaarder, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airborne+house+dust+particles+and+diesel+exhaust+particles+as+allergen+carriers.">Airborne house dust particles and diesel exhaust particles as allergen carriers.</a> Clin Exp Allergy. 28 (6), 702-708 (1998).</li><li>Brough, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peanut+protein+in+household+dust+is+related+to+household+peanut+consumption+and+is+biologically+active.">Peanut protein in household dust is related to household peanut consumption and is biologically active.</a> J Allergy Clin Immunol. 132 (3), 630-638 (2013).</li><li>Jochner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seasonal+variation+of+birch+and+grass+pollen+loads+and+allergen+release+at+two+sites+in+the+German+Alps.">Seasonal variation of birch and grass pollen loads and allergen release at two sites in the German Alps.</a> Atmos Env. , (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Важным шагом протокола является использование соответствующего фильтра для сбора частиц РМ10 из окружающего воздуха (см шаг 1.1). Фильтр должен быть достаточно прочным, чтобы выдержать чистки зубов с электрической зубной щеткой, а не все фильтрующие материалы отвечают этому требованию. Протокол окрашивания был установлен с концентрацией частиц PM10 8x10 6 частиц на мл. Однако, если материал ограничен и аккумулирование образцов не подходит, метод, вероятно, работать как хорошо, но антител концентрации (см шаги 3.5 и 3.8), возможно, должны быть скорректированы. Bet v 1 окрашивание частиц PM10 не приводило к различным населения положительно и отрицательно окрашенных частиц. Это может быть вызвано различными количествами Bet v 1 аллергеном, адсорбированных на каждой из частиц в пределах от очень мало до большого количества. Это может привести к расширению сигнала APC таким образом, сдвигая населения кAPC позитивности. Поскольку трудно отделить положительные от отрицательных частиц, два метода количественного определения, были использованы для определения различий в содержании Bet v 1 РМ10&gt; 0,5 образцы: (I) относительной количественной оценки путем измерения срединного APC интенсивности флуоресценции всех частиц и (II) определения процентного содержания APC положительных частиц. Что касается ставки v 1 груз частиц от низкого и высокого сезона пыльцы PM10&gt; 0,5, оба метода показали аналогичные результаты. Тем не менее, относительное количественное определение по срединной интенсивности флуоресценции всех частиц рекомендуется, поскольку это не зависит от размещения ворот и, следовательно, возможно, менее подвержены ошибкам. На сегодняшний день многие исследования изучить содержание аллергенов в воздух твердых частиц окружающей среды путем экстракции соответствующего аллергена и последующего количественного определения с ELISA 5,12-14,17. Существует принципиальная разница между процедурой, описанной здесь и quantificatioп с ELISA: ELISA квантифицирует извлеченный и растворенный антиген, а проточной цитометрии анализирует антиген связанного с твердыми частицами. С помощью ELISA бет V 1 нагрузки испытуемых образцов РМ10 (п = 8) была ниже предела обнаружения 1,2 нг / мл (данные не показаны). Точно так же, Buters и другие не определены специальные ставки V 1 в ПМ &lt;2,5 мкм фракции и только около 7% в 10 мкм&gt; PM&gt; фракции 2,5 мкм, но более 93% в ПМ&gt; 10 мкм фракции окружающего воздуха 13. Противоположные результаты ELISA с одной стороны, и анализа FACS, с другой стороны, может быть вызвана различиями в способе обнаружения в сочетании с расходящимися чувствительностью. Дальнейшие исследования, однако необходимо, чтобы полностью понять эту разницу. Способ визуализации связанного с твердыми частицами антигена сканирующей электронной микроскопии 10,14. Методом сканирующей электронной микроскопии, Ormstad и др. Визуализированы Bet v 1 на поверхности взвешенных частиц штейнаЧастицы сажи г пробы в высокий сезон пыльцы и в меньшей степени от частиц , отобранных в низкий сезон пыльцы 15. Кроме того, были найдены аллергенами из пыльцы, латекса , а также бета-глюканы , чтобы адсорбировать на частицах сгорания в окружающем воздухе 10. Этот метод, однако, не позволяет количественно оценить частицы переплете аллергеном. При использовании проточной цитометрии, связанного с твердыми частицами Bet v 1 аллергеном может быть определена количественно. Таким образом, проточная цитометрия может предложить новый способ охарактеризовать биологическую фракцию РМ10 от 10 до 0,5 мкм , как с другими подходящими антителами на руке, этот метод может быть распространен на обнаружение других антигенов на окружающих частиц воздуха, например, плесень, пылевой клещ аллергены или LPS. Поскольку частицы PM10 адсорбировать не только биологический материал, но и химические вещества и металлы довольно легко, неспецифическое связывание антител, однако, может создать проблему. Если новое антитело тестируют, очень важный шаг, чтобы доказать конкретную привязкуING. Это может быть сделано с помощью, например, блокирования связывания способности конкретного антитела с соответствующим антигеном , а затем окрашивать 11. Как Bet V 1 Содержание окружающего воздуха может отличаться от березовой пыльцы 12,13,18, аллергические симптомы могут , возможно , лучше коррелируют с уровнем аллерген , чем пыльца рассчитывать 14,18. Таким образом, данный способ в сочетании с клиническими данными позволяет исследовать в будущих экспериментах ли аллергические реакции на березу соответствуют Bet v 1 аллергеном нагрузки PM10&gt; 0,5.

Загрязнение воздуха в настоящее время рассматривается в качестве важной экологической причиной повышенной заболеваемости и тяжести дыхательной аллергии , наблюдаемых в последние десятилетия 1-3. Кроме того, существует растущий интерес к распределению общих аллергенов в пыли 4,5. Березовая пыльца может вызвать сенную лихорадку , но также может быть важным фактором , аллергической астмы 6-8. Всего пыльцы березы, скорее всего, чтобы войти в нижние дыхательные пути, или можно найти в PM10 в результате его размера (22 мкм в диаметре) нет. Тем не менее, пыльцы березы аллергены , такие как Bet V 1, основной компонент пыльцы березы аллергеном, может быть освобожден после того, как пыльца разрыва 9 и может связываться с частицами 10 окружающего воздуха, таким образом , возможно , ввести нижние дыхательные пути. Действительно, было показано , что РМ10 могут содержать биологически активные аллергены , как продемонстрировано путем активации в пробирке базофилов из пыльцы аллергическим пробанда 11 </suр&gt;. Bet v Содержание 1 аллерген в образцах PM10 было изучено путем извлечения соответствующего аллергена и последующего количественного определения с ELISA 12-14. С помощью метода ELISA, растворенный аллерген измеряли, но количество аллергенных нагруженных частиц до сих пор оставалось неизвестным. Сканирующая электронная микроскопия выявили аллерген нагруженных частиц , но не позволяет количественно оценить 10,15. Это исследование использует проточной цитометрии для количественной оценки доли Bet v 1-нагруженных частиц РМ10 в пробах атмосферного воздуха. Из-за предела обнаружения потока цитометр только частицы могут быть изучены больше, чем 0,5 мкм. &gt; 0,5 мкм фракция PM10 будет далее как PM10&gt; 0,5.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="645">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Teflon filter</td>
			<td style="width:143px;">Pall Life Sciences, USA</td>
			<td style="width:119px;">R2PL047</td>
			<td style="width:167px;">47 mm, 1.0 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">low volume sampler&#160;</td>
			<td>Sven Leckel Ingenieur B&#252;ro GmbH, Germany</td>
			<td style="width:119px;">LVS3</td>
			<td>air flow of 2.3 m3/h</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phosphate-buffered saline</td>
			<td style="width:143px;">Biochrom, Germany</td>
			<td style="width:119px;">L1825</td>
			<td>without Ca/Mg, low endotoxin</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">electrical toothbrush&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Braun, Germany</td>
			<td style="width:119px;">Oral-B Vitality Sensitive</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Casy cell counter&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Sch&#228;rfe System GmbH, Germany</td>
			<td style="width:119px;">Model TTC</td>
			<td>range of detectable particle size: 0.7 &#181;m to 45 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">FACSCanto II&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Becton Dickinson, USA</td>
			<td style="width:119px;">3-laser, 8-color (4-2-2)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FACS Diva Software v6.1.3&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">bovine serum albumin (BSA)&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td style="width:119px;">A2153-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">monoclonal mouse IgG1 antibody against Bet v 1</td>
			<td style="width:143px;">Indoor Biotechnologies, UK</td>
			<td style="width:119px;">&#160;MA-3B4</td>
			<td style="width:167px;">clone MA-3B4</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">APC (Allophycocyanin)-labeled secondary anti-Mouse IgG1 antibody&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Becton Dickinson</td>
			<td align="right" style="width:119px;">560089</td>
			<td>clone A85-1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">SPSSTM software version 18&#160;</td>
			<td style="width:143px;">PASW Statistics 18, Hongkong, China</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petri Dish</td>
			<td style="width:143px;">Gosselin, France</td>
			<td style="width:119px;">BP50-02</td>
			<td>D 55mm, H 15mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">FACS Tube&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Becton Dickinson, USA</td>
			<td style="width:119px;">REF 352054</td>
			<td>5ml Polystyrene</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CASYton</td>
			<td style="width:143px;">Roche 
			Germany</td>
			<td style="width:119px;">REF 05651808001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Matrix Blank Tubes</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Scientific, USA</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4140</td>
			<td>1,4 ml, PP</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:143px;">Heraeus, Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Megafuge 40R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Vacuum Pump</td>
			<td style="width:143px;">INTEGRA Biosciences AG, Switzerland</td>
			<td style="width:119px;">Model 158 320</td>
			<td>Inetrgra Vacusafe</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">recombinant Bet v 1a antigen&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Indoor Biotechnologies, UK</td>
			<td style="width:119px;">LTR-BV1A-1</td>
			<td>Concentration:&#160; 2.0 mg/ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometric analysis of particle-bound bet v 1 allergen in pm10

Проточная цитометрия является метод широко используется для количественного определения взвешенных твердых частиц, таких как клетки или бактерии, в диапазоне размеров от 0,5 до нескольких десятков микрон в диаметре. В дополнение к характеристике вперед и вбок свойств рассеяния, она позволяет использовать флуоресцентные маркеры маркированы как антитела для обнаружения соответствующих структур. Использование косвенную с использованием меченых антител, проточной цитометрии используется здесь, чтобы определить количество пыльцы березы аллерген (точно Bet v 1) -loaded частиц от 0,5 до 10 мкм в диаметре в ингаляционном твердых частиц (PM10, размер частиц ≤10 мкм в диаметре). Частицы PM10 могут выступать в качестве носителей адсорбированных аллергенов, возможно, их транспортировки в нижних отделах дыхательных путей, где они могли бы вызвать аллергические реакции. До сих пор содержание аллергена РМ10 было изучено с помощью твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА) и сканирующей электронной микроскопии. ELISA меры, растворенного и не частицы-связанного аллергеном. По сравнению с сканирующей электронной микроскопии, который может визуализировать аллерген нагруженных частиц, проточной цитометрии, может дополнительно определить количество их. Как содержание аллергена окружающего воздуха может отклоняться от березовой пыльцы, аллергические симптомы могут, возможно, лучше коррелируют с воздействием аллергена, чем при подсчете пыльцы. В сочетании с клиническими данными, данный способ дает возможность проверить в будущих экспериментах ли аллергические реакции на пыльцу березы антигены связаны с содержанием Bet v 1 аллергеном частиц PM10&gt; 0,5 мкм.

Ставка v 1 аллергеном адсорбция к PM10&gt; 0,5 частиц определяли количественно путем непрямого с использованием меченых антител и последующего анализа на проточном цитометре. Образец PM10 из высокого сезона пыльцы служил в качестве шаблона. Как указано в пункте 3.1, отрицательный контроль состоял из частиц PM10 , инкубированных с APC помечены вторичными антителами только (рисунок 3А). Частицы PM10 окрашивали анти-Bet v 1 антитела плюс вторичного антитела отображается аллергена загружены частицы (рис 3B). Как описано в шаге 4.3, были использованы два способа количественной оценки аллергической нагрузкой: С одной стороны, среднее значение интенсивности флуоресценции АРС всех частиц анализировалась быть 137 для отрицательного контроля и 904 для конкретного образца. С другой стороны, процент частиц с связанного анти-Bet V 1 антитела определяли: Ворота был установлен вокруг положительных частиц APC в отрицательном контроле, а затем совместнопестрая и вставили в конкретном образце. В отрицательном контроле, 3% частиц РМ10&gt; 0,5 считались положительными АРС. Этот процент ложных положительных частиц вычитают из процента положительных частиц в образце конкретного таким образом , что приводит к 77,5% APC положительного PM10&gt; 0,5 частиц в конкретном образце. Для того, чтобы доказать, что наблюдаемое связывание анти-Bet v 1 антитела конкретно, способность связывания была блокирована с соответствующим антигеном предварительного окрашивания. Это уменьшается связывание анти-Bet v 1 антителом на 69%, если количественно интенсивности флуоресценции APC, и на 84%, если количественно процент от ставки V 1 положительный результат PM10&gt; 0,5 частиц (фиг.3С). <img alt="Рисунок 3" src="/files/ftp_upload/54721/54721fig3.jpg" /> Рисунок 3. связанного с твердыми частицами Bet v 1 аллергеном могут быть визуализированы с помощью проточной цитометрии. APC интенсивности флуоресценции образца PM10 с высокой роllen сезон окрашивают только с APC меченого вторичного антитела (A), окрашивали анти-бет против 1 первичного антитела , а затем с APC меченого вторичного антитела (В), и после того, как блокирование первичного антитела с рекомбинантным Bet v 1 антиген (С ). Ворота P + APC была установлена вокруг рассматриваемых частиц APC положительный (отображается красным цветом) и соответствующие проценты даны. Эта цифра была несколько изменена с 11. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54721/54721fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54721/54721fig3large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54721/54721fig3large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a> Чтобы проверить , может ли этот метод быть приняты , чтобы выявить различия в количестве адсорбированного Bet v 1 содержание РМ10&gt; 0,5 образцов от высокой и от низкого сезона пыльцы, были проанализированы 13 PM10 образцы высокого и 6 PM10 образцов из низкого сезона пыльцы. Рисунок 4изображает существенные различия в интенсивности флуоресценции APC и в пропорции Bet V 1 положительная PM10&gt; 0,5 частиц образцов РМ10 от высокого сезона пыльцы по сравнению с образцами РМ10 от низкого сезона пыльцы. Оба метода количественного определения, таким образом показали сходные результаты. <img alt="Рисунок 4" src="/files/ftp_upload/54721/54721fig4.jpg" /> Рисунок 4. PM10 образцы из низкого и высокого сезона пыльцы различаются по количеству адсорбированного Bet против 1. Низкий сезон пыльцы PM10 отбирали в осень / зима 2013 (п = 6), высокий сезон пыльцы PM10 в мае 2012 и 2013 (п = 13). (A) APC интенсивность флуоресценции PM10&gt; 0,5 частицы из высокого сезона пыльцы была значительно выше , чем от низкого сезона пыльцы (средний / мин / макс высокий сезон пыльцы: 796/313/1097; средний / мин / макс низкий сезон пыльцы: 197 / 85/277). (B) PM10 от высокого сезона пыльцы содержали significanTLY более Bet v 1-положительных PM10&gt; 0,5 частиц , чем PM10 от низкого сезона пыльцы (средний / мин / макс высокий сезон пыльцы: 45,2 / 18,5 / 74,5, медиана / мин / макс низкий сезон пыльцы: 11,8 / 4,4 / 19,8). Вставка графики показывают средние значения (внутренняя линия коробки), 25 и 75. процентили соответственно (нижние и верхние границы окна) и минимальные и максимальные значения (пунктир). *** Р &lt;0,001 по сравнению с низким сезоном пыльцы, тест Манна-Уитни U. Эта цифра была несколько изменена с 11. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54721/54721fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54721/54721fig4large.jpg" target="_blank">нажмите здесь</a> , <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54721/54721fig4large.jpg" target="_blank">чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10 at JoVE.com

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10 (Video) | JoVE

Здесь мы приводим протокол для количественного определения аллерген нагруженных частиц с помощью проточной цитометрии. Окружающие частицы твердых частиц могут выступать в качестве носителей адсорбированных аллергенов. Покажем, что здесь проточной цитометрии, метод широко используется для характеристики взвешенных твердых частиц&gt; 0,5 мкм в диаметре, можно использовать для измерения этих аллерген нагруженных частиц.

Поток Cytometric Анализ связанного с твердыми частицами Bet v 1 аллергена в PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Murine Model of Allergen Induced Asthma

Murine Model of Allergen Induced Asthma (Video) | JoVE

Мышиной модели астма Аллерген Индуцированные

Asthma is a major cause of morbidity and mortality, affecting some 300 million people throughout the world.1 More than 8% of the US population has asthma, ...

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination (Video) | JoVE

Всего животного визуализации и проточной цитометрии методы анализа антиген-специфических CD8 + Т-клеточные ответы после вакцинации наночастиц

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain (Video) | JoVE

Выделение и проточной цитометрии анализ иммунных клеток из мозга ишемического Mouse

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells (Video) | JoVE

Выделение и проточной цитометрии анализ глиомы инфильтрирующие мононуклеарных клеток периферической крови

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes (Video) | JoVE

Выделение и проточной цитометрии Характеристика мышиных лимфоцитах тонкого кишечника

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood (Video) | JoVE

Flow Cytometric Анализ естественных клеток-киллеров литической активности в человеческой цельной крови

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells (Video) | JoVE

Выделение и Flow Cytometric Анализ человеческого Endocervical Гамма-Дельта Т-клеток

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells (Video) | JoVE

Пищеварение мышиных печени для анализа гранулярных поток лимфы эндотелиальных клеток

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...

Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To Fc&#947;R Cross-linking

Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To FcÃŽÂ³R Cross-linking (Video) | JoVE

Измерение расхода гранулярных производства рос в макрофагах в ответ на FcγR сшивки

The oxidative or respiratory burst is used to describe the rapid consumption of oxygen and generation of reactive oxygen species (ROS) by phagocytes in ...

Multi-scale Analysis of Bacterial Growth Under Stress Treatments

Multi-scale Analysis of Bacterial Growth Under Stress Treatments (Video) | JoVE

Многомасштабный анализ роста бактерий при стрессовом лечении

Analysis of the bacterial ability to grow and survive under stress conditions is essential for a wide range of microbiology studies. It is relevant to ...