Name: preparation of raav9 to overexpress or knockdown genes in mouse hearts
Uploaded: 2016-12-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts at JoVE.com

We thank Dr. Zaffar Haque for careful reading of the manuscript. We thank Drs. Masaharu Kataoka and Gengze Wu for discussions and help. Work in the Wang lab is supported by the American Heart Association, Muscular Dystrophy Association, and NIH (HL085635, HL116919, HL125925).

Alle beskrevne fremgangsmåten ble utført under protokoller godkjent av biosikkerhet komité og Institutional Animal Care og bruk komité Boston barnesykehus. Boston Children Hospital har patogenfrie mus fasiliteter med regulerte lys / mørke sykluser og klimaanlegg. Veterinær og dyrepleie ansatte endrings bur og sikre helsen musene. Fasilitetene er AAALAC sertifisert og har aktiv Animal Welfare Assurance sertifisering (AAALAC Akkreditering Riktignok på 2/24/1992 Animal Welfare Assurance nummer. A3303-01). Musene ble...

<ol>
	<li>Primrose, S. B., Twyman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of gene manipulation and genomics. , (2013).</li><li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9.">The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346, 1258096 (2014).</li><li>Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZFN,+TALEN,+and+CRISPR/Cas-based+methods+for+genome+engineering.">ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering.</a> Trends Biotechnol. 31, 397-405 (2013).</li><li>Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+applications+of+CRISPR-Cas9+for+genome+engineering.">Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering.</a> Cell. 157, 1262-1278 (2014).</li><li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas+systems+for+editing,+regulating+and+targeting+genomes.">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nat. Biotechnol. 32, 347-355 (2014).</li><li>Szulc, J., Wiznerowicz, M., Sauvain, M. -. O., Trono, D., Aebischer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+tool+for+conditional+gene+expression+and+knockdown.">A versatile tool for conditional gene expression and knockdown.</a> Nat. Methods. 3, 109-116 (2006).</li><li>Nimesh, S., Halappanavar, S., Kaushik, N. K., Kumar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+Gene+Delivery+Systems.">Advances in Gene Delivery Systems.</a> BioMed Res. Int. 2015, 610342 (2015).</li><li>Kamimura, K., Suda, T., Zhang, G., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+gene+delivery+systems.">Advances in gene delivery systems.</a> Pharm. Med. 25, 293-306 (2011).</li><li>Thomas, C. E., Ehrhardt, A., Kay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+problems+with+the+use+of+viral+vectors+for+gene+therapy.">Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy.</a> Nat. Rev. Genet. 4, 346-358 (2003).</li><li>Giacca, M., Zacchigna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-mediated+gene+delivery+for+human+gene+therapy.">Virus-mediated gene delivery for human gene therapy.</a> J. Control Release. 161, 377-388 (2012).</li><li>Witlox, M., Lamfers, M., Wuisman, P., Curiel, D., Siegal, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolving+gene+therapy+approaches+for+osteosarcoma+using+viral+vectors:+review.">Evolving gene therapy approaches for osteosarcoma using viral vectors: review.</a> Bone. 40, 797-812 (2007).</li><li>De Miguel, M. P., Cheng, L., Holland, E. C., Federspiel, M. J., Donovan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+the+c-Kit+signaling+pathway+in+mouse+primordial+germ+cells+by+retroviral-mediated+gene+transfer.">Dissection of the c-Kit signaling pathway in mouse primordial germ cells by retroviral-mediated gene transfer.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 10458-10463 (2002).</li><li>Nagano, M., Shinohara, T., Avarbock, M. R., Brinster, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrovirus-mediated+gene+delivery+into+male+germ+line+stem+cells.">Retrovirus-mediated gene delivery into male germ line stem cells.</a> FEBS Lett. 475, 7-10 (2000).</li><li>Scharfmann, R., Axelrod, J. H., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+expression+of+retrovirus-mediated+gene+transfer+in+mouse+fibroblast+implants.">Long-term in vivo expression of retrovirus-mediated gene transfer in mouse fibroblast implants.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, 4626-4630 (1991).</li><li>Katz, R. A., Greger, J. G., Skalka, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cell+cycle+status+on+early+events+in+retroviral+replication.">Effects of cell cycle status on early events in retroviral replication.</a> J. Cell. Biochem. 94, 880-889 (2005).</li><li>Escors, D., Breckpot, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors+in+gene+therapy:+their+current+status+and+future+potential.">Lentiviral vectors in gene therapy: their current status and future potential.</a> Arch. Immunol. Ther. Exp. 58, 107-119 (2010).</li><li>M&#225;trai, J., Chuah, M. K., VandenDriessche, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+lentiviral+vector+development+and+applications.">Recent advances in lentiviral vector development and applications.</a> Mol. Ther. 18, 477-490 (2010).</li><li>Miyazaki, Y., Miyake, A., Nomaguchi, M., Adachi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+dynamics+of+retroviral+genome+and+the+packaging.">Structural dynamics of retroviral genome and the packaging.</a> Front. Microbiol. 2, 1-9 (2011).</li><li>Douglas, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-Mediated+Gene+Delivery.">Adenovirus-Mediated Gene Delivery.</a> Gene Delivery to Mammalian Cells: Volume 2: Viral Gene Transfer Techniques. , 3-14 (2004).</li><li>Armend&#225;riz-Borunda, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+first+generation+adenoviral+vectors+for+preclinical+protocols:+amplification,+purification+and+functional+titration.">Production of first generation adenoviral vectors for preclinical protocols: amplification, purification and functional titration.</a> J. Biosci. Bioeng. 112, 415-421 (2011).</li><li>Snyder, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus-mediated+gene+delivery.">Adeno-associated virus-mediated gene delivery.</a> J Gene Med. 1, 166-175 (1999).</li><li>Samulski, R. J., Muzyczka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV-mediated+gene+therapy+for+research+and+therapeutic+purposes.">AAV-mediated gene therapy for research and therapeutic purposes.</a> Annu. Rev. Virol. 1, 427-451 (2014).</li><li>Kaplitt, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+gene+transfer+in+porcine+myocardium+after+coronary+infusion+of+an+adeno-associated+virus+vector.">Long-term gene transfer in porcine myocardium after coronary infusion of an adeno-associated virus vector.</a> Ann. Thorac. Surg. 62, 1669-1676 (1996).</li><li>Kaspar, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+gene+transfer+and+long-term+expression+following+intracoronary+delivery+of+adeno-associated+virus.">Myocardial gene transfer and long-term expression following intracoronary delivery of adeno-associated virus.</a> J. Gene. Med. 7, 316-324 (2005).</li><li>Ding, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trbp+regulates+heart+function+through+microRNA-mediated+Sox6+repression.">Trbp regulates heart function through microRNA-mediated Sox6 repression.</a> Nat. Genet. 47, 776-783 (2015).</li><li>Lin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac-specific+YAP+activation+improves+cardiac+function+and+survival+in+an+experimental+murine+MI+model.">Cardiac-specific YAP activation improves cardiac function and survival in an experimental murine MI model.</a> Circ. Res. 115, 354-363 (2014).</li><li>Wahlquist, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+miR-25+improves+cardiac+contractility+in+the+failing+heart.">Inhibition of miR-25 improves cardiac contractility in the failing heart.</a> Nature. 508, 531-535 (2014).</li><li>Carroll, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+for+adult+cardiac-specific+gene+deletion+with+CRISPR/Cas9.">A mouse model for adult cardiac-specific gene deletion with CRISPR/Cas9.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 113, 338-343 (2016).</li><li>Jiang, J., Wakimoto, H., Seidman, J., Seidman, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allele-specific+silencing+of+mutant+Myh6+transcripts+in+mice+suppresses+hypertrophic+cardiomyopathy.">Allele-specific silencing of mutant Myh6 transcripts in mice suppresses hypertrophic cardiomyopathy.</a> Science. 342, 111-114 (2013).</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nat. Methods. 6, 343-345 (2009).</li><li>Rychlik, W., Spencer, W., Rhoads, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+annealing+temperature+for+DNA+amplification+in+vitro.">Optimization of the annealing temperature for DNA amplification in vitro.</a> Nucleic Acids Res. 18, 6409-6412 (1990).</li><li>Allocca, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotype-dependent+packaging+of+large+genes+in+adeno-associated+viral+vectors+results+in+effective+gene+delivery+in+mice.">Serotype-dependent packaging of large genes in adeno-associated viral vectors results in effective gene delivery in mice.</a> J. Clin. Invest. 118, 1955-1964 (2008).</li><li>Wu, Z., Yang, H., Colosi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+genome+size+on+AAV+vector+packaging.">Effect of genome size on AAV vector packaging.</a> Mol. Ther. 18, 80-86 (2010).</li><li>Li, J., Sun, W., Wang, B., Xiao, X., Liu, X. -. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+trans-splicing+as+a+means+for+viral+vector-mediated+in+vivo+gene+therapy.">Protein trans-splicing as a means for viral vector-mediated in vivo gene therapy.</a> Hum. Gene Ther. 19, 958-964 (2008).</li><li>Piras, B. A., O'Connor, D. M., French, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+delivery+of+shRNA+by+AAV9+provides+highly+efficient+knockdown+of+ubiquitously+expressed+GFP+in+mouse+heart,+but+not+liver.">Systemic delivery of shRNA by AAV9 provides highly efficient knockdown of ubiquitously expressed GFP in mouse heart, but not liver.</a> PLoS One. 8, e75894 (2013).</li><li>Lovric, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terminal+differentiation+of+cardiac+and+skeletal+myocytes+induces+permissivity+to+AAV+transduction+by+relieving+inhibition+imposed+by+DNA+damage+response+proteins.">Terminal differentiation of cardiac and skeletal myocytes induces permissivity to AAV transduction by relieving inhibition imposed by DNA damage response proteins.</a> Mol. Ther. 20, 2087-2097 (2012).</li></ol>

Det er viktig å minimere uønsket ITR rekombinasjon i løpet av plasmid konstruksjon. Før generering av viruset, må man alltid overvåke ITR integriteten av AAV plasmider ved hjelp av restriksjons spaltning og agarose gelelektroforese. Det er umulig å oppnå 100% intakte plasmidene, men den rekombinasjon forholdet bør minimaliseres så mye som mulig. Mindre enn 20% er akseptabelt for vellykket rAAV9 emballasje. Av notatet, kan dyrking bakterier ved lavere temperatur (30 ° C) med en lavere ristehastigheten (180-200...

A correction was made to the Authors section in: <a href="http://www.jove.com/video/54787">Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts</a>.
One of the authors names and affiliation was corrected from:
Jian-Ming Jiang3,4 
3 Department of Genetics, Harvard Medical School 
4 Howard Hughes Medical Institute
to:
Jianming Jiang5 
5 Department of Biochemistry, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore

A correction was made to the Authors section in: <a href="http://www.jove.com/video/54787">Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts</a>.

Erratum: Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts

Kontrollere ekspresjonen eller aktiviteten av spesifikke gener i forskjellige biologiske systemer har blitt en verdifull strategi i studier av genfunksjon 1. En direkte måte å oppnå dette målet er å manipulere nukleotidsekvenser og generere mutante alleler. Selv om å lage nøyaktige, målrettet endres til genomet av levende celler er fremdeles en tidkrevende og arbeidskrevende praksis, har utviklingen av de kraftige Talen og Crispr / Cas9 verktøy åpnet en ny æra av genom redigering 2-5. En mer rutinemessig laboratoriemetode for genmanipulering har fokusert på innføring av genetisk materiale (DNA-er og RNA-er inneholdende kodende sekvenser eller sirnas / shRNAs) inn i cellene for å uttrykke eller knockdown genet (r) av interesse 1,6. I mange tilfeller er det vesentlig flaskehals for genmanipulering er levering av DNA, RNA eller protein inn i cellene. Med hensyn til in vitro-studier effektiv transfectipå systemer har vært etablert i mange dyrkede cellelinjer. Men i musemodellen i særdeleshet, er in vivo genavlevering mer utfordrende. Det finnes en rekke ekstra- og intracellulære hindringer som må omgås for å oppnå effektiv cellulært opptak av de eksogene reagenser. Andre hindringer inkluderer rask rydding og den korte varigheten av den leverte materialer 7,8. En strategi for å omgå disse problemene er å bruke virale vektorer som &quot;bærere&quot; eller &quot;kjøretøy&quot; for in vivo genet levering. De naturlig utviklede transduksjon egenskaper av virus tillater effektiv levering av et gen av interesse til cellene 7,9,10. Tallrike typer av virale vektorer er blitt utviklet og muliggjør fleksibel in vivo genmanipulering i forskjellige celletyper og organer hos mus. Den mest vanlig brukte virale systemer omfatter Retrovirus, Lentivirus, Adenovirus, og adenoassosiert virus (AAV) <sopp&gt; 11. Retrovirus er enkelt-trådet RNA-virus og kan innføre deres genetiske materiale til vertscellegenomet på en stabil måte i løpet av mitotisk deling, og gir potensial for livsvarig ekspresjon av de transduserte gener i målcellene og organer 12-14. Men mange typer av retrovirus bare infisere delende celler, og deres effekt i ikke-delende celler er meget lav 15. Dette begrenser deres nytte for genet levering. Lentivirus er en slekt av den Retroviridae familien. Forskjellig fra andre retrovirus, kan Lentivirus infisere både dele og ikke-delende celler og har vært mye brukt for genoverføring inn i post-mitotisk og høyt differensierte celler 16. Livssyklusen til Lentivirus innebærer også integrasjon av vektor-DNA i vertsgenomet. Således Lentivirus-genavlevering muliggjør stabil og lang varighet ekspresjon av de transduserte genetiske elementer 16-18. Imidlertid kan denne funksjonen representerer en dobbel-edged sverd i bruken av disse virus for å manipulere genekspresjon, som integrering av vektor DNA kan føre til insertional mutagenese i vertscellene og kan føre til gjenstands effekter. Adenovirus er en annen mye brukt genavleveringssystem. I motsetning til retrovirus og lentivirus, adenovirus er ikke-integrert og forstyrrer ikke den genomiske integriteten av vertsceller 8,10,11,19. I tillegg kan adenovirus transfektere DNA inn i mange celletyper, og infeksjon er ikke avhengig av aktiv celledeling 19. En annen viktig egenskap av adenovirus er den enkle vektor rensing, så de virale vektorene har evnen til å bli replikert 19,20. Imidlertid, den store forbeholdet ved dette system er at adenovirus-infeksjon kan utløse sterke immunresponser hos målceller og organer 19, som begrenser dens anvendelse i mange undersøkelser, spesielt i genterapi studier. Sammenlignet med disse ulike types av virale vektorer, rekombinant Adeno-assosiert virus (rAAV) synes å være den ideelle genavleveringssystemet 21,22. Det viser minimal immunogenisitet og patogenitet 23,24. I tillegg rAAV infiserer et bredt spekter av celletyper, inkludert både delende og ikke-delende celler. I de fleste tilfeller betyr rAAV ikke integreres i verts genomer; således er risikoen for uønskede genetiske eller genomiske forandringer i målcellene er lav 22. Nylig har rAAV systemer blitt brukt for in vivo levering av DNA som koder for proteiner, mirnas, shRNAs, og Crispr-gRNAs inn mus hjertemuskelen 23,25-29. Denne metodikken har tilrettelagt grunnleggende undersøkelser og genterapistudier innen kardiovaskulær forskning. Her, til detaljert prosedyre generere rAAV9 vektorer som effektivt overuttrykker eller knockdown gener av interesse i mus hjerter ble beskrevet. Protokollen tilveiebringer en enkel og effektiv metode formanipulere kardial genekspresjon i murine eksperimentelle modeller.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1175">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:575px;">Polyethylenimine, Linear (MW 25,000)</td>
			<td style="width:241px;">Polysciences, Inc.&#160;</td>
			<td style="width:192px;">#23966-2</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:575px;">Tube, Polypropylene, 36.2 mL, 25 x 87 mm, (qty. 56)</td>
			<td style="width:241px;">Beckman Coulter, Inc</td>
			<td style="width:192px;"># 362183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:575px;">Nuclease, ultrapure</td>
			<td style="width:241px;">SIGMA</td>
			<td style="width:192px;">#E8263-25KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:575px;">Density Gradient Medium(Iodixanol)</td>
			<td style="width:241px;">SIGMA</td>
			<td style="width:192px;">#D1556-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:575px;">Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane</td>
			<td style="width:241px;">EMD Millipore Corporation</td>
			<td style="width:192px;">#UFC910008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:575px;">Laboratory pipetting needle with 90&#176; blunt ends,gauge 14, L 6 in., nickel plated hub</td>
			<td style="width:241px;">SIGMA</td>
			<td style="width:192px;">#CAD7942-12EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:575px;">Poloxamer 188 solution (Pluronic&#174; F-68 solution)</td>
			<td style="width:241px;">SIGMA</td>
			<td style="width:192px;">P5556-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:575px;">Proteinase K</td>
			<td style="width:241px;">SIGMA</td>
			<td style="width:192px;">3115828001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:575px;">DNase I</td>
			<td style="width:241px;">Roche</td>
			<td style="width:192px;">10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:575px;">Centrifuge machine</td>
			<td style="width:241px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:192px;">75004260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:575px;">Centrifuge System</td>
			<td style="width:241px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:192px;">363118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:575px;">Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:241px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:192px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:575px;">DMEM medium</td>
			<td style="width:241px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:192px;">SH30243FS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:575px;">Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td style="width:241px;">Atlanta Biologicals&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td style="width:192px;">S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:575px;">rAAV9 vector</td>
			<td style="width:241px;">Penn Vector Core</td>
			<td style="width:192px;">P1967</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of raav9 to overexpress or knockdown genes in mouse hearts

Regulering av ekspresjonen eller aktiviteten av spesifikke gener gjennom myokardialt levering av genetisk materiale i murine modeller tillater undersøkelse av genfunksjoner. Deres terapeutiske potensial i hjertet kan også bestemmes. Det er begrenset tilnærminger for in vivo molekylær intervensjon i mus hjerte. Rekombinant adeno-assosiert virus (rAAV) -basert genom engineering har blitt brukt som et viktig verktøy for in vivo hjerte genmanipulering. De spesifikke fordelene med denne teknologien har høy effektivitet, høy spesifisitet, lav genomisk integrasjon hastighet, minimal immunogenisitet, og minimal patogenitet. Her er en detaljert fremgangsmåte for å konstruere, pakke, og rense rAAV9 vektorer beskrevet. Subkutan injeksjon av rAAV9 inn i neonatale unger resulterer i sterk ekspresjon eller effektiv knockdown av genet (er) av interesse i mus hjertet, men ikke i leveren og andre vev. Bruk av hjerte-spesific TnnT2 promoter, høy ekspresjon av GFP-genet i hjertet ble oppnådd. I tillegg målrette mRNA ble hemmet i hjertet når en rAAV9-U6-shRNA ble benyttet. Kjennskap til rAAV9 teknologi kan være nyttig for kardiovaskulære undersøkelser.

Strategiene for rAAV9 bygging av rAAV9.cTNT :: GFP eller rAAV9.U6 :: shRNA plasmider er vist i figurene 1 og 2, respektivt. Som eksemplene, ble det rAAV9 vektoren som genereres for å overuttrykker GFP-genet i mus hjerter. Det resulterende plasmidet inneholder cTNT :: GFP kassett flankert av to ITR områder (figur 1). Den rAAV9.U6 :: shRNA vektor ble konstruert for å knockdown Trbp mRNA (figur 2) <p class="jove_cont...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts at JoVE.com

Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts

In this manuscript, a method to prepare recombinant adeno-associated virus 9 (rAAV9) vectors to manipulate gene expression in the mouse heart is described.

Forberedelse av rAAV9 å overuttrykker eller Knockdown Gener i Muse Hjerter

Controlling the expression or activity of specific genes through the myocardial delivery of genetic materials in murine models permits the investigation ...

Research

JoVE Journal

Genetics

The Use of Induced Somatic Sector Analysis (ISSA) for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development

The Use of Induced Somatic Sector Analysis ISSA for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development

Bruk av indusert Somatisk Sector Analysis (ISSA) for å studere gener og arrangører involvert i Wood Dannelse og Sekundær Stem Development

Secondary stem growth in trees and associated wood formation are significant both from biological and commercial perspectives. However, relatively little ...

Peptide-derived Method to Transport Genes and Proteins Across Cellular and Organellar Barriers in Plants

Peptide-avledet Metode for å transportere gener og proteiner Across Cellular og Organellar Barrierer i Plants

The capacity to introduce exogenous proteins and express (or down-regulate) specific genes in plants provides a powerful tool for fundamental research as ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Oppdrett og Double-stranded RNA-mediert Gene knockdown i Hide Beetle,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

målrettet<em&gt; I Situ</em&gt; mutagenese av Histone Gener i Budding Gjær

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells (sf9) for Protein Functional Assay

Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells sf9 for Protein Functional Assay

Forbigående uttrykk av utenlandske gener i insekt celler (sf9) for Protein funksjonelle analysen

The transient gene expression system is one of the most important technologies for performing protein functional analysis in the baculovirus in vitro cell ...

Simultaneous Video-EEG-ECG Monitoring to Identify Neurocardiac Dysfunction in Mouse Models of Epilepsy

Samtidige Video-EEG-EKG overvåking for å identifisere Neurocardiac dysfunksjon i musen modeller av epilepsi

In epilepsy, seizures can evoke cardiac rhythm disturbances such as heart rate changes, conduction blocks, asystoles, and arrhythmias, which can ...

qKAT: Quantitative Semi-automated Typing of Killer-cell Immunoglobulin-like Receptor Genes

qKAT: kvantitative Semi-automated å skrive Killer-cellen immunglobulin-lignende reseptor gener

Killer cell immunoglobulin-like receptors (KIRs) are a set of inhibitory and activating immune receptors, on natural killer (NK) and T cells, encoded by a ...

An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells

En in vitro-protokoll for evaluering av MicroRNA nivåer, funksjoner og assosierte mål gener i tumor celler

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory RNAs which are recognized to modulate numerous intracellular signaling pathways in several diseases including ...

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

In vivo Forward genetisk Screen å identifisere Novel nervecellene gener i Drosophila melanogaster

There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic ...

Modulation of Tau Subcellular Localization as a Tool to Investigate the Expression of Disease-related Genes

Modulering av tau Subcellulære lokalisering som et verktøy for å undersøke uttrykk for sykdom-relaterte gener

Tau is a microtubule binding protein expressed in neurons and its main known function is related to the maintenance of cytoskeletal stability. However, ...