Name: three-dimensional super resolution microscopy of f-actin filaments by interferometric photoactivated localization microscopy (ipalm)
Uploaded: 2016-12-01T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy iPALM at JoVE.com

ستشغل وPK الامتنان الدعم المالي من مؤسسة البحوث الوطنية في سنغافورة، منحت لPK (جبهة الخلاص الوطني، NRFF-2011-04 وNRF2012NRF-CRP001-084). كما نشكر مختبر والأساسية المجهر مفتوحة مرافق MBI لدعم البنية التحتية.

1. إعداد العينات التصوير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> منذ إشارات مضان الخلفية تتداخل مع مضان من العلامات fluorophore، وتنظيف coverglasses قبل الشطف لأول مرة في المياه المتأينة ([ده 2 O) ثم الهواء تجفيفها باستخدام الهواء المضغوط. وفي وقت لاحق، نفذ النقش ا?...

<ol>
	<li>Kanchanawong, P., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization-based+super-resolution+imaging+of+cellular+structures.">Localization-based super-resolution imaging of cellular structures.</a> Methods Mol Biol. 1046, 59-84 (2013).</li><li>Bertocchi, C., Goh, W. I., Zhang, Z., Kanchanawong, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+imaging+by+super+resolution+fluorescence+microscopy+and+its+emerging+applications+in+biomedical+research.">Nanoscale imaging by super resolution fluorescence microscopy and its emerging applications in biomedical research.</a> Crit Rev Biomed Eng. 41, 281-308 (2013).</li><li>Kanchanawong, P., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+light-based+imaging+of+three-dimensional+cellular+ultrastructure.">Advances in light-based imaging of three-dimensional cellular ultrastructure.</a> Curr Opin Cell Biol. 24, 125-133 (2012).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li><li>Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy.">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophys J. 91, 4258-4272 (2006).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat Methods. 3, 793-795 (2006).</li><li>Heilemann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subdiffraction-resolution+fluorescence+imaging+with+conventional+fluorescent+probes.">Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes.</a> Angew Chem Int Edit. 47, 6172-6176 (2008).</li><li>Sharonov, A., Hochstrasser, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wide-field+subdiffraction+imaging+by+accumulated+binding+of+diffusing+probes.">Wide-field subdiffraction imaging by accumulated binding of diffusing probes.</a> P Natl Acad Sci USA. 103, 18911-18916 (2006).</li><li>F&#246;lling, J., Bossi, M., Bock, H., Medda, R., Wurm, C. A., Hein, B., Jakobs, S., Eggeling, C., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+nanoscopy+by+ground-state+depletion+and+single-molecule+return.">Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return.</a> Nat Methods. 5, 943-945 (2008).</li><li>Biteen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-moldecule+active-control+microscopy+(SMACM)+with+photo-reactivable+EYFP+for+imaging+biophysical+processes+in+live+cells.">Single-moldecule active-control microscopy (SMACM) with photo-reactivable EYFP for imaging biophysical processes in live cells.</a> Nat Methods. 5, 947-949 (2008).</li><li>Shtengel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferometric+fluorescent+super-resolution+microscopy+resolves+3D+cellular+ultrastructure.">Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure.</a> P Natl Acad Sci USA. 106, 3125-3130 (2009).</li><li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+super-resolution+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy.">Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy.</a> Science. 319, 810-813 (2008).</li><li>Dani, A., Huang, B., Bergan, J., Dulac, C., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super+resolution+imaging+of+chemical+synapses+in+the+brain.">Super resolution imaging of chemical synapses in the brain.</a> Neuron. 68, 843-856 (2010).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Talin+determines+the+nanoscale+architecture+of+focal+adhesions.">Talin determines the nanoscale architecture of focal adhesions.</a> P Natl Acad Sci USA. 112 (35), E4864-E4873 (2015).</li><li>Kanchanawong, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+architecture+of+integrin-based+cell+adhesions.">Nanoscale architecture of integrin-based cell adhesions.</a> Nature. 468, 580-584 (2010).</li><li>Wu, Y., Kanchanawong, P., Zaidel-Bar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin-delimited+adhesion-independent+clustering+of+e-cadherin+forms+the+nanoscale+building+blocks+of+adherens+junctions.">Actin-delimited adhesion-independent clustering of e-cadherin forms the nanoscale building blocks of adherens junctions.</a> Dev Cell. 32 (2), 139-154 (2015).</li><li>Szymborska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+Pore+Scaffold+Structure+Analyzed+by+Super-Resolution+Microscopy+and+Particle+Averaging.">Nuclear Pore Scaffold Structure Analyzed by Super-Resolution Microscopy and Particle Averaging.</a> Science. 341, 655-658 (2013).</li><li>Lawo, S., Hasegan, M., Gupta, G. D., Pelletier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subdiffraction+imaging+of+centrosomes+reveals+higher-order+organizational+features+of+pericentriolar+material.">Subdiffraction imaging of centrosomes reveals higher-order organizational features of pericentriolar material.</a> Nat Cell Biol. 14, 1148-1158 (2012).</li><li>Mennella, V., Agard, D. A., Huang, B., Pelletier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amorphous+no+more:+subdiffraction+view+of+the+pericentriolar+material+architecture.">Amorphous no more: subdiffraction view of the pericentriolar material architecture.</a> Trends Cell Biol. 24, 188-197 (2014).</li><li>Mennella, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subdiffraction-resolution+fluorescence+microscopy+reveals+a+domain+of+the+centrosome+critical+for+pericentriolar+material+organization.">Subdiffraction-resolution fluorescence microscopy reveals a domain of the centrosome critical for pericentriolar material organization.</a> Nat Cell Biology. 14, 1159-1168 (2012).</li><li>Fletcher, D. A., Mullins, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+mechanics+and+the+cytoskeleton.">Cell mechanics and the cytoskeleton.</a> Nature. 463, 485-492 (2010).</li><li>Salbreux, G., Charras, G., Paluch, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+cortex+mechanics+and+cellular+morphogenesis.">Actin cortex mechanics and cellular morphogenesis.</a> Trends Cell Biol. 22, 536-545 (2012).</li><li>Shtengel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cellular+ultrastructure+by+PALM,+iPALM,+and+correlative+iPALM-EM.">Imaging cellular ultrastructure by PALM, iPALM, and correlative iPALM-EM.</a> Method Cell Biol. 123, 273-294 (2014).</li><li>Juette, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+sub-100+nm+resolution+fluorescence+microscopy+of+thick+samples.">Three-dimensional sub-100 nm resolution fluorescence microscopy of thick samples.</a> Nat Methods. 5, 527-529 (2008).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivatable+fluorescent+proteins+for+diffraction-limited+and+super-resolution+imaging.">Photoactivatable fluorescent proteins for diffraction-limited and super-resolution imaging.</a> Trends Cell Biol. 19, 555-565 (2009).</li><li>Shannon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Communication+in+the+presence+of+noise.">Communication in the presence of noise.</a> Proc. IRE. 37, 10-21 (1949).</li><li>Good, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+ion+buffers+for+biological+research.">Hydrogen ion buffers for biological research.</a> Biochemistry. 5, 467-477 (1966).</li><li>Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+oxygen+scavenging+system+for+improvement+of+dye+stability+in+single-molecule+fluorescence+experiments.">An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments.</a> Biophys J. 94, 1826-1835 (2008).</li><li>Shin, W. D., Goldman, R. D., Swedlow, J. R., Spector, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Live Cell Imaging: A Laboratory Manual. , (2010).</li><li>Aquino, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-color+nanoscopy+of+three-dimensional+volumes+by+4Pi+detection+of+stochastically+switched+fluorophores.">Two-color nanoscopy of three-dimensional volumes by 4Pi detection of stochastically switched fluorophores.</a> Nat Methods. 8, 353-359 (2011).</li><li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging.">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nat Methods. 8, 1027-1036 (2011).</li><li>Pertsinidis, A., Zhang, Y., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subnanometre+single-molecule+localization,+registration+and+distance+measurements.">Subnanometre single-molecule localization, registration and distance measurements.</a> Nature. 466, 647-651 (2010).</li><li>Baddeley, D., Cannell, M. B., Soeller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+Localization+Microscopy+Data.">Visualization of Localization Microscopy Data.</a> Microsc Microanal. 16, 64-72 (2010).</li><li>El Beheiry, M., Dahan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ViSP:+representing+single-particle+localizations+in+three+dimensions.">ViSP: representing single-particle localizations in three dimensions.</a> Nat Methods. 10, 689-690 (2013).</li><li>Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunolabeling+artifacts+and+the+need+for+live-cell+imaging.">Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging.</a> Nat Methods. 9, 152-158 (2012).</li><li>Shroff, H., Galbraith, C. G., Galbraith, J. A., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+photoactivated+localization+microscopy+of+nanoscale+adhesion+dynamics.">Live-cell photoactivated localization microscopy of nanoscale adhesion dynamics.</a> Nat Methods. 5, 417-423 (2008).</li><li>Yamashiro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+single-molecule+speckle+microscopy+reveals+modification+of+the+retrograde+actin+flow+by+focal+adhesions+at+nanometer+scales.">New single-molecule speckle microscopy reveals modification of the retrograde actin flow by focal adhesions at nanometer scales.</a> Mol Biol Cell. 25, 1010-1024 (2014).</li><li>Shroff, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-color+super+resolution+imaging+of+genetically+expressed+probes+within+individual+adhesion+complexes.">Dual-color super resolution imaging of genetically expressed probes within individual adhesion complexes.</a> P Natl Acad Sci USA. 104, 20308-20313 (2007).</li><li>Chen, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lattice+light-sheet+microscopy:+imaging+molecules+to+embryos+at+high+spatiotemporal+resolution.">Lattice light-sheet microscopy: imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution.</a> Science. 346, (2014).</li><li>Brown, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super+resolution+fluorescence+imaging+of+mitochondrial+nucleoids+reveals+their+spatial+range,+limits,+and+membrane+interaction.">Super resolution fluorescence imaging of mitochondrial nucleoids reveals their spatial range, limits, and membrane interaction.</a> Mol Cell Biol. 31, 4994-5010 (2011).</li><li>Huang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Video-rate+nanoscopy+using+sCMOS+camera-specific+single-molecule+localization+algorithms.">Video-rate nanoscopy using sCMOS camera-specific single-molecule localization algorithms.</a> Nat Methods. 10, 653-658 (2013).</li><li>Daostorm, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DAOSTORM:+an+algorithm+for+high-density+super-resolution+microscopy.">DAOSTORM: an algorithm for high-density super-resolution microscopy.</a> Nat methods. 8, 279 (2011).</li><li>Zhu, L., Zhang, W., Elnatan, D., Huang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Faster+STORM+using+compressed+sensing.">Faster STORM using compressed sensing.</a> Nat Methods. 9, 721-723 (2012).</li><li>Van Engelenburg, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+ESCRT+machinery+at+HIV+assembly+sites+reveals+virus+scaffolding+of+ESCRT+subunits.">Distribution of ESCRT machinery at HIV assembly sites reveals virus scaffolding of ESCRT subunits.</a> Science. 343, 653-656 (2014).</li><li>Vaughan, J. C., Jia, S., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrabright+photoactivatable+fluorophores+created+by+reductive+caging.">Ultrabright photoactivatable fluorophores created by reductive caging.</a> Nat Methods. 9, 1181-1184 (2012).</li></ol>

ويستند النظام البصري من iPALM على تصميم موضوعي 4 و- ð ثنائي تعارض، كما هو مبين في الشكل 1A. يتم إنشاء الإعداد باستخدام أجزاء كل من عرف تشكيله والتجارية البصريات الميكانيكية، كما هو موضح سابقا 23 والمدرجة في الجدول 1. بالإضافة إلى الإعداد لد...

كان التصور من الهياكل الخلوية المعقدة منذ فترة طويلة جزءا لا يتجزأ من رؤى البيولوجية والاكتشاف. على الرغم من أن الفحص المجهري مضان يمكن أن خلايا صورة مع خصوصية جزيئية عالية، ويقتصر حل السلطة عن طريق حيود إلى ~ 200 نانومتر في الطائرة صورة (س، ص، أو البعد الأفقي) و&gt; 500 نانومتر على طول المحور البصري (ض، أو البعد المحوري) 1،2. وبالتالي، فإن مراقبة ملامح التركيبية تاريخيا تقتصر على المجهر الإلكتروني (EM). لحسن الحظ، فإن التطورات الأخيرة في القرار المجهر السوبر والتحايل هذا الحد، مما يتيح القرار المكانية في 10 - مجموعة نانومتر 100 1-6. على وجه الخصوص، نهج سوبر قرار بناء على توطين جزيء واحد، والمعروف من قبل المختصرات مثل نخلة (PhotoActivated التعريب المجهري) 4، FPALM (الإسفار PhotoActivated التعريب المجهري) 5 (د) STORM (مباشر الاستوكاستك البصرية التعمير المجهري) 6،7، والطلاء ( بوتراكم كثافة التصوير النانو طبوغرافية) 8، GSDIM (الدولة الأرضي استنفاد المجهر تليها عودة الجزيئية الفردية) 9، أو SMACM (أحادي جزيء نشط تحكم المجهري) 10، وكذلك () تطبيقات على 3 الأبعاد 3D، مثل PALM التداخل (iPALM) 11 أو 3D-STORM 12، كانت قيمة في الكشف عن رؤى جديدة في المنظمة النانو العديد من الهياكل البيولوجية، بما فيها المحاور العصبية والمشابك 13، الالتصاقات البؤرية 14،15، تقاطعات خلية خلية 16، المسام النووية 17 وجسيم مركزي 18-20، على سبيل المثال لا الحصر. ميزة أخرى التركيبية في الخلايا التي سوبر قرار المجهر مفيد يحتمل أن تكون هي الهيكل الخلوي الأكتين. شبكه معقدة من الخيطية (و) -actin في القشرة خلية يلعب دورا أساسيا في التحكم في شكل الخلوية والخصائص الميكانيكية 21. المنظمة سبنشاط وحيوي ينظم و و الأكتين على الرغم من العديد من البروتينات التنظيمية التي تؤثر بقوة البلمرة، يشابك، والدوران، والاستقرار، وهيكل الشبكة (22). ومع ذلك، على الرغم من أن توصيف العمارة شبكه-و أكتين مهم للرؤى الآلية إلى مجموعة متنوعة من العمليات الخلوية، وحجم صغير (~ 8 نانومتر) من شعيرات و أكتين يعيق مراقبتهم من قبل التقليدي المجهر الضوئي محدودة الحيود. وبالتالي، فإن التصور من هيكل غرامة الأكتين وحتى الآن تم تنفيذ حصريا من قبل EM. هنا، نحن تصف بروتوكولات لتصور الهيكل الخلوي، و الأكتين في خلايا الثدييات الملتصقة، وذلك باستخدام سوبر قرار تقنية المجهر iPALM للاستفادة من قدرتها دقة عالية جدا في 3D 11،23. على الرغم من أن أداة iPALM متخصصة للغاية، وقد وصفت تعليمات حول إعداد مثل هذا الصك مؤخرا 23، في حين أن الوصول إلى المجهر iPALM استضافته هوكما أحرز جناح معهد هيوز الطبي المتاح للمجتمع البحوث بأقل تكلفة ممكنة. بالإضافة إلى ذلك، أساليب إعداد العينات المذكورة هنا قابلة للتطبيق مباشرة إلى النهج البديلة 3D السوبر القرار، مثل تلك التي تقوم على defocusing اللابؤرية وظيفة انتشار نقطة (قوات الأمن الفلسطينية) 12 أو ثنائية طائرة الكشف عن 24، والتي تتوفر على نطاق أوسع. ونلاحظ أن عنصر ضروري لقرار المجهر سوبر استنادا توطين جزيء واحد في العام هو fluorophore photoswitchable 25، والذي يسمح الشروط الثلاثة الهامة للأساس توطين جزيء واحد سوبر قرار المجهر الواجب توافرها: أ) ارتفاع واحد جزيء السطوع والتباين بالنسبة إلى الإشارات الخلفية؛ ب) توزيع متفرق من الجزيئات واحدة في إطار صورة معينة. وثالثا) كثافة مكانية عالية من وضع العلامات كافية لالتقاط الملامح العامة للهيكل الأساسي (المعروف أيضا باسم نيكويست شاالمعيار أخذ العينات nnon) 26. وهكذا، للحصول على نتائج مرضية، ينبغي التشديد على قدم المساواة على كل من الإعداد المناسب من العينات لتحسين fluorophore photoswitching والحفاظ على التركيب الدقيق الأساسي، فضلا عن أدوات القياس واكتساب جوانب التجارب.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>optical table</td>
			<td>Newport, CA&#160;</td>
			<td>RS4000</td>
			<td>iPALM, installed on 4 Newport Stabilizer vibration isolators&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vibration isolator for optical table</td>
			<td>Newport, CA&#160;</td>
			<td>S-2000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laser-642</td>
			<td>Newport, CA&#160;</td>
			<td>1185055</td>
			<td>output power=100mw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laser-561</td>
			<td>Newport, CA&#160;</td>
			<td>1168931</td>
			<td>output power=200mw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laser-488</td>
			<td>Newport, CA&#160;</td>
			<td>1137970</td>
			<td>output power=200mw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laser-405</td>
			<td>Newport, CA&#160;</td>
			<td>1142279</td>
			<td>output power=100mw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>broadband dielectric mirrors&#160;</td>
			<td>Thorlabs, NJ</td>
			<td>BB1-E02</td>
			<td>laser combiner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dichroic beamsplitter&#160;</td>
			<td>Semrock, NY</td>
			<td>LM01-427-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acousto-optic tunable filter&#160;</td>
			<td>AA Opto-Electronic, France</td>
			<td>AOTFnC-VIS-TN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linear polarizer</td>
			<td>Newport, CA&#160;</td>
			<td>05LP-VIS-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>baseplate</td>
			<td>local workshop</td>
			<td>customized</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>turning mirror (22.5&#176;)</td>
			<td>Reynard Corpporation, CA</td>
			<td>customized</td>
			<td>22.5&#176; mirror</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>motorized optic mounts&#160;</td>
			<td>New Focus, CA</td>
			<td>8816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>motorized XYZ translation stage</td>
			<td>Thorlabs, NJ</td>
			<td>MT3/M-Z6</td>
			<td>sample holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-Cube DC servo motor controller</td>
			<td>Thorlabs, NJ</td>
			<td>TDC001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piezo Phase Shifter</td>
			<td>Physik Instrumente, Germany</td>
			<td>S-303.CD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>objective lens</td>
			<td>Nikon, Japan</td>
			<td>MRD01691</td>
			<td>objective. Apo TIRF 60X/1.49oil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>translation stage</td>
			<td>New Focus, CA</td>
			<td>9062-COM-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pico Motor Actuator</td>
			<td>New Focus, CA</td>
			<td>8301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rotary Solenoid/Shutter</td>
			<td>DACO Instruments, CT</td>
			<td>5423-458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-way beam splitter</td>
			<td>Rocky Mountain Instruments, CO</td>
			<td>customized</td>
			<td>beamsplitter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piezo Z/Tip/Tilt scanner</td>
			<td>Physik Instrumente, Germany</td>
			<td>S-316.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>motorized five-axis tilt aligner&#160;</td>
			<td>New Focus, CA</td>
			<td>8081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picmotor ethernet controller</td>
			<td>New Focus, CA</td>
			<td>8752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piezo controllers/amplifier/digital operation module</td>
			<td>Physik Instrumente, Germany</td>
			<td>E-509/E-503/E-517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>band-pass filter</td>
			<td>Semrock, NY</td>
			<td>FF01-523/20</td>
			<td>filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>band-pass filter</td>
			<td>Semrock, NY</td>
			<td>FF01-588/21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>band-pass filter</td>
			<td>Semrock, NY</td>
			<td>FF01-607/30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>band-pass filter</td>
			<td>Semrock, NY</td>
			<td>FF01-676/37</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>notch filter</td>
			<td>Semrock, NY</td>
			<td>NF01-405/488/561/635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>motorized filter wheel with controllter</td>
			<td>Thorlabs, NJ</td>
			<td>FW103H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD</td>
			<td>Andor, UK&#160;</td>
			<td>DU-897U-CSO-#BV</td>
			<td>3 sets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desktop computers for controlling cameras and synchronization</td>
			<td>Dell</td>
			<td>Precision T3500</td>
			<td>PC, 4 sets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coverslips with fiducial</td>
			<td>Hestzig, VA</td>
			<td>600-100AuF</td>
			<td>sample preparation. fiducial marks with various density and spectra&#160; available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fibronectin&#160;</td>
			<td>Millipore, MT</td>
			<td>FC010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, PA</td>
			<td>15710</td>
			<td>fixation. 16%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glutaraldehyde&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, PA</td>
			<td>16220</td>
			<td>25%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>triton X-100</td>
			<td>Sigma aldrich, MO</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HUVEC cells</td>
			<td>Life Technologies, CA</td>
			<td>C-015-10C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 200</td>
			<td>Life Technologies, CA</td>
			<td>M-200-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Vessel Endothelial Factors</td>
			<td>Life Technologies, CA</td>
			<td>A14608-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td></td>
			<td>14190367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pennicillin/Streptomycin</td>
			<td></td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Life Technologies, CA</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Sigma aldrich, MO</td>
			<td>P1851</td>
			<td>PHEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>1st base, Malaysia</td>
			<td>BIO-1825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma aldrich, MO</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Millipore, MT</td>
			<td>5985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Alexa Fluor 647 Phalloidin</td>
			<td>Invitrogen, CA</td>
			<td>A22287</td>
			<td>staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium borohydride (NaBH4)&#160;</td>
			<td>Sigma aldrich, MO</td>
			<td>480886</td>
			<td>quenching</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose</td>
			<td>1st base, Malaysia</td>
			<td>BIO-1101</td>
			<td>imaging buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose oxidase</td>
			<td>Sigma aldrich, MO</td>
			<td>G2133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>catalase</td>
			<td>Sigma aldrich, MO</td>
			<td>C9322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cysteamine&#160;</td>
			<td>Sigma aldrich, MO</td>
			<td>30070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy</td>
			<td>Thorlabs, NJ</td>
			<td>G14250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vaseline</td>
			<td>Sigma aldrich, MO</td>
			<td>16415</td>
			<td>sample sealing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lanolin</td>
			<td>Sigma aldrich, MO</td>
			<td>L7387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>parafin wax</td>
			<td>Sigma aldrich, MO</td>
			<td>327204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, PA</td>
			<td>16915-04</td>
			<td>imaging. Cargille Type HF</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional super resolution microscopy of f-actin filaments by interferometric photoactivated localization microscopy (ipalm)

مضان المجهر يمكن رؤية مباشرة من الجزيئات الحيوية محددة داخل الخلايا. ومع ذلك، للفحص المجهري مضان التقليدية، ويقتصر القرار المكانية التي الحيود إلى ~ 200 نانومتر داخل الطائرة صورة و&gt; 500 نانومتر على طول المحور البصري. ونتيجة لذلك، المجهر مضان منذ فترة طويلة محدودة للغاية في مراقبة ملامح التركيبية داخل الخلايا. والتغلب على التطورات الأخيرة في طرق الفحص المجهري سوبر القرار هذا الحد. على وجه الخصوص، وظهور fluorophores photoswitchable تمكن القائم على توطين سوبر قرار المجهري، والتي تنص على حل السلطة يقترب من النطاق طول الجزيئي. هنا، نحن تصف تطبيق سوبر طريقة قرار المجهر ثلاثي الأبعاد على أساس واحد جزيء المجهري التعريب والتداخل متعدد المراحل، ودعا التداخل PhotoActivated التعريب المجهري (iPALM). يوفر هذا الأسلوب قرار موحد الخواص على ما يقرب منترتيب 20 نانومتر في جميع الأبعاد الثلاثة. بروتوكولات لتصور الهيكل الخلوي الأكتين الخيطية، بما في ذلك إعداد العينات وتشغيل أداة iPALM، توصف هنا. هذه البروتوكولات هي أيضا قابلة للتكيف بسهولة ومفيدة لدراسة الخصائص التركيبية الأخرى في الخلايا.

متطلبات حاسمة لiPALM هي محاذاة، والتسجيل، ومعايرة النظم البصرية. هذه هي اللازمة لضمان التدخل السليم داخل 3 في اتجاه شعاع الخائن شرطا لض تنسيق الاستخراج. لتمكين المراقبة المستمرة، ومصادر نقطة ثابتة من مضان ضرورية. ويمكن تحقيق ذلك باستخدام الفلورسنت ال...

Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy iPALM at JoVE.com

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy iPALM

نقدم بروتوكول لتطبيق التداخل PhotoActivated التعريب المجهري (iPALM)، 3-الأبعاد جزيء واحد توطين طريقة سوبر قرار المجهر، لتصوير الهيكل الخلوي الأكتين في خلايا الثدييات ملتصقة. هذا النهج يسمح التصور القائم خفيفة من الميزات الهيكلية النانوية التي من شأنها أن تبقى على خلاف ذلك دون حل نتيجة التقليدي المجهر الضوئي محدودة الحيود.

ثلاثي الأبعاد فائقة الدقة المجهر من الشعيرات F-أكتين من التداخل PhotoActivated التعريب المجهري (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial ...

Research

JoVE Journal

Biology

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM)

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

يعيش التصوير خلية من طراز F - أكتين حيوية عن طريق الميكروسكوب الرقطة نيون (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

نانو FEM: تعريب البروتين عن طريق الصور التي تنشط المجهر التعريب والمجهر الإلكتروني

Mapping the distribution of proteins is essential for understanding the function of proteins in a cell. Fluorescence microscopy is extensively used for ...

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

عينات الاختبار لتحسين STORM فائقة الدقة المجهر

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

إعداد عينة للفحص المجهري للقوة الذرية Virion واحد والتصوير الفلوري فائقة الدقة

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy (f3D-SIM)

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM

فائقة الدقة التصوير من Cytokinetic Z الدائري في البكتيريا تعيش طريق سريع منظم 3D الإضاءة المجهري (F3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

في الجسم الحي تتبع نسيلي من الخلايا الجذعية المكونة للدم والسلف تميزت خمسة البروتينات الفلورية باستخدام الميكروسكوب متحد البؤر وMultiphoton

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

في فيفو تتبع 4 الأبعاد للالجذعية المكونة للدم والسلف الكبار في خلايا الفأر قبي نخاع العظم

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

المصدر المفتوح تحليل واحد الجسيمات لسوبر قرار المجهري مع VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Application of High-speed Super-resolution SPEED Microscopy in Live Primary Cilium

تطبيق القرار فائقة السرعة سرعة الفحص المجهري في هدب الأولية الحية

The primary cilium is a microtubule-based protrusion on the surface of many eukaryotic cells and contains a unique complement of proteins that function ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

إعداد العينات البيولوجية بالتجميد ذات الضغط العالي، وتعزيز النقيض ساعدت الموجات الدقيقة، والحد الأدنى راتنج التضمين لتصوير حجم

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...