Name: a buoyancy-based method of determining fat levels in drosophila
Uploaded: 2016-11-01T11:15:00
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K.E.H. was supported by the Training Grant in Molecular Biology NIH-T32-GM08730. This work was supported by NIH, NIDDK Grant 5K01DK095932 and AHA Award 12BGIA11930014 to T.R.

1. Sammeln Eier aus Flies mit Genotypen von Interesse HINWEIS: Ideal Kreuze bestehen aus 150 virgin Fliegen und mindestens 75 Männer. Auf Sammlungen sollten mindestens 200 Fliegen bestehen. <ol><li> Bereiten Sie Traubenplatten. <ol><li> Hinzufügen 37,5 g Agar 1,5 L destilliertem Wasser in einem 4 l-Kolben. </li><li> Autoklav Wasser / Agar Mix für 50 min bei 121 ° C (250 ° F). </li><li> Während Wasser / Agar Mix Autoklavierung ist, in den 500 ml Traubensaft 50 g Saccharose und rühren mit einem Rührstab ...

<ol>
	<li>Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila,+the+golden+bug,+emerges+as+a+tool+for+human+genetics.">Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics.</a> Nat Rev Genet. 6, 9-23 (2005).</li><li>Liu, Z., Huang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+metabolism+in+Drosophila+development+and+disease+Using+Drosophila+System+to+Study+Lipid+Metabolism+Lipids+Function+in+Drosophila+Early+Development.">Lipid metabolism in Drosophila development and disease Using Drosophila System to Study Lipid Metabolism Lipids Function in Drosophila Early Development.</a> Acta Biochim Biophys Sin. 45 (1), 44-50 (2013).</li><li>Ruden, D. 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Es gibt eine Vielzahl von Techniken , die entwickelt wurden Lipidspiegel 8 zu messen - 10. Allerdings kommt jedes dieser Verfahren einige wesentliche Nachteile, die durch den Auftrieb basierenden Assay oben umrissenen adressiert sind. Erstens ist dieser Test sehr schnell. eine vollständige Konzentrationsgradienten Prüfung dauert nicht länger als 30 - 60 min. Dies ist eine große Verbesserung gegenüber den meisten der Techniken, die derzeit im Einsatz. Zum Beispiel Lipid-Quantifizieru...

Drosophila melanogaster ist seit mehr als einem Jahrhundert in der Erforschung der Genetik und andere grundlegende biologische Fragen verwendet. In den letzten Jahrzehnten hat es klar geworden , dass Drosophila ein mächtiges Werkzeug in der Studie von vielen menschlichen Krankheiten. Da 70-80% der mit menschlichen Krankheiten assoziierten Gene haben ein identifizierter Fliegen ortholog 1. - 4. stellt Drosophila ein vereinfachtes noch übersetzbar System , bei dem komplexe Krankheiten zu studieren. Der Stoffwechsel hat vor allem von einer solchen Studie profitiert. Nicht nur sind die Genetik der Stoffwechsel gut konserviert zwischen Fliegen und Menschen, aber die zuständigen Organe und Zelltypen sind auch sehr ähnlich 2,5. Zum Beispiel kann die Fettkörper der Fliegen speichert beide Triacylglyceride (TAG) und Glykogen, die Funktionen analog zu denen in Säugetierleber und weißen Fettgewebe 6 durchgeführt. Mit Drosophila als Modell für menschliche Fettleibigkeit hat unser Verständnis von Lipid erheblich verbessertStoffwechsel und die Genetik der Adipositas 7. Larvenentwicklungsstadium ist besonders nützlich für die Untersuchung der Segregation von Nährstoffen Lagerung oder Verwendung, wie sie zum Zuführen und die Speicherung von Energie widmet sich während Puparium-Bildung verwendet werden. Derzeit gibt es viele verschiedene quantitative Methoden der Fettlagerebenen in Drosophila zu bestimmen. Die am weitesten verbreitete Methode ist die gekoppelte kolorimetrischen Assay (CCA) 8,9. CCA wurde zur Bestimmung der TAG Niveaus in menschlichem Serum entwickelt und arbeitet auf der Prämisse, dass aus dem Rückgrat Triglyceriden freigesetzt Glycerin werden mehrere Reaktionen eingehen, letztlich in einer Redox-Reaktion gekoppelt ergeb ein gefärbtes Produkt erzeugen. Die Absorption bestimmter Wellenlängen des Lichts wird dann gemessen, um die anfängliche Menge an Glycerin vorhanden zu bestimmen. Jedoch Glycerin kann auch aus Mono- und Diacylglyceriden neben TAG freigesetzt werden und somit kann kein genaues Maß für s seinwachten Körperfett 9. Außerdem Auge Pigment des zerquetschten erwachsenen Fliegen kann mit einigen Extinktionsablesungen stören und 9,10 Ergebnisse erschweren. Daher muss CCA durch Dünnschichtchromatographie (TLC) begleitet und validiert werden, die für die Trennung der meisten Lipid Familien ermöglicht , die durch Densitometrie 10,11 quantifiziert werden kann. Allerdings können einige Lipidklassen wie Sterole nicht analysiert werden und muss eine andere Art und Weise 12 quantifiziert werden. Die Massenspektrometrie (MS) ist eine genaue Art und Weise alle Klassen der wichtigsten zellulären Lipiden 12,13 quantitativ zu bestimmen. die Lipidextraktionsverfahren jedoch notwendig, die von MS zu analysieren sind sowohl zeitaufwendig (die meisten Einnahme fast einen ganzen Tag) und kostspielig. Hier präsentieren wir eine alternative Methode , um schnell und kostengünstig organismal Fettwerte in der L3 - Larven von Drosophila melanogaster bestimmen. Das Verfahren stellt sich wie folgt nutzt die Differenz in der Dichte zwischen Fettgewebe und magerem Gewebe. Mammalian fat Gewebe hat eine Dichte von etwa 0,9 g / ml 14 während der Skelettmuskulatur als einer Dichte von 1,06 g / ml 15. Dieser Unterschied bedeutet, dass Tiere mit höheren Vorräte an Fett geringere Dichte als Tiere mit geringeren Speicher des Fettes haben, die es ihnen ermöglichen besser fester Dichte in einer Lösung zu schweben. Diese Eigenschaft ermöglicht eine extrem schnelle Screening einer großen Anzahl von Tieren, während sowohl kostengünstige und nicht-invasive sind. Buoyancy-basierte Analyse wurde sowohl die Phänotypen der Änderung bekannten Regulatoren der Fettwerte sowie zu identifizieren , neue genetische und neurologische Regulatoren der Fettleibigkeit 16,17 zur Bestätigung verwendet.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="670">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bacto Agar</td>
			<td style="width:168px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">214030</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Welch&#39;s Original 100% Grape Juice</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sucrose</td>
			<td style="width:168px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">S512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tegosept</td>
			<td style="width:168px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:119px;">20-259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethanol</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>200 proof</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Baker&#39;s yeast</td>
			<td style="width:168px;">Fleichmann&#39;s</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Yellow Corn Meal</td>
			<td style="width:168px;">Quaker</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Enriched degerminated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Drosophila Agar Type II</td>
			<td style="width:168px;">Apex</td>
			<td style="width:119px;">66-104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Soy Flour</td>
			<td style="width:168px;">ADM Specialty Ingredients</td>
			<td style="width:119px;">062-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Malt Extract</td>
			<td style="width:168px;">Breiss</td>
			<td style="width:119px;">5748</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Light Corn Syrup</td>
			<td style="width:168px;">Karo</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Propionic Acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>U330-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:168px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">50147491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5655-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium phosphate anhydrous</td>
			<td style="width:168px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">S3933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P330-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">35 x 10mm petri plate</td>
			<td style="width:168px;">Fisher</td>
			<td>08-757-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">50mL Conical</td>
			<td style="width:168px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">50-869-569</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a buoyancy-based method of determining fat levels in drosophila

Drosophila melanogaster is a key experimental system in the study of fat regulation. Numerous techniques currently exist to measure levels of stored fat in Drosophila, but most are expensive and/or laborious and have clear limitations. Here, we present a method to quickly and cheaply determine organismal fat levels in L3 Drosophila larvae. The technique relies on the differences in density between fat and lean tissues and allows for rapid detection of fat and lean phenotypes. We have verified the accuracy of this method by comparison to body fat percentage as determined by neutral lipid extraction and gas chromatography coupled with mass spectrometry (GCMS). We furthermore outline detailed protocols for the collection and synchronization of larvae as well as relevant experimental recipes. The technique presented below overcomes the major shortcomings in the most widely used lipid quantitation methods and provides a powerful way to quickly and sensitively screen L3 larvae for fat regulation phenotypes while maintaining the integrity of the larvae. This assay has wide applications for the study of metabolism and fat regulation using Drosophila.

Abbildung 1 zeigt ein Beispiel dafür , wie die Auftriebsbasierten Assay erkennen kann sowohl höhere als auch niedrigere Fettreserven in genetisch manipulierten Larven. 1A zeigt , daß bei Anregung oder Silencing einer bestimmten Untergruppe von Neuronen (E347) im Larven Gehirn induziert niedrigere und höhere Fett Geschäfte sind. Die gleichen genetischen Hintergrund - Kontrolle wurde in beiden Fällen verwendet. 1B zeigt ein Beispiel ...

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A Buoyancy-based Method of Determining Fat Levels in Drosophila

Hier präsentieren wir eine Methode organismal Fettwerte im dritten Larvenstadium (L3) Larvenstadium von Drosophila melanogaster zu messen. Dieses Verfahren nutzt die vergleichsweise geringe Dichte von Fettgewebe zwischen Larven mit einer veränderten Fettspeicher zu unterscheiden. Buoyancy-basierte Analyse ist ein wertvolles Werkzeug für die schnelle, reproduzierbare und wirtschaftliche Screening.

Ein Auftriebskörper-basierte Methode zur Bestimmung Fettwerte in<em&gt; Drosophila</em

Drosophila melanogaster is a key experimental system in the study of fat regulation. Numerous techniques currently exist to measure levels of stored fat ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Buoyancy-based Method of Determining Fat Levels in Drosophila

Studying Aggression in Drosophila (fruit flies)

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Studieren Aggression in Drosophila (Taufliege)

Aggression is an innate behavior that evolved in the framework of defending or obtaining resources.  This complex social behavior is influenced by ...

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Biologie

Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Pyrosequencing: Eine einfache Methode für genaue Genotypisierung

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

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Visuell vermittelte Odor-Tracking während des Fluges in Drosophila

Flying insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals additionally track odors carried in the wind. As such, visual ...

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

In-vivo-Zentrifugation von Drosophila Embryonen

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

Biochemische und High Throughput Mikroskopische Beurteilung der Fettmasse in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Ein verbessertes Verfahren für genaue und schnelle Messung der Flugleistung in<em&gt; Drosophila</em

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Die Messung der Hämsynthese Levels in Säugerzellen

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Ein Verfahren zur Permeabilisierung der<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryonen für Tests von Small Molecule Aktivität

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Quantitative Immunfluoreszenz-Assay, um die Variation der Protein-Ebene an Zentrosomen Messen

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Bestimmen Membrane Protein Topologie Mit Fluorescence Protease Schutz (FPP)

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