Name: a simple fluorescence assay for quantification of canine neutrophil extracellular trap release
Uploaded: 2016-11-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release at JoVE.com

The authors gratefully acknowledge Drs James Roth, William Nauseef and Kayoko Kimura and Mr Tom Skadow for assistance with development of the canine neutrophil protocols. RDG is supported by a Wellcome Trust Fellowship ref: WT093767MA.

أجريت جميع التجارب بإذن الأخلاقي من لجنة جامعة المؤسسي رعاية الحيوان واستخدام ولاية أيوا. مجموعة 1. الدم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رسم 9 مل من الدم من الصافن، وريد رأسي أو الوداجي مباشرة إلى تخثر (على سبيل المثال، ...

<ol>
	<li>Schiffman, J. D., Breen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+oncology:+what+dogs+and+other+species+can+teach+us+about+humans+with+cancer.">Comparative oncology: what dogs and other species can teach us about humans with cancer.</a> Philos Trans Rl Soc B Biol Sci. 370, 1673 (2015).</li><li>Williams, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+canine+leucocyte+antigens:+a+significant+advance+in+canine+immunology.">Studies of canine leucocyte antigens: a significant advance in canine immunology.</a> Vet J. 153 (1), 31-39 (1997).</li><li>Eckhart, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duplication+of+the+caspase-12+prodomain+and+inactivation+of+NLRC4/IPAF+in+the+dog.">Duplication of the caspase-12 prodomain and inactivation of NLRC4/IPAF in the dog.</a> Biochem Biophys Res Commun. 384 (2), 226-230 (2009).</li><li>Eckhart, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+mammalian+caspases+reveals+an+important+role+of+gene+loss+in+shaping+the+human+caspase+repertoire.">Identification of novel mammalian caspases reveals an important role of gene loss in shaping the human caspase repertoire.</a> Mol Biol Evol. 25 (5), 831-841 (2008).</li><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps:+is+immunity+the+second+function+of+chromatin.">Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin.</a> J Cell Biol. 198 (5), 773-783 (2012).</li><li>Chuammitri, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chicken+heterophil+extracellular+traps+(HETs):+novel+defense+mechanism+of+chicken+heterophils.">Chicken heterophil extracellular traps (HETs): novel defense mechanism of chicken heterophils.</a> Vet Immunol Immunopathol. 129 (1-2), 126-131 (2009).</li><li>Pali&#263;, D., Ostoji&#263;, J., Andreasen, C. B., Roth, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fish+cast+NETs:+neutrophil+extracellular+traps+are+released+from+fish+neutrophils.">Fish cast NETs: neutrophil extracellular traps are released from fish neutrophils.</a> Dev Comp Immunol. 31 (8), 805-816 (2007).</li><li>Poirier, A. C., Schmitt, P., Rosa, R. D., Vanhove, A. S., Kieffer-Jaquinod, S., Rubio, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+histones+and+DNA+traps+in+invertebrate+immunity:+evidences+in+Crassostrea+gigas.">Antimicrobial histones and DNA traps in invertebrate immunity: evidences in Crassostrea gigas.</a> J Biol Chem. 289 (36), 24821-24831 (2014).</li><li>Robb, C. T., Dyrynda, E. A., Gray, R. D., Rossi, A. G., Smith, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invertebrate+extracellular+phagocyte+traps+show+that+chromatin+is+an+ancient+defense+weapon.">Invertebrate extracellular phagocyte traps show that chromatin is an ancient defense weapon.</a> Nat Commun. 5, 4627 (2014).</li><li>Kaplan, M. J., Radic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps:+double-edged+swords+of+innate+immunity.">Neutrophil extracellular traps: double-edged swords of innate immunity.</a> J Immunol. 189 (6), 2689-2695 (2012).</li><li>Menegazzi, R., Decleva, E., Dri, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Killing+by+neutrophil+extracellular+traps:+fact+or+folklore?.">Killing by neutrophil extracellular traps: fact or folklore?.</a> Blood. 119 (5), 1214-1216 (2012).</li><li>Parker, H., Albrett, A. M., Kettle, A. J., Winterbourn, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloperoxidase+associated+with+neutrophil+extracellular+traps+is+active+and+mediates+bacterial+killing+in+the+presence+of+hydrogen+peroxide.">Myeloperoxidase associated with neutrophil extracellular traps is active and mediates bacterial killing in the presence of hydrogen peroxide.</a> J Leukoc Biol. 91 (3), 369-376 (2012).</li><li>Martinod, K., Wagner, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombosis:+tangled+up+in+NETs.">Thrombosis: tangled up in NETs.</a> Blood. 123 (18), 2768-2776 (2014).</li><li>Pratesi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+from+patients+with+rheumatoid+arthritis+target+citrullinated+histone+4+contained+in+neutrophils+extracellular+traps.">Antibodies from patients with rheumatoid arthritis target citrullinated histone 4 contained in neutrophils extracellular traps.</a> Ann Rheum Dis. 73 (7), 1414-1422 (2014).</li><li>Nauseef, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+human+neutrophils+from+venous+blood.">Isolation of human neutrophils from venous blood.</a> Methods Mol Biol. 1124, 13-18 (2014).</li><li>Gray, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+conventional+protein+kinase+C+(PKC)+is+critical+in+the+generation+of+human+neutrophil+extracellular+traps.">Activation of conventional protein kinase C (PKC) is critical in the generation of human neutrophil extracellular traps.</a> J Inflamm (Lond). 10 (1), 12 (2013).</li><li>Jeffery, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dogs+cast+NETs+too:+Canine+neutrophil+extracellular+traps+in+health+and+immune-mediated+hemolytic+anemia.">Dogs cast NETs too: Canine neutrophil extracellular traps in health and immune-mediated hemolytic anemia.</a> Vet Immunol Immunopathol. 168 (3-4), 262-268 (2015).</li><li>McCracken, J. M., Allen, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+human+neutrophil+apoptosis+and+lifespan+in+health+and+disease.">Regulation of human neutrophil apoptosis and lifespan in health and disease.</a> J Cell Death. 7, 15-23 (2014).</li></ol>

فحص الحمض النووي الإفراج قدم هو فحص للقياس بسهولة للالحمض النووي خارج الخلية. تم تعديل طريقة من تقنيات مشابهة تستخدم لتقييم تشكيل NET في الأنواع الأخرى، ولكن تم تغيير السرعات الطرد المركزي، وتركيزات ناهض وحضانة مرات لتحسين طريقة للاستخدام مع العدلات الكلاب 8،17،18.</...

وهناك أكثر من 70 مليون الكلاب الاليفة في الولايات المتحدة وحدها 1. كأعضاء أسرة الكرام، هذه الحيوانات غالبا ما تلقي الرعاية الطبية خفض الحافة. على قدم المساواة لأنهم مشاركة بيئتنا، يمكن أن الكلاب أن تساعد في فهم المرضية والعلاج من الأمراض التي تصيب البشر 1. ومع ذلك، ما إذا كانت ترجمة الاكتشافات في الطب البشري في العلاجات البيطرية أو العكس بالعكس، فمن المهم أن تميز الاختلافات الأنواع حتى في أنظمة الحفظ للغاية تماما مثل الاستجابة المناعية الفطرية. وتشمل الأمثلة على الاختلافات بين الكلاب ونظام المناعة الفطري البشري العالي التعبير CD4 على العدلات الكلب 2. غياب homolog الوظيفي للاستشعار فلاجيلين حشوية IPAF في الكلاب 3 والتعبير عن هجين كاسباس 1/4 في الحيوانات آكلة اللحوم (4). الفخاخ خارج الخلية العدلات (المستجدة) هي عنصر المكتشفة حديثا نسبيا من مناعة فطرية 5. المستجدة هي شبكةالصورة من الحمض النووي والبروتينات النووية والحبيبية صدر ردا على مجموعة واسعة من التهابات أو المعدية المحفزات 6. وقد أثبتت يشبه الهياكل NET عبر العديد من الأنواع بما في ذلك الدجاج 7، 8 الأسماك والرخويات 9 و 10 acoelomates، ولكن هناك اختلافات الأنواع. على سبيل المثال، العدلات الفئران تستجيب ببطء أكثر للمؤثرات NETosis من العدلات الإنسان، وتشكل المستجدة أقل منتشر 11. وهناك مجموعة كبيرة من الأدلة من الأنواع المتعددة التي المستجدة إيقاع الميكروبات، وأكثر إثارة للجدل يمكن أن تشارك مباشرة في قتل مسببات الأمراض 12،13. ومع ذلك، مكونات NET أيضا تعزيز تلف الأنسجة، وتشجيع تخثر الدم ويكون بمثابة مستضدات الذاتية 14،15. قد تختلف التوازن بين الآثار المفيدة والضارة للالمستجدة بين الأمراض المختلفة والأنواع المختلفة، مما يدل على أنه من المهم للتحقيق المستجدة في كل من الأنواع وحالة من الفائدة. نحن هناوصف بروتوكول بسيط لإحداث وقياس الافراج عن المستجدة التي كتبها العدلات الكلاب. هذه الطريقة مشابهة لتلك المستخدمة لعزل العدلات 16 و حمل NETosis في الأنواع الأخرى، ولكن الظروف مثل تركيز ناهض وفترة حضانة وقد تم تحسين لالعدلات الكلاب. كما تم وصف مماثل NET الكمي الحمض النووي الإفراج فحص في الأنواع الأخرى ولكن الطريقة المعروضة هنا هو الأمثل أيضا للكلاب 8،17،18.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="546">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col span="2" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:204px;">Plastic Whole Blood tube with spray-coated K2EDTA</td>
			<td style="width:215px;">BD</td>
			<td style="width:64px;">367835</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Histopaque-1077</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dextran-500</td>
			<td>Accurate chemical and scientific corp.</td>
			<td>AN228410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>20012043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal bovine calf serum, heat inactivated</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>10100139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RPMI Media 1640, without phenol red or L-glutamine</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>32404-014</td>
			<td>Should be free from phenol red</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96 well flat bottomed sterile polystyrene plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phorbol 12-myristate 13-acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Platelet activating factor</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SYTOX Green Nucleic Acid Stain</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>S7020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Synergy 2 Multi-Mode Reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple fluorescence assay for quantification of canine neutrophil extracellular trap release

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although a component of the innate immune response, NETs are implicated in a range of disease processes including autoimmunity and thrombosis. This protocol describes a simple method for canine neutrophil isolation and quantification of NETs using a microplate fluorescence assay. Blood is collected using conventional venipuncture techniques. Neutrophils are isolated using dextran sedimentation and a density gradient using conditions optimized for dog blood. After allowing time for attachment to the wells of a 96 well plate, neutrophils are treated with NET-inducing agonists such as phorbol-12-myristate-13-acetate or platelet activating factor. DNA release is measured by the fluorescence of a cell-impermeable nucleic acid dye. This assay is a simple, inexpensive method for quantifying NET release, but NET formation rather than other causes of cell death must be confirmed with alternative methods.

باستخدام هذا البروتوكول، يجب أن يكون هناك تغيير أضعاف القوي في مضان بعد تحفيز العدلات مع الضوابط الإيجابية، سلطة النقد الفلسطينية والقوات الجوية الباكستانية. كما هو موضح في الشكل 1B، وتحفيز العدلات الكلاب مع 31 ميكرومتر القوات الجوية الباك...

Watch this Scientific Journal Video about A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release at JoVE.com

A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release

الفخاخ خارج الخلية العدلات (المستجدة) هي شبكات من الحمض النووي، الهستونات والبروتينات العدلة. على الرغم من أن المكون من الاستجابة المناعية الفطرية، وتورط المستجدة في المناعة الذاتية وتجلط الدم. يصف هذا البروتوكول طريقة بسيطة لعزل العدلات الكلاب وتقدير من المستجدة باستخدام فحص صفيحة مضان.

والإسفار الفحص بسيطة لالكمي من الكلاب خارج الخلية العدلات فخ الإصدار

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

الفخاخ خارج الخلية العدلات : كيفية إنشاء وتصور لهم

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

في المختبر المقايسة المشتركة لتقييم الهجرة العدلية المستحثة المسببة للأمراض عبر الظهارية

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

في المختبر تشكيل الكلاب العَدلات فخ خارج الخلية: التحليل الكمي ودينامية بالفحص المجهري الأسفار

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

التحديد الكمي افيروسيتوسيس بالفحص المجهري Fluorescence خلية واحدة

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT

التلقائي القائم علي الصورة الكمية من الفخاخ العدلات خارج الخلية باستخدام NETQUANT

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. ...

A High-throughput Assay to Assess and Quantify Neutrophil Extracellular Trap Formation

مقايسة الفائق تقييم وتقدير حجم تشكيل العَدلات فخ خارج الخلية

Neutrophil extracellular traps (NETs) are immunogenic extracellular DNA structures that can be released by neutrophils upon a wide variety of triggers. ...

In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

في المختبر التحفيز والتصور من الإفراج عن فخ خارج الخلية في الضامة البشرية المتمايزة المشتقة

The release of extracellular traps (ETs) by neutrophils has been identified as a contributing factor to the development of diseases related to chronic ...

Humanized Mediator Release Assay as a Read-Out for Allergen Potency

أنسنة وسيط الافراج عن المقايسة كمقروءة لقوة مسببات الحساسية

Mediator release assays analyze in vitro immunoglobulin E (IgE)-mediated degranulation and secretion of mediators by effector cells, such as mast cells ...

Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA

القياس الكمي لمعقدات الميلوبيروكسيديز - الحمض النووي و Neutrophil Elastase-DNA من مصائد العدلات خارج الخلية باستخدام شطيرة ELISA المعدلة

Certain stimuli, such as microorganisms, cause neutrophils to release neutrophil extracellular traps (NETs), which are basically web-like structures ...