Name: three-dimensional super resolution microscopy of f-actin filaments by interferometric photoactivated localization microscopy (ipalm)
Uploaded: 2016-12-01T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy iPALM at JoVE.com

YW ו PK בתודה להכיר תמיכה במימון קרן המחקר הלאומית של סינגפור, הוענק PK (NRF-NRFF-2011-04 ו NRF2012NRF-CRP001-084). אנו מודים גם במתקני מעבדת ליבת מיקרוסקופיה הפתוחים MBI עבור תמיכה בתשתיות.

1. הכנת הדגימה הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאז אותות הקרינה רקע להפריע הקרינה מן תוויות fluorophore, לנקות את coverglasses ידי שטיפה אותם קודם במים דה מיונן (DDH 2 O) ולאחר מכן אוויר ייבוש אותם באמצעות אוויר דחוס. בהמשך לכך, לבצע תחריט הפלזמה שואב פלז...

<ol>
	<li>Kanchanawong, P., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization-based+super-resolution+imaging+of+cellular+structures.">Localization-based super-resolution imaging of cellular structures.</a> Methods Mol Biol. 1046, 59-84 (2013).</li><li>Bertocchi, C., Goh, W. I., Zhang, Z., Kanchanawong, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+imaging+by+super+resolution+fluorescence+microscopy+and+its+emerging+applications+in+biomedical+research.">Nanoscale imaging by super resolution fluorescence microscopy and its emerging applications in biomedical research.</a> Crit Rev Biomed Eng. 41, 281-308 (2013).</li><li>Kanchanawong, P., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+light-based+imaging+of+three-dimensional+cellular+ultrastructure.">Advances in light-based imaging of three-dimensional cellular ultrastructure.</a> Curr Opin Cell Biol. 24, 125-133 (2012).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li><li>Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy.">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophys J. 91, 4258-4272 (2006).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat Methods. 3, 793-795 (2006).</li><li>Heilemann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subdiffraction-resolution+fluorescence+imaging+with+conventional+fluorescent+probes.">Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes.</a> Angew Chem Int Edit. 47, 6172-6176 (2008).</li><li>Sharonov, A., Hochstrasser, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wide-field+subdiffraction+imaging+by+accumulated+binding+of+diffusing+probes.">Wide-field subdiffraction imaging by accumulated binding of diffusing probes.</a> P Natl Acad Sci USA. 103, 18911-18916 (2006).</li><li>F&#246;lling, J., Bossi, M., Bock, H., Medda, R., Wurm, C. A., Hein, B., Jakobs, S., Eggeling, C., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+nanoscopy+by+ground-state+depletion+and+single-molecule+return.">Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return.</a> Nat Methods. 5, 943-945 (2008).</li><li>Biteen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-moldecule+active-control+microscopy+(SMACM)+with+photo-reactivable+EYFP+for+imaging+biophysical+processes+in+live+cells.">Single-moldecule active-control microscopy (SMACM) with photo-reactivable EYFP for imaging biophysical processes in live cells.</a> Nat Methods. 5, 947-949 (2008).</li><li>Shtengel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferometric+fluorescent+super-resolution+microscopy+resolves+3D+cellular+ultrastructure.">Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure.</a> P Natl Acad Sci USA. 106, 3125-3130 (2009).</li><li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+super-resolution+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy.">Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy.</a> Science. 319, 810-813 (2008).</li><li>Dani, A., Huang, B., Bergan, J., Dulac, C., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super+resolution+imaging+of+chemical+synapses+in+the+brain.">Super resolution imaging of chemical synapses in the brain.</a> Neuron. 68, 843-856 (2010).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Talin+determines+the+nanoscale+architecture+of+focal+adhesions.">Talin determines the nanoscale architecture of focal adhesions.</a> P Natl Acad Sci USA. 112 (35), E4864-E4873 (2015).</li><li>Kanchanawong, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+architecture+of+integrin-based+cell+adhesions.">Nanoscale architecture of integrin-based cell adhesions.</a> Nature. 468, 580-584 (2010).</li><li>Wu, Y., Kanchanawong, P., Zaidel-Bar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin-delimited+adhesion-independent+clustering+of+e-cadherin+forms+the+nanoscale+building+blocks+of+adherens+junctions.">Actin-delimited adhesion-independent clustering of e-cadherin forms the nanoscale building blocks of adherens junctions.</a> Dev Cell. 32 (2), 139-154 (2015).</li><li>Szymborska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+Pore+Scaffold+Structure+Analyzed+by+Super-Resolution+Microscopy+and+Particle+Averaging.">Nuclear Pore Scaffold Structure Analyzed by Super-Resolution Microscopy and Particle Averaging.</a> Science. 341, 655-658 (2013).</li><li>Lawo, S., Hasegan, M., Gupta, G. D., Pelletier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subdiffraction+imaging+of+centrosomes+reveals+higher-order+organizational+features+of+pericentriolar+material.">Subdiffraction imaging of centrosomes reveals higher-order organizational features of pericentriolar material.</a> Nat Cell Biol. 14, 1148-1158 (2012).</li><li>Mennella, V., Agard, D. A., Huang, B., Pelletier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amorphous+no+more:+subdiffraction+view+of+the+pericentriolar+material+architecture.">Amorphous no more: subdiffraction view of the pericentriolar material architecture.</a> Trends Cell Biol. 24, 188-197 (2014).</li><li>Mennella, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subdiffraction-resolution+fluorescence+microscopy+reveals+a+domain+of+the+centrosome+critical+for+pericentriolar+material+organization.">Subdiffraction-resolution fluorescence microscopy reveals a domain of the centrosome critical for pericentriolar material organization.</a> Nat Cell Biology. 14, 1159-1168 (2012).</li><li>Fletcher, D. A., Mullins, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+mechanics+and+the+cytoskeleton.">Cell mechanics and the cytoskeleton.</a> Nature. 463, 485-492 (2010).</li><li>Salbreux, G., Charras, G., Paluch, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+cortex+mechanics+and+cellular+morphogenesis.">Actin cortex mechanics and cellular morphogenesis.</a> Trends Cell Biol. 22, 536-545 (2012).</li><li>Shtengel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cellular+ultrastructure+by+PALM,+iPALM,+and+correlative+iPALM-EM.">Imaging cellular ultrastructure by PALM, iPALM, and correlative iPALM-EM.</a> Method Cell Biol. 123, 273-294 (2014).</li><li>Juette, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+sub-100+nm+resolution+fluorescence+microscopy+of+thick+samples.">Three-dimensional sub-100 nm resolution fluorescence microscopy of thick samples.</a> Nat Methods. 5, 527-529 (2008).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivatable+fluorescent+proteins+for+diffraction-limited+and+super-resolution+imaging.">Photoactivatable fluorescent proteins for diffraction-limited and super-resolution imaging.</a> Trends Cell Biol. 19, 555-565 (2009).</li><li>Shannon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Communication+in+the+presence+of+noise.">Communication in the presence of noise.</a> Proc. IRE. 37, 10-21 (1949).</li><li>Good, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+ion+buffers+for+biological+research.">Hydrogen ion buffers for biological research.</a> Biochemistry. 5, 467-477 (1966).</li><li>Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+oxygen+scavenging+system+for+improvement+of+dye+stability+in+single-molecule+fluorescence+experiments.">An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments.</a> Biophys J. 94, 1826-1835 (2008).</li><li>Shin, W. D., Goldman, R. D., Swedlow, J. R., Spector, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Live Cell Imaging: A Laboratory Manual. , (2010).</li><li>Aquino, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-color+nanoscopy+of+three-dimensional+volumes+by+4Pi+detection+of+stochastically+switched+fluorophores.">Two-color nanoscopy of three-dimensional volumes by 4Pi detection of stochastically switched fluorophores.</a> Nat Methods. 8, 353-359 (2011).</li><li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging.">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nat Methods. 8, 1027-1036 (2011).</li><li>Pertsinidis, A., Zhang, Y., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subnanometre+single-molecule+localization,+registration+and+distance+measurements.">Subnanometre single-molecule localization, registration and distance measurements.</a> Nature. 466, 647-651 (2010).</li><li>Baddeley, D., Cannell, M. B., Soeller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+Localization+Microscopy+Data.">Visualization of Localization Microscopy Data.</a> Microsc Microanal. 16, 64-72 (2010).</li><li>El Beheiry, M., Dahan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ViSP:+representing+single-particle+localizations+in+three+dimensions.">ViSP: representing single-particle localizations in three dimensions.</a> Nat Methods. 10, 689-690 (2013).</li><li>Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunolabeling+artifacts+and+the+need+for+live-cell+imaging.">Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging.</a> Nat Methods. 9, 152-158 (2012).</li><li>Shroff, H., Galbraith, C. G., Galbraith, J. A., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+photoactivated+localization+microscopy+of+nanoscale+adhesion+dynamics.">Live-cell photoactivated localization microscopy of nanoscale adhesion dynamics.</a> Nat Methods. 5, 417-423 (2008).</li><li>Yamashiro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+single-molecule+speckle+microscopy+reveals+modification+of+the+retrograde+actin+flow+by+focal+adhesions+at+nanometer+scales.">New single-molecule speckle microscopy reveals modification of the retrograde actin flow by focal adhesions at nanometer scales.</a> Mol Biol Cell. 25, 1010-1024 (2014).</li><li>Shroff, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-color+super+resolution+imaging+of+genetically+expressed+probes+within+individual+adhesion+complexes.">Dual-color super resolution imaging of genetically expressed probes within individual adhesion complexes.</a> P Natl Acad Sci USA. 104, 20308-20313 (2007).</li><li>Chen, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lattice+light-sheet+microscopy:+imaging+molecules+to+embryos+at+high+spatiotemporal+resolution.">Lattice light-sheet microscopy: imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution.</a> Science. 346, (2014).</li><li>Brown, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super+resolution+fluorescence+imaging+of+mitochondrial+nucleoids+reveals+their+spatial+range,+limits,+and+membrane+interaction.">Super resolution fluorescence imaging of mitochondrial nucleoids reveals their spatial range, limits, and membrane interaction.</a> Mol Cell Biol. 31, 4994-5010 (2011).</li><li>Huang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Video-rate+nanoscopy+using+sCMOS+camera-specific+single-molecule+localization+algorithms.">Video-rate nanoscopy using sCMOS camera-specific single-molecule localization algorithms.</a> Nat Methods. 10, 653-658 (2013).</li><li>Daostorm, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DAOSTORM:+an+algorithm+for+high-density+super-resolution+microscopy.">DAOSTORM: an algorithm for high-density super-resolution microscopy.</a> Nat methods. 8, 279 (2011).</li><li>Zhu, L., Zhang, W., Elnatan, D., Huang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Faster+STORM+using+compressed+sensing.">Faster STORM using compressed sensing.</a> Nat Methods. 9, 721-723 (2012).</li><li>Van Engelenburg, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+ESCRT+machinery+at+HIV+assembly+sites+reveals+virus+scaffolding+of+ESCRT+subunits.">Distribution of ESCRT machinery at HIV assembly sites reveals virus scaffolding of ESCRT subunits.</a> Science. 343, 653-656 (2014).</li><li>Vaughan, J. C., Jia, S., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrabright+photoactivatable+fluorophores+created+by+reductive+caging.">Ultrabright photoactivatable fluorophores created by reductive caging.</a> Nat Methods. 9, 1181-1184 (2012).</li></ol>

המערכת האופטית של iPALM מבוסס על עיצוב המטרה 4-π כפול מתנגדים, כפי שמוצג באיור 1 א. ההתקנה נבנתה באמצעות שני-מותאם אישית במכונה ומסחרי חלקים אופטו-מכאני, כפי שתוארה קודם לכן 23 ו המפורטים בטבלת 1. בנוסף ההתקנה שלנו, המכון הרפואי הווארד יוז (H...

הדמיה של מבנים הסלולר מורכב כבר זמן רב חלק בלתי נפרד תובנות ביולוגיות וגילוי. למרות מיקרוסקופ פלואורסצנטי יכולים תאי תמונה עם ייחוד מולקולרי גבוה, כושר ההפרדה שלה הוא מוגבל על ידי דיפרקציה ל ~ 200 ננומטר במישור התמונה (x, y, או ממד לרוחב) ו&gt; 500 ננומטר לאורך הציר האופטי (z, או ממד צירי) 1,2. לפיכך, התצפית של תכונות ultrastructural הסטוריות הוגבלה במיקרוסקופ אלקטרונים (EM). למרבה המזל, ההתפתחות האחרונה של מיקרוסקופיה ברזולוציה סופר עקפה ממגבלה זו, מה שמאפשרת רזולוציה מרחבית של 10 - המגוון 100 ננומטר 1-6. בפרט, ברזולוציה סופר גישות המבוססת על לוקליזציה מולקולה בודדת, מוכרת בראשי תיבות כגון PALM (מיקרוסקופי לוקליזציה PhotoActivated) 4, FPALM (מיקרוסקופי לוקליזציה PhotoActivated קרינה) 5 (ד) STORM (מיקרוסקופי שחזור אופטי סטוכסטיים ישיר) 6,7, צבע ( Poהצטברות int עבור טופוגרפית ננו הדמיה) 8, GSDIM (קרקע מדינת דלדול מיקרוסקופי ואחריו לחזור מולקולרי בודד) 9, או SMACM (מולקולה בודדת Active-Control מיקרוסקופית) 10, וכן 3-ממדי (3D) ליישומם, כגון PALM interferometric (iPALM) 11 או 3D-STORM 12, כבר ערך בחשיפת תובנה רומן לתוך הארגון בקנה המידה ננומטרי של מבנים ביולוגיים רבים, בם אקסונים עצביים וסינפסות 13, מוקדי הידבקויות 14,15, צמתי תאי תאים 16, גרעיני נקבובי 17 , ו centrosomes 18-20, עד כמה שם. תכונה נוספת ultrastructural בתאים עבורו מיקרוסקופ ברזולוציה סופר הוא שעשוי להיות שימושי הוא cytoskeleton אקטין. Meshwork המורכב של filamentous (ו) -actin בקליפת התא ממלא תפקיד חיוני בבקרה של צורה הסלולר תכונות מכאניות 21. ארגון of F- יקטין הוא פעיל באופן דינמי מוסדר אף חלבוני רגולטורים רבים משפיעים במידה רבה על פילמור, crosslinking, מחזור, יציבות, טופולוגיית רשת 22. עם זאת, למרות האפיון של אדריכלות meshwork F- יקטין חשוב תובנות מכניסטית לתוך מגוון רחב של תהליכים תאיים, בגודל הקטן (~ 8 ננומטר) של חוטי F- יקטין סלים לקיומם על ידי מיקרוסקופ אור-מוגבל עקיפה הקונבנציונלית; וכך, ההדמיה של מבנה עדין יקטין עד כה בוצעה באופן בלעדי על ידי EM. כאן אנו מתארים פרוטוקולים המאפשרים הדמית שלד תא F- יקטין בתאי יונקים חסידים, באמצעות טכניקת מיקרוסקופיה סופר רזולוצית iPALM לנצל יכולת הדיוק שלה גבוהה מאוד ב -3 D 11,23. למרות המכשיר iPALM מתמחה מאוד, הדרכה על הגדרת מכשיר כזה תוארה באחרונה 23, תוך גישה למיקרוסקופ iPALM בהנחיית הובמחלקה יוז רפואי מכון גם נעשה זמין לקהילה מחקר עם עלות מינימלית. בנוסף, שיטות הכנת הדגימה כפי שתתוארנה בהמשך חלות ישירות גישות ברזולוצית סופר 3D אלטרנטיביות, כמו אלו המבוססים על defocusing אסטיגמאטיק של פונקצית התפשטות נקודה (כוחות הביטחון הפלסטיני) 12 או דו-מטוס זיהוי 24, שהן לזמינות באופן נרחב יותר. נציין כי מרכיב הכרחי עבור מיקרוסקופיה ברזולוציה הסופרת מבוססת לוקליזציה מולקולה בודדת בכלל הוא fluorophore photoswitchable 25, אשר מאפשר שלוש הדרישות הקריטיות עבור מיקרוסקופיה ברזולוציה סופרת מבוססת לוקליזציה מולקולה בודדת להתגשם: אני) מולקולה בודדת גבוהה בהירות יחסית בניגוד לאותות רקע; ii) ותפוצה דלילה של מולקולות בודדות בתוך מסגרת תמונה נתונה; ו- III) צפיפות מרחבית גבוהה של תיוג מספיק כדי ללכוד את הפרופיל של המבנה הבסיסי (הידוע גם בשם נייקוויסט-Shaקריטריון הדגימה nnon) 26. כך, תוצאות משביעות רצון, יש לשים דגש לא פחות משני ההכנה הנכונה של דגימות כדי לייעל photoswitching fluorophore וכדי לשמר את ultrastructure הבסיסית, כמו גם על היבטי מכשור ורכישת הניסויים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>optical table</td>
			<td>Newport, CA&#160;</td>
			<td>RS4000</td>
			<td>iPALM, installed on 4 Newport Stabilizer vibration isolators&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vibration isolator for optical table</td>
			<td>Newport, CA&#160;</td>
			<td>S-2000&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laser-642</td>
			<td>Newport, CA&#160;</td>
			<td>1185055</td>
			<td>output power=100mw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laser-561</td>
			<td>Newport, CA&#160;</td>
			<td>1168931</td>
			<td>output power=200mw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laser-488</td>
			<td>Newport, CA&#160;</td>
			<td>1137970</td>
			<td>output power=200mw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>laser-405</td>
			<td>Newport, CA&#160;</td>
			<td>1142279</td>
			<td>output power=100mw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>broadband dielectric mirrors&#160;</td>
			<td>Thorlabs, NJ</td>
			<td>BB1-E02</td>
			<td>laser combiner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dichroic beamsplitter&#160;</td>
			<td>Semrock, NY</td>
			<td>LM01-427-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acousto-optic tunable filter&#160;</td>
			<td>AA Opto-Electronic, France</td>
			<td>AOTFnC-VIS-TN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linear polarizer</td>
			<td>Newport, CA&#160;</td>
			<td>05LP-VIS-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>baseplate</td>
			<td>local workshop</td>
			<td>customized</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>turning mirror (22.5&#176;)</td>
			<td>Reynard Corpporation, CA</td>
			<td>customized</td>
			<td>22.5&#176; mirror</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>motorized optic mounts&#160;</td>
			<td>New Focus, CA</td>
			<td>8816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>motorized XYZ translation stage</td>
			<td>Thorlabs, NJ</td>
			<td>MT3/M-Z6</td>
			<td>sample holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-Cube DC servo motor controller</td>
			<td>Thorlabs, NJ</td>
			<td>TDC001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piezo Phase Shifter</td>
			<td>Physik Instrumente, Germany</td>
			<td>S-303.CD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>objective lens</td>
			<td>Nikon, Japan</td>
			<td>MRD01691</td>
			<td>objective. Apo TIRF 60X/1.49oil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>translation stage</td>
			<td>New Focus, CA</td>
			<td>9062-COM-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pico Motor Actuator</td>
			<td>New Focus, CA</td>
			<td>8301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rotary Solenoid/Shutter</td>
			<td>DACO Instruments, CT</td>
			<td>5423-458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-way beam splitter</td>
			<td>Rocky Mountain Instruments, CO</td>
			<td>customized</td>
			<td>beamsplitter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piezo Z/Tip/Tilt scanner</td>
			<td>Physik Instrumente, Germany</td>
			<td>S-316.10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>motorized five-axis tilt aligner&#160;</td>
			<td>New Focus, CA</td>
			<td>8081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picmotor ethernet controller</td>
			<td>New Focus, CA</td>
			<td>8752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piezo controllers/amplifier/digital operation module</td>
			<td>Physik Instrumente, Germany</td>
			<td>E-509/E-503/E-517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>band-pass filter</td>
			<td>Semrock, NY</td>
			<td>FF01-523/20</td>
			<td>filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>band-pass filter</td>
			<td>Semrock, NY</td>
			<td>FF01-588/21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>band-pass filter</td>
			<td>Semrock, NY</td>
			<td>FF01-607/30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>band-pass filter</td>
			<td>Semrock, NY</td>
			<td>FF01-676/37</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>notch filter</td>
			<td>Semrock, NY</td>
			<td>NF01-405/488/561/635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>motorized filter wheel with controllter</td>
			<td>Thorlabs, NJ</td>
			<td>FW103H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD</td>
			<td>Andor, UK&#160;</td>
			<td>DU-897U-CSO-#BV</td>
			<td>3 sets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desktop computers for controlling cameras and synchronization</td>
			<td>Dell</td>
			<td>Precision T3500</td>
			<td>PC, 4 sets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coverslips with fiducial</td>
			<td>Hestzig, VA</td>
			<td>600-100AuF</td>
			<td>sample preparation. fiducial marks with various density and spectra&#160; available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fibronectin&#160;</td>
			<td>Millipore, MT</td>
			<td>FC010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, PA</td>
			<td>15710</td>
			<td>fixation. 16%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glutaraldehyde&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, PA</td>
			<td>16220</td>
			<td>25%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>triton X-100</td>
			<td>Sigma aldrich, MO</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HUVEC cells</td>
			<td>Life Technologies, CA</td>
			<td>C-015-10C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 200</td>
			<td>Life Technologies, CA</td>
			<td>M-200-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Vessel Endothelial Factors</td>
			<td>Life Technologies, CA</td>
			<td>A14608-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td></td>
			<td>14190367</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pennicillin/Streptomycin</td>
			<td></td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Life Technologies, CA</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Sigma aldrich, MO</td>
			<td>P1851</td>
			<td>PHEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>1st base, Malaysia</td>
			<td>BIO-1825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma aldrich, MO</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Millipore, MT</td>
			<td>5985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Alexa Fluor 647 Phalloidin</td>
			<td>Invitrogen, CA</td>
			<td>A22287</td>
			<td>staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium borohydride (NaBH4)&#160;</td>
			<td>Sigma aldrich, MO</td>
			<td>480886</td>
			<td>quenching</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose</td>
			<td>1st base, Malaysia</td>
			<td>BIO-1101</td>
			<td>imaging buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose oxidase</td>
			<td>Sigma aldrich, MO</td>
			<td>G2133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>catalase</td>
			<td>Sigma aldrich, MO</td>
			<td>C9322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cysteamine&#160;</td>
			<td>Sigma aldrich, MO</td>
			<td>30070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy</td>
			<td>Thorlabs, NJ</td>
			<td>G14250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vaseline</td>
			<td>Sigma aldrich, MO</td>
			<td>16415</td>
			<td>sample sealing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lanolin</td>
			<td>Sigma aldrich, MO</td>
			<td>L7387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>parafin wax</td>
			<td>Sigma aldrich, MO</td>
			<td>327204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, PA</td>
			<td>16915-04</td>
			<td>imaging. Cargille Type HF</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional super resolution microscopy of f-actin filaments by interferometric photoactivated localization microscopy (ipalm)

מיקרוסקופ פלואורסצנטי מאפשר הדמיה ישירה של ביומולקולות ספציפיות בתוך תאים. עם זאת, עבור מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונבנציונאלי, ברזולוציה מרחבית מוגבלת על ידי עקיפה ל ~ 200 ננומטר בתוך המטוס תמונה&gt; 500 ננומטר לאורך הציר האופטי. כתוצאה מכך, מיקרוסקופ פלואורסצנטי ארוך הוגבל קשות בהתבוננות תכונות ultrastructural בתוך תאים. ההתפתחות האחרונה של שיטות מיקרוסקופיה ברזולוציה סופר יש להתגבר על מגבלה זו. בפרט, כניסתו של fluorophores photoswitchable מאפשרת מיקרוסקופיה ברזולוציה סופרת מבוסס לוקליזציה, המספקת כושר הפרדה מתקרב המולקולרי באורך. כאן אנו מתארים את היישום של שיטה מיקרוסקופית תלת ממדי סופר רזולוציה המבוססת על מיקרוסקופיה לוקליזציה מולקולה בודדת ו interferometry רב שלבית, שנקראה interferometric PhotoActivated לוקליזציה מיקרוסקופי (iPALM). שיטה זו מספקת רזולוציה איזוטרופיים כמעט עלבסדר גודל של 20 ננומטר בכל שלושת הממדים. פרוטוקולים לדמיין את cytoskeleton יקטין פילמנטיות, כולל הכנת דגימת פעולת מכשיר iPALM, מתוארים כאן. פרוטוקולים אלה הם גם להתאמה ומאלף בקלות לחקר תכונות ultrastructural אחרות בתאים.

דרישות קריטיות עבור iPALM הם יישור, רישום, וכיול של מערכות אופטיות. אלה נחוצים כדי להבטיח הפרעות מתאימיבתוך הנדרשים קרן splitter 3 כיוונים עבור z לתאם חילוץ. כדי לאפשר ניטור רציף, ממקורות נקודות קבועים של קרינה נחוצים. זו יכולה להיות מושגת באמצעות פלורסנט Au ...

Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy iPALM at JoVE.com

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy iPALM

אנו מציגים פרוטוקול עבור היישום של interferometric PhotoActivated לוקליזציה מיקרוסקופי (iPALM), שיטה מיקרוסקופית 3 ממדי מולקולה בודדת לוקליזציה סופר רזולוציה, אל ההדמיה של שלד התא יקטין בתאי יונקים חסידים. גישה זו מאפשרת הדמיה מבוססת אור של תכונות מבניות ננו שאחרת נותרו לא פתורים על ידי מיקרוסקופיה אופטית-מוגבל עקיפה קונבנציונלית.

תלת מימדי סופר רזולוציה מיקרוסקופית של סיבים F- אקטין ידי interferometric PhotoActivated לוקליזציה מיקרוסקופית (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial ...

Research

JoVE Journal

Biology

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM)

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

דימות של תא חי F-אקטין Dynamics באמצעות פלורסנט מיקרוסקופית רבב (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

ננו פאם: לוקליזציה חלבון באמצעות מיקרוסקופ לוקליזציה תמונה מופעלת ומיקרוסקופי אלקטרונים

Mapping the distribution of proteins is essential for understanding the function of proteins in a cell. Fluorescence microscopy is extensively used for ...

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

דוגמאות מבחן לייעול STORM סופר רזולוציה מיקרוסקופית

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

הכנה לדוגמה למיקרוסקופיה של כוח אטומי של Virion יחיד והדמיית פלואורסצנטיות ברזולוציה גבוהה במיוחד

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy (f3D-SIM)

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM

הדמיה ברזולוציה סופר של Cytokinetic Z הטבעת בחיידקים חיים באמצעות-Structured 3D מהיר תאורה מיקרוסקופית (f3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

במשובט מעקב vivo של גזע hematopoietic ובתאים המסומנים על ידי חמישה חלבונים ניאון באמצעות Confocal וmultiphoton מיקרוסקופית

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

במעקב 4 ממדי Vivo של תאי גזע ואבות היווצרות דם במבוגרי עכבר calvarial מח עצם

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

ניתוח קוד פתוח Single-חלקיק למיקרוסקופיה סופר-רזולוציה עם VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Application of High-speed Super-resolution SPEED Microscopy in Live Primary Cilium

יישום של מיקרוסקופיית מהירות רזולוציה סופר מהיר ב ריסי העיקרי בשידור חי

The primary cilium is a microtubule-based protrusion on the surface of many eukaryotic cells and contains a unique complement of proteins that function ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

הכנת הדוגמא ביולוגית על ידי הקפאת בלחץ גבוה, שיפור ניגודיות בסיוע מיקרוגל, ושרף מינימלי הטמעה של אמצעי הדמיה

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...