Name: a simple fluorescence assay for quantification of canine neutrophil extracellular trap release
Uploaded: 2016-11-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release at JoVE.com

The authors gratefully acknowledge Drs James Roth, William Nauseef and Kayoko Kimura and Mr Tom Skadow for assistance with development of the canine neutrophil protocols. RDG is supported by a Wellcome Trust Fellowship ref: WT093767MA.

모든 실험은 아이오와 주립 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회에서 윤리적 허가 하였다. 1. 혈액 컬렉션 <ol><li> 직접 항응고제로 복재, 두부 또는 경정맥에서 혈액의 9 ml의 그리기 (예를 들어, 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA), 1.8 mg의 K 2 EDTA / ml의 혈액) vacutainers, 또는 EDTA 함유 혈액 튜브에 즉시 전송 주사기로. 부드럽게 굴러 또는 혈액 항응고제의 적절한 혼합을 보장하...

<ol>
	<li>Schiffman, J. D., Breen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+oncology:+what+dogs+and+other+species+can+teach+us+about+humans+with+cancer.">Comparative oncology: what dogs and other species can teach us about humans with cancer.</a> Philos Trans Rl Soc B Biol Sci. 370, 1673 (2015).</li><li>Williams, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+canine+leucocyte+antigens:+a+significant+advance+in+canine+immunology.">Studies of canine leucocyte antigens: a significant advance in canine immunology.</a> Vet J. 153 (1), 31-39 (1997).</li><li>Eckhart, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duplication+of+the+caspase-12+prodomain+and+inactivation+of+NLRC4/IPAF+in+the+dog.">Duplication of the caspase-12 prodomain and inactivation of NLRC4/IPAF in the dog.</a> Biochem Biophys Res Commun. 384 (2), 226-230 (2009).</li><li>Eckhart, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+mammalian+caspases+reveals+an+important+role+of+gene+loss+in+shaping+the+human+caspase+repertoire.">Identification of novel mammalian caspases reveals an important role of gene loss in shaping the human caspase repertoire.</a> Mol Biol Evol. 25 (5), 831-841 (2008).</li><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps:+is+immunity+the+second+function+of+chromatin.">Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin.</a> J Cell Biol. 198 (5), 773-783 (2012).</li><li>Chuammitri, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chicken+heterophil+extracellular+traps+(HETs):+novel+defense+mechanism+of+chicken+heterophils.">Chicken heterophil extracellular traps (HETs): novel defense mechanism of chicken heterophils.</a> Vet Immunol Immunopathol. 129 (1-2), 126-131 (2009).</li><li>Pali&#263;, D., Ostoji&#263;, J., Andreasen, C. B., Roth, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fish+cast+NETs:+neutrophil+extracellular+traps+are+released+from+fish+neutrophils.">Fish cast NETs: neutrophil extracellular traps are released from fish neutrophils.</a> Dev Comp Immunol. 31 (8), 805-816 (2007).</li><li>Poirier, A. C., Schmitt, P., Rosa, R. D., Vanhove, A. S., Kieffer-Jaquinod, S., Rubio, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+histones+and+DNA+traps+in+invertebrate+immunity:+evidences+in+Crassostrea+gigas.">Antimicrobial histones and DNA traps in invertebrate immunity: evidences in Crassostrea gigas.</a> J Biol Chem. 289 (36), 24821-24831 (2014).</li><li>Robb, C. T., Dyrynda, E. A., Gray, R. D., Rossi, A. G., Smith, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invertebrate+extracellular+phagocyte+traps+show+that+chromatin+is+an+ancient+defense+weapon.">Invertebrate extracellular phagocyte traps show that chromatin is an ancient defense weapon.</a> Nat Commun. 5, 4627 (2014).</li><li>Kaplan, M. J., Radic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps:+double-edged+swords+of+innate+immunity.">Neutrophil extracellular traps: double-edged swords of innate immunity.</a> J Immunol. 189 (6), 2689-2695 (2012).</li><li>Menegazzi, R., Decleva, E., Dri, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Killing+by+neutrophil+extracellular+traps:+fact+or+folklore?.">Killing by neutrophil extracellular traps: fact or folklore?.</a> Blood. 119 (5), 1214-1216 (2012).</li><li>Parker, H., Albrett, A. M., Kettle, A. J., Winterbourn, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloperoxidase+associated+with+neutrophil+extracellular+traps+is+active+and+mediates+bacterial+killing+in+the+presence+of+hydrogen+peroxide.">Myeloperoxidase associated with neutrophil extracellular traps is active and mediates bacterial killing in the presence of hydrogen peroxide.</a> J Leukoc Biol. 91 (3), 369-376 (2012).</li><li>Martinod, K., Wagner, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombosis:+tangled+up+in+NETs.">Thrombosis: tangled up in NETs.</a> Blood. 123 (18), 2768-2776 (2014).</li><li>Pratesi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+from+patients+with+rheumatoid+arthritis+target+citrullinated+histone+4+contained+in+neutrophils+extracellular+traps.">Antibodies from patients with rheumatoid arthritis target citrullinated histone 4 contained in neutrophils extracellular traps.</a> Ann Rheum Dis. 73 (7), 1414-1422 (2014).</li><li>Nauseef, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+human+neutrophils+from+venous+blood.">Isolation of human neutrophils from venous blood.</a> Methods Mol Biol. 1124, 13-18 (2014).</li><li>Gray, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+conventional+protein+kinase+C+(PKC)+is+critical+in+the+generation+of+human+neutrophil+extracellular+traps.">Activation of conventional protein kinase C (PKC) is critical in the generation of human neutrophil extracellular traps.</a> J Inflamm (Lond). 10 (1), 12 (2013).</li><li>Jeffery, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dogs+cast+NETs+too:+Canine+neutrophil+extracellular+traps+in+health+and+immune-mediated+hemolytic+anemia.">Dogs cast NETs too: Canine neutrophil extracellular traps in health and immune-mediated hemolytic anemia.</a> Vet Immunol Immunopathol. 168 (3-4), 262-268 (2015).</li><li>McCracken, J. M., Allen, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+human+neutrophil+apoptosis+and+lifespan+in+health+and+disease.">Regulation of human neutrophil apoptosis and lifespan in health and disease.</a> J Cell Death. 7, 15-23 (2014).</li></ol>

제시된 DNA 분리 분석은 세포 DNA에 대한 용이 한 정량 분석한다. 이 방법은 다른 종에서 NET 형성을 평가하기 위해 사용 된 유사한 기술에서 채택되었지만, 원심 속도 작용제 농도와 항온 처리 시간은 개과 호중구 8,17,18 함께 사용하기위한 방법을 최적화하기 위해 변경되었다. 유사한 조정이 다른 종의 방법을 적용하도록 할 수있다. 분석은 유동 세포 계측법 또는 이미지 분석으로 NETosis을 ?...

만 70 애완 동물 개 1 혼자 미국에 있습니다. 소중한 가족으로,이 동물은 종종 가장자리 치료를 절단받을 수 있습니다. 그들은 우리의 환경을 공유 마찬가지로 때문에, 개는 인간의 질병 1의 병인과 치료에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 그러나, 의학적 치료 또는 그 반대에 인간 의약 발견 변환 여부는 완전히 같은 선천성 면역 반응 심지어 고도로 보존 시스템 종 변형을 특성화하는 것이 중요하다. 송곳니와 인간의 선천성 면역 시스템 사이의 차이의 예는 개 호중구 (2) 높은 표현 CD4을 포함한다; 개 3의 세포질 플라 젤린 센서 IPAF의 기능 동족체의 부재와 육식 4에서 카스파 제 1/4 하이브리드의 표현. 호중구 세포 트랩 (그물) 선천성 면역 (5)의 비교적 최근에 발견 된 구성 요소입니다. 그물 네트워크입니다감염성 또는 염증성 자극 (6)의 넓은 범위에 응답하여 해제 DNA, 핵 단백질의 입상. NET 같은 구조 닭 7, 8 물고기, 연체 동물류 (9, 10)을 포함하는 많은 종 acoelomates 통해 입증되었지만 종 차이가있다. 예를 들어, 쥐의 호중구 인간 호중구보다 NETosis 자극에 더 느리게 응답, 덜 확산 그물 (11)을 형성한다. 그물 직접 병원균 12,13 죽이는 데 관여 할 수 이상의 논쟁 미생물 포획, 복수 종 증거하는 큰 몸체있다. 그러나 NET 구성 요소는 또한, 조직 손상을 강화 14, 15을자가 항원으로 혈전증 행동을 촉진. 그물의 유익하고 해로운 영향 사이의 균형은 종과 관심의 조건에 모두 그물을 조사하는 것이 중요하다 제안, 다른 질병과 다른 종 사이에 차이가있을 수 있습니다. 여기에 우리유도와 송곳니 호중구 그물의 방출을 측정하기위한 간단한 프로토콜을 설명한다. 이 방법은 호중구 (16)을 분리하여 다른 종 NETosis을 유도하기 위해 사용 된 것과 유사하지만, 이러한 효능 제 농도 및 배양 시간 등의 조건은 개과 호중구에 대해 최적화되었다. 유사한 NET 정량화 DNA 분리 분석은 다른 종에서 설명되었지만, 여기에 제시된 방법은 또한 개 8,17,18에 최적화되어있다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="546">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col span="2" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:204px;">Plastic Whole Blood tube with spray-coated K2EDTA</td>
			<td style="width:215px;">BD</td>
			<td style="width:64px;">367835</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Histopaque-1077</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dextran-500</td>
			<td>Accurate chemical and scientific corp.</td>
			<td>AN228410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>20012043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal bovine calf serum, heat inactivated</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>10100139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RPMI Media 1640, without phenol red or L-glutamine</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>32404-014</td>
			<td>Should be free from phenol red</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96 well flat bottomed sterile polystyrene plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phorbol 12-myristate 13-acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1585</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Platelet activating factor</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SYTOX Green Nucleic Acid Stain</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>S7020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Synergy 2 Multi-Mode Reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple fluorescence assay for quantification of canine neutrophil extracellular trap release

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although a component of the innate immune response, NETs are implicated in a range of disease processes including autoimmunity and thrombosis. This protocol describes a simple method for canine neutrophil isolation and quantification of NETs using a microplate fluorescence assay. Blood is collected using conventional venipuncture techniques. Neutrophils are isolated using dextran sedimentation and a density gradient using conditions optimized for dog blood. After allowing time for attachment to the wells of a 96 well plate, neutrophils are treated with NET-inducing agonists such as phorbol-12-myristate-13-acetate or platelet activating factor. DNA release is measured by the fluorescence of a cell-impermeable nucleic acid dye. This assay is a simple, inexpensive method for quantifying NET release, but NET formation rather than other causes of cell death must be confirmed with alternative methods.

이 프로토콜을 이용하여, 양성 대조군, 및 PAF PMA로 호중구를 자극 후의 형광 강한 배의 변화가있을 것이다. 비 자극 세포 (범위 2.0-5.8, N = 5 개) 18에 비해 형광의 평균 4.0 배 증가에서 1 시간 결과 31 μM PAF와 그림 1B, 송곳니 호중구의 자극에 도시 된 바와 같이. 0.1 μM (도 1a)에서 PMA 2 시간까지 형광을 증가시키지 않는 느린 작용제하지만 궁극?...

Watch this Scientific Journal Video about A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release at JoVE.com

A Simple Fluorescence Assay for Quantification of Canine Neutrophil Extracellular Trap Release

호중구 세포 트랩 (그물) DNA, 히스톤 및 호중구 단백질의 네트워크입니다. 선천성 면역 반응의 구성 요소이지만, 그물자가 면역 및 혈전증에 연루되어있다. 이 프로토콜은 개과 호중구 분리 및 마이크로 플레이트 형광 분석법을 이용하여 그물 정량화하기위한 간단한 방법을 설명한다.

개 호중구 세포 외 트랩 릴리스의 정량화를위한 ​​간단한 형광 분석

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

호중구 세포 트랩 : 그들을 생성 및 시각화하는 방법

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

연구

면역학 및 감염병학

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

시험관 내 병원균 유도 호중구 트랜스 상피 이동을 평가하는 공동 문화 분석

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

생체 외에서 형광 현미경 검사 법에 의해 개 호 중구 Extracellular 함정 형성: 역동적이 고 양적 분석

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

단일 세포 형광 현미경 검사 법에 의해 Efferocytosis의 정량화

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT

NETQUANT를 사용한 호중구 세포외 트랩의 자동 이미지 기반 정량화

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. ...

A High-throughput Assay to Assess and Quantify Neutrophil Extracellular Trap Formation

평가 하 고 호 중구 Extracellular 함정 대형 계량 높은 처리량 분석 결과

Neutrophil extracellular traps (NETs) are immunogenic extracellular DNA structures that can be released by neutrophils upon a wide variety of triggers. ...

In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

분화 한 인간 단핵구 유래 대식세포에서 세포 외 트랩 방출의 시험관 내 자극 및 시각화

The release of extracellular traps (ETs) by neutrophils has been identified as a contributing factor to the development of diseases related to chronic ...

Humanized Mediator Release Assay as a Read-Out for Allergen Potency

인간화된 중재자 릴리스 분석으로 알레르겐 효능에 대 한 읽기-아웃

Mediator release assays analyze in vitro immunoglobulin E (IgE)-mediated degranulation and secretion of mediators by effector cells, such as mast cells ...

Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA

변형된 샌드위치 ELISA를 사용하여 호중구 세포외 트랩에서 Myeloperoxidase-DNA 및 Neutrophil Elastase-DNA 복합체 정량화

Certain stimuli, such as microorganisms, cause neutrophils to release neutrophil extracellular traps (NETs), which are basically web-like structures ...

개 호중구 세포 외 트랩 릴리스의 정량화를위한 ​​간단한 형광 분석

개 호중구 세포 외 트랩 릴리스의 정량화를위한 간단한 형광 분석