Name: thermostabilization, expression, purification, and crystallization of the human serotonin transporter bound to s-citalopram
Uploaded: 2016-11-27T15:00:00
Duration: 12 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram at JoVE.com

We thank D. Cawley for generating monoclonal antibodies. We thank A. Penmatsa and K. Wang for sharing ideas and expertise developed from the dopamine transporter. L. Vaskalis for assistance with figures, H. Owen for help with manuscript preparation and other Gouaux laboratory members for helpful discussions. J.A.C. has support from a Banting postdoctoral fellowship from the Canadian Institutes of Health Research. E.M.G. is supported by the National Science Foundation Graduate Research Fellowship. We are particularly grateful to Bernie and Jennifer LaCroute for their generous support, as well as for funding from the NIH (5R37MH070039). E.G. is an investigator of the Howard Hughes Medical Institute.

<ol>
	<li>Kristensen, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLC6+neurotransmitter+transporters:+structure,+function,+and+regulation.">SLC6 neurotransmitter transporters: structure, function, and regulation.</a> Pharmacol Rev. 63 (3), 585-640 (2011).</li><li>Broer, S., Gether, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+solute+carrier+6+family+of+transporters.">The solute carrier 6 family of transporters.</a> Br J Pharmacol. 167 (2), 256-278 (2012).</li><li>Andersen, J., Kristensen, A. S., Bang-Andersen, B., Stromgaard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+understanding+of+the+interaction+of+antidepressant+drugs+with+serotonin+and+norepinephrine+transporters.">Recent advances in the understanding of the interaction of antidepressant drugs with serotonin and norepinephrine transporters.</a> Chem Commun (Camb). 25 (25), 3677-3692 (2009).</li><li>Hahn, M. K., Blakely, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+impact+of+SLC6+transporter+genetic+variation.">The functional impact of SLC6 transporter genetic variation.</a> Annu Rev Pharmacol Toxicol. 47, 401-441 (2007).</li><li>Abdul-Hussein, S., Andrell, J., Tate, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermostabilisation+of+the+serotonin+transporter+in+a+cocaine-bound+conformation.">Thermostabilisation of the serotonin transporter in a cocaine-bound conformation.</a> J Mol Biol. 425 (12), 2198-2207 (2013).</li><li>Green, E. M., Coleman, J. A., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermostabilization+of+the+human+serotonin+transporter+in+an+antidepressant-Bound+Conformation.">Thermostabilization of the human serotonin transporter in an antidepressant-Bound Conformation.</a> Plos One. 10 (12), e0145688 (2015).</li><li>Goehring, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+and+large-scale+expression+of+membrane+proteins+in+mammalian+cells+for+structural+studies.">Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies.</a> Nat Protoc. 9 (11), 2574-2585 (2014).</li><li>Kawate, T., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-detection+size-exclusion+chromatography+for+precrystallization+screening+of+integral+membrane+proteins.">Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins.</a> Structure. 14 (4), 673-681 (2006).</li><li>De Becker, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adjuvant+monophosphoryl+lipid+A+increases+the+function+of+antigen-presenting+cells.">The adjuvant monophosphoryl lipid A increases the function of antigen-presenting cells.</a> Int Immunol. 12 (6), 807-815 (2000).</li><li>Coleman, J. A., Green, E. M., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+structures+and+mechanism+of+the+human+serotonin+transporter.">X-ray structures and mechanism of the human serotonin transporter.</a> Nature. , (2016).</li><li>White, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+progress+of+membrane+protein+structure+determination.">The progress of membrane protein structure determination.</a> Protein Sci. 13 (7), 1948-1949 (2004).</li><li>Gambotto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenicity+of+enhanced+green+fluorescent+protein+(EGFP)+in+BALB/c+mice:+identification+of+an+H2-Kd-restricted+CTL+epitope.">Immunogenicity of enhanced green fluorescent protein (EGFP) in BALB/c mice: identification of an H2-Kd-restricted CTL epitope.</a> Gene Ther. 7 (23), 2036-2040 (2000).</li><li>Galfre, G., Howe, S. C., Milstein, C., Butcher, G. W., Howard, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+major+histocompatibility+antigens+produced+by+hybrid+cell+lines.">Antibodies to major histocompatibility antigens produced by hybrid cell lines.</a> Nature. 266 (5602), 550-552 (1977).</li><li>Deller, M. C., Kong, L., Rupp, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+stability:+a+crystallographer's+perspective.">Protein stability: a crystallographer's perspective.</a> Acta Crystallogr F Struct Biol Commun. 72, 72-95 (2016).</li><li>Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescence-detection+size-exclusion+chromatography-based+thermostability+assay+for+membrane+protein+precrystallization+screening.">A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening.</a> Structure. 20 (8), 1293-1299 (2012).</li><li>Tate, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+seven+different+heterologous+protein+expression+systems+for+the+production+of+the+serotonin+transporter.">Comparison of seven different heterologous protein expression systems for the production of the serotonin transporter.</a> Biochim Biophys Acta. 1610 (1), 141-153 (2003).</li><li>Rigaud, J. L., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+membrane+proteins+into+liposomes.">Reconstitution of membrane proteins into liposomes.</a> Methods Enzymol. 372, 65-86 (2003).</li><li>Caffrey, M., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallizing+membrane+proteins+using+lipidic+mesophases.">Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases.</a> Nat Protoc. 4 (5), 706-731 (2009).</li><li>Faham, S., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bicelle+crystallization:+a+new+method+for+crystallizing+membrane+proteins+yields+a+monomeric+bacteriorhodopsin+structure.">Bicelle crystallization: a new method for crystallizing membrane proteins yields a monomeric bacteriorhodopsin structure.</a> J Mol Biol. 316 (1), 1-6 (2002).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Bestemmelse af membranprotein struktur ved biofysiske teknikker stadig en skræmmende virksomhed for mange medicinsk signifikante transportører, receptorer og kanaler 11. Her deler vi detaljeret ekspertise udviklet til strukturen bestemmelse af humane serotonin transporteren bundet til S -citalopram. Vi forventer, at disse metoder vil være hensigtsmæssigt at bestemme strukturer af SERT i andre konformationelle stater samt strukturer af andre vanskelige membranproteiner. Endvidere kan de biokemiske teknikker beskrevet her også anvendes til at studere funktionen af ​​oprenset SERT i detergent og et nær-nativ lipid miljø. SERT krystallisering hængslet på udviklingen af ​​flere værktøjer og teknikker. Først forbedringer transportør termostabilitet produceret SERT varianter, der var velopdragen i forskellige vaskemiddel miceller efter udvinding af transportøren fra membraner 6. Desuden indebærer anvendelsenaf high-affinitetsligand S -citalopram hele oprensning og krystallisation yderligere forbedret stabilitet og reduceret konformationel heterogenitet. Tredje, udvikling af BacMam ekspressionssystemet 7 tilladt for produktion af store mængder af SERT i en kort periode på 2 uger, hvilket letter både immunisering og krystallisation. Endelig til udvikling af strategier selektere for høj affinitet antistoffer, som genkender 3D epitoper tilladt for opdagelsen af ​​8B6-antistof, som fremmer velordnet pakning af SERT-antistof-komplekser i krystaller. Der er en række kritiske trin og reagenser samt fælles problemer, der ofte opstår i hele protokollen. For det første kan dannelsen af ​​høj titer SERT P2 virus være problematisk. Tilføjelse lave koncentrationer af P1-virus for at generere P2 virus som beskrevet i denne protokol afbøder normalt dette problem, og i tilfælde, hvor P2 virustiteren er lav, kan P3-virus gøres using virus ved en MOI på 0,0001. Virus med en titer mindre end 1 x 10 8 viruspartikler / ml bør ikke anvendes og vil næsten altid resultere i lave proteinudbytter. For udtryk, HEK293S GNTI - celler blev valgt, fordi de mangler N -acetylglucosaminyltransferase I-aktivitet og kan derfor ikke syntetisere komplekse N -glycans stedet producerer kun høj mannose N -glycans. EndoH spalter N-forbundet glycosylering af høj mannose glycaner på to steder i ekstracellulær løkke 2 (EL2), hvilket efterlader et N -acetylglucosamine knyttet til asparagin. Fordøjelse af N-bundet sukker reducerer overflade entropi EL2 som sandsynligvis vigtig for krystallisation. Til generering af antistoffer, bør SERT IC anvendes til immunisering. GFP er meget immunogen 12 og bør ikke anvendes som en fusion tag at danne antistoffer, da det er vanskeligt fuldstændigt at fjerne ved SEC. Den fleksible N- og C-terminale ende af SERT var også ikkeinkluderet i konstruktionen for at undgå antistoffer mod disse regioner. Mus kan immuniseres med 30 ug rekonstitueret protein; fortsætte immuniserende mus, indtil der kan påvises høje serumkoncentrationer af antistoffer og producere hybridomceller som beskrevet 13. En thermostabilized konstruktion er normalt det bedste valg for immunisering; hvis transportøren er godt behaved og bevarer biologisk aktivitet efter oprensning, er dette ofte tilstrækkeligt til at frembringe antistoffer. Den 8B6-antistof blev fremstillet mod WT SERT. Til krystallisation, bør kun topfraktionerne fra SEC indeholdende monodispers kompleks som vurderet ved FSEC kombineres og koncentreres. SERT-8B6 krystaller vokse i et snævert interval af betingelser, og der er en række skridt, der bør træffes for at fejlfinding af problemer, der specifikt vedrører SERT krystal vækst. Tris-base justeret med HCI bør ikke anvendes i reservoiret løsning, da denne buffer ikke understøtter krystalvækst; det er derfor critisk til stedet bruge Tris justeret med NaOH. SERT krystaller vokser i et smalt koncentrationsområde af PEG 400, så hvis krystaller ikke vokser, eller hvis der observeres mange små krystaller, ville selv en lille stigning eller fald i PEG 400 koncentrationen tilrådes. Endvidere blev tilsætningsstoffet 6-aminohexansyre også anvendes i den optimerede skærmen for at forbedre nukleering. Faldet Forholdet protein: godt løsning er også en afgørende faktor for krystal vækst. Drop-forhold på 1,5 - 2: 1 anbefales, med drop-forhold tættere på 2: 1 typisk understøtte væksten af ​​større 3-dimensionelle krystaller. Endelig er anvendelsen af ​​lavprofil plader med 24 brønde er også afgørende mod krystalvækst, formodentlig på grund af ændringen af ​​hastigheden for dampdiffusion. En alternativ tilgang til SPA metode er udviklet til screening for mutanter, som stabiliserer rotte serotonin transporteren i en kokain-bundet konformation anvendelse af et filter bindingsassay 5. Derimod SPA based assay tillader sekventielle opvarmningstrin følgende ved bestemmelse af den del af SERT som forbliver bundet til ligand. Dette muliggør således for hurtig bestemmelse af smeltepunktet fra et lille antal prøver. SPA Metoden bygger på tilgængeligheden af ​​et radioaktivt mærket høj-affinitetsliganden og hvis der ikke ligander er kendte som binder med mikromolære affinitet derefter en alternativ tilgang vil være nødvendig. Mange andre fremgangsmåder er almindeligt anvendt til at måle proteinstabilitet såsom binding af fluorescerende farvestoffer og kalorimetri 14, men er lav-throughput og er enten ikke i stand til direkte at måle funktion eller kræver store mængder protein. Hvis der ikke kan bruges SPA metoden, en alternativ high-throughput tilgang er en FSEC-baserede Termostabilitet Assay 15 (FSEC-TS), hvor prøven opvarmes efterfulgt af adskillelse af den del af resterende transporter. FSEC-TS er en nyttig metode til at få adgang til kromatografisk adfærd og oligomere tilstand og er apowerful supplerende værktøj, som kan bruges sammen med SPA-metoden. En sammenligning af forskellige fælles protein ekspressionssystemer viste sig også at fremme anvendelsen af mammale celler til SERT ekspression 16 og ikke overraskende dette sandsynligvis tilfældet for mange proteiner af pattedyr-oprindelse. De metoder, som vi har anvendt til ekspression er blevet skræddersyet til SERT men sandsynligvis let kan tilpasses. Betingelser, der fremmer høje niveauer af ekspression bør nøje identificeres ved at variere den tid af ekspression, temperatur, viruskoncentration, og tilstedeværelsen af ​​histondeacetylaseinhibitorer såsom natriumbutyrat. Vi generelt begunstiger affinitetsoprensning i en mild langkædet detergent såsom C12M sammen med CHS før rekonstitution at bevare høj affinitet ligandbinding. Rekonstitution hjælp hydrofob absorption er en mild teknik, som vi har fundet at være effektive i flere andre transportører og receptorer. Hvis detteikke lykkes, fjernelse af vaskemidler med høje kritiske micelle koncentrationer ved dialyse, fortynding eller SEC kan anvendes 17 forudsat antigenet er tilstrækkeligt stabilt i sådanne vaske- og rengøringsmidler. I tilfælde, hvor der ikke er egnede antistoffer findes, vi næsten altid finde problemet skyldes tab af funktion eller denaturering af antigenet og i sådanne tilfælde vi med succes udført nye immuniseringer med særlig vægt på protein biokemi. Endelig bør ligander og antistoffer, der binder med høj affinitet danne grundlag for en rationel planlagt krystallisation eksperiment og ved at udnytte en termostabil variant, kan man screene et bredere område af betingelser ved at variere egenskaberne af forskellige detergenter. Endvidere bør krystallisation i en lipid mesofase 18 eller ved hjælp bicelles 19 altid betragtes som et alternativ til krystallisation i miceller. Disse principper og metoder kan anvendes med en vis modifikation for mange andre transmembrane proteiner, som er vanskelige at udtrykke og oprense fra andre ekspressionsværter, og vil være særlig nyttig for strukturen bestemmelse af mål for høj affinitet lægemidler.

Serotonin transporter (SERT) er et integreret membranprotein, der letter transporten af serotonin over cellulære membraner 1. SERT tilhører en familie af Neurotransmitter Natrium Symporters (NSS&#39;er), som også omfatter dopamin og noradrenalin transportører 2. SERT er det molekylære mål for bredt ordineret antidepressive og angstdæmpende medicin, der virker til kompetitivt hæmme serotonin transport 3. SERT udnytter energetisk gunstige cotransport af natrium for at fjerne neurotransmitter fra den synaptiske kløft. Omfattende karakterisering af det serotonerge system, har vist, at ændringer i serotonin stofskifte synes at påvirke næsten alle neurologiske processer, herunder humør, søvn, smerter, kognition, og aggression behaviors 4. SERT funktion kan ændres ved brug af antidepressiva og selektive serotonin reuptake hæmmere (SSRI) ligesom S -citalopram, samt ved psychostimulaNTS og narkotika for afhængighed såsom amfetamin og 3,4-methylenedioxy- N -methylamphetamine eller &quot;ecstasy&quot; 1,2. SSRI er uhyre vigtige for behandling af affektive lidelser, men den præcise strukturelle grundlag for deres indsats er ikke godt forstået. WT SERT er ustabil i vaskemiddel miceller, hvilket hindrer fremskridt i retning af en tredimensional (3D) struktur SERT 5,6. For nylig udviklede vi varianter af SERT som er robust stabilt i en lang række detergenter og fastholde SSRI bindingsaktivitet 6. Disse termostabile SERT varianter blev udvalgt under anvendelse af en scintillationsproximitetstest-baserede termostabilitet assay. Her beskriver vi en fremgangsmåde til generering af højaffinitetsantistoffer der kan binde SERT, og oprensning og krystallisering af termostabil SERT, i kompleks med antistof og S -citalopram. Denne protokol ud fra, at SERT og 8B6 gener er blevet lykkedesy klonet ind i BacMam 7 og insekt ekspressionsvektorer hhv. At danne antistoffer, blev cDNA, der koder resterne 73-616 af WT SERT klonet i BacMam vektor med en C-terminal Strep II tag (SERT IC). For termostabiliteten skærmen, blev SERT resterne 73-616 med C-terminale GFP, Strep II, og 10-Hans tags (SERT TC), der anvendes. Individuelle punktmutationer blev dannet i SERT TC baggrund. For krystallisering protokollen blev SERT-GFP fusionsprotein bruges med Twin-Strep [TrpSerHisProGlnPheGluLys (GlyGlyGlySer) 2 GlyGlySerAlaTrpSerHisProGlnPheGluLys] og 10-Hans tags, bærer de varmestabile mutanter, Y110A, I291A, og T439S og mutationer af overfladen cysteiner C554A, C580A og C622A (SERT CC). Thrombin spaltningssekvenser (LVPRGS) blev også indsat i SERT CC efter Q76 og T618 at tillade fjernelse af de N- og C-terminale ender. Plasmidet koder for 8B6 Fab blev manipuleret til at udtrykke både tunge og lettekæder af antistoffet med gp67 sekretionssignaler sekvenser under kontrol af to separate Polyhedrinsekvenserne promotorer. C-terminalen af ​​den tunge kæde af 8B6-antistoffet blev tagget med en 8-His-tag og et trombinspaltningssted blev indsat mellem den tunge kæde og tagget.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="760">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:372px;">DH10Bac</td>
			<td style="width:179px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:109px;">10361-012</td>
			<td style="width:101px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Kanamycin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP906-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gentamicin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP918-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tetracycline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-7660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bluo-gal</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15519-028</td>
			<td>5-Bromo-3-indolyl &#946;-D-galactopyranoside</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">IPTG</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>I1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Miniprep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cellfectin II</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10362-100</td>
			<td>Sf9 transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SF9</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sf-900 III SFM media</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12658-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEK-293S GnTI-</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Freestyle 293 media</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12338-018</td>
			<td>293 expression media</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>0984018DJ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium butyrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>303410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">S-citalopram</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4786</td>
			<td>Anagrade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">n-Dodecyl-?-D-Maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cholesteryl hemmisuccinate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850457P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850757P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840457P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Leupeptin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pepstatin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Aprotinin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PMSF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Desthiobiotin</td>
			<td>Iba Life Sciences</td>
			<td>2-1000-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Asolectin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cholesterol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lipid A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L5399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Brain polar lipid</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>141101C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Biobeads</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>152-3920</td>
			<td>Hydrophobic absorption resin</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Goat anti-mouse IRDye 680RD</td>
			<td>Odyssey</td>
			<td>926-68070</td>
			<td>Used as secondary for western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lauryl maltose neopentyl glycol</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>NG310</td>
			<td>Anagrade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Serotonin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pFastBac 8B6</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a name="RANGE!D35">Available from authors</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pEG Bacmam SERT Strep II</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>SERTIC, Available from authors</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pEG Bacmam SERT GFP twin Strep His</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>SERTTC, Available from authors</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pEG Bacmam SERT ts3 GFP twin Strep His</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>SERTCC, Available from authors</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imidazole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>56749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">n-Octyl &#946;-D-maltoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>O310</td>
			<td>Anagrade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Thrombin</td>
			<td>Haematologic Technologies</td>
			<td>HCT-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EndoH</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P0702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trizma-HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5941</td>
			<td>Tris used for preparation of crystallization reservoirs</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PEG 400</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>91893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">6-aminohexanoic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>MT25052CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isoplate-96 TC</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>6005070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PolyJet</td>
			<td>SignaGen</td>
			<td>SL100688</td>
			<td>Polymer transfection reagent for mamalian cells</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Copper HIS-Tag YSI SPA Beads</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>RPNQ0096</td>
			<td>His-tag affinity SPA beads</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Citalopram, [N-Methyl-3H]</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NET1039250UC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ThermoMixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000023</td>
			<td>heating block for thermostability assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ThermoTop</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5308000003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SmartBlock PCR 96, thermoblock for PCR plates</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5306000006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.2 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>25-243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1 L filter system</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2 L flat bottom tissue culture flask</td>
			<td>Genemate</td>
			<td>F-5909-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2 L baffled tissue culture flask</td>
			<td>Genemate</td>
			<td>F-5909-2000B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Forma Orbital Shaker</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Strep-Tactin resin</td>
			<td>Iba Life Sciences</td>
			<td>2-1208-025</td>
			<td>Strep affinity resin</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Extruder</td>
			<td>Northern Lipids</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Li-Cor imaging system</td>
			<td>Odyssey</td>
			<td></td>
			<td>western blot imaging system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">XK16 column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9889-37</td>
			<td>column used for Strep-Tactin and Talon purificaiton</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">100 kDa MWCO protein concentrator</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC910096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">30 kDa MWCO protein concentrator</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC903024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#196;kta FPLC</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>UPC-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HPLC</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>51476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Superose 6 (10/300) column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-5172-01</td>
			<td>Used for FSEC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tangential flow apparatus</td>
			<td>Pall Filtron</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.2 &#181;m filter tangential flow cell</td>
			<td>Pall Filtron</td>
			<td>PSM20C11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">30 kDa MWCO tangential flow concentrator</td>
			<td>Pall Filtron</td>
			<td>OS030T12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Talon resin</td>
			<td>Clonetech</td>
			<td>635504</td>
			<td>His-tag affinity resin used for Fab purification</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1 ml HiTrap SP column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17115101</td>
			<td>Cation exchanger used for Fab purification</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Superdex 200 10/300 GL column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-5175-01</td>
			<td>Used for SEC separation of SERT-8B6</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">24-well VDXm plate</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">18 mm coverslips</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-239</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Virocyt virus counter</td>
			<td>Virocyt</td>
			<td>2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MicroBeta Trilux</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>1450</td>
			<td>96-well scintillation counter</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HiTrap SP column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17115101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sertraline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6319</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

thermostabilization, expression, purification, and crystallization of the human serotonin transporter bound to s-citalopram

Serotonintransportøren er en natrium og chlorid-koblede transportør, at &quot;pumper&quot; ekstracellulær serotonin i celler. S -citalopram er et lægemiddel til behandling af depression og angst ved binding til serotonin transporteren med høj affinitet, blokering serotoningenoptagelse. Her rapporterer vi en effektiv procedure og et sæt værktøjer til at stabilisere, express, rense, og krystallisere serotonin transportør-antistof-komplekser bundet til S -citalopram og andre antidepressiva. Mutationer, som stabiliserer serotonintransporteren blev identificeret under anvendelse af en S -citalopram bindingsassay. Serotonintransporter udtrykt i Baculovirus-transducerede HEK293S GNTI - celler, blev rekonstitueret i proteoliposomer og anvendes til at hæve højaffinitetsantistoffer. Vi har udviklet en strategi til at opdage antistoffer, som er anvendelige til strukturelle studier. Der er også etableret en enkel tilgang til ekspression af antistoffragmenter i Sf9 celler.Transporter-antistof-komplekser renset ved hjælp af denne procedure er velopdragen og let krystallisere, der producerer komplekser med S -citalopram der diffrakterer røntgenstråler til 3-4 Å opløsning. Strategierne her udviklede kan anvendes til at bestemme strukturen af ​​andre udfordrende membranproteiner.

Et bibliotek af enkelt punkt mutanter i SERT TC baggrund blev oprettet for at skærm til thermostabilizing mutationer. Individuelle mutanter blev genereret ved anvendelse af standard mutagenese. Screeningen protokollen bruger forbigående transficeret HEK293S celler og en scintillationsproximitetstest-baserede termostabilitet skærm til hurtigt identitet nyttige mutationer til krystallisation som beskrevet i figur 1A. Plotting Tm-værdier versus bundet [3H] citalopram ved stuetemperatur afslører konstruktioner med høj termostabilitet og ekspressionsniveauer egnede for proteinoprensning (figur 1B). Tre mutanter (Y110A, I291A, og T439S) blev kombineret til frembringelse af en yderst stabil konstruktion (figur 1C). Termostabilitet er også korreleret med øget stabilitet i kortkædede detergenter nødvendige for krystallisering af SERT-Fab-komplekset. Den store skala ekspression af human SERT hjælp baculovirus-transduced HEK293S GNTI - celler kan tage mindre end 2 uger og kan producere milligram mængder, som illustreret i figur 2A. Anvendelse af GFP-mærkede SERT CC protein tillader SERT hensigtsmæssigt kan følges under ekspression og oprensning ved fluorescens (figur 2B). Vores oprensning strategi involveret 1) solubilisering af SERT bundet til S -citalopram fra HEK293S GNTI - celler i C12M i nærvær af CHS som en stabiliserende lipid; 2) binding af SERT til en Strep affinitetsmatrix; 3) fjernelse af forurenende proteiner ved omfattende vask; og 4) eluering af den funktionelle SERT med buffer indeholdende desthiobiotin (figur 2C). Det eluerede protein er stort set fri for andre påviselige proteiner ved Coomassie blue-farvning og monodisperse som vurderet ved FSEC (figur 2D, E). En lignende strategi blev taget at oprense SERT med en Strep II-tag, som blev anvendt til reconstitution og immunisering (figur 3A, B). Inkorporering af SERT i proteoliposomer øger serum halveringstid og stabilitet SERT og forbedrer sandsynligheden for isolation af højaffinitetsantistoffer. Endvidere optagelse af lipid A, en komponent af den bakterielle cellevæg, fungerer som en potent adjuvans 9. Multilamellare liposomer blev fremstillet ved tilsætning af puffer til en tørret lipidblanding i glasrør og resuspenderes i puffer. Ekstrudering af liposomerne gennem 200 nm porestørrelsesfiltre producerer monodisperse unilamellære liposomale suspensioner. Liposomerne derefter mættet med detergent efterfulgt af tilsætning af renset SERT i detergent. Endelig er detergent fjernet ved tilsætning af hydrofob absorption harpiks til lipidet: blanding vaskemiddel. Supplerende ligand bør sættes til den rekonstituerede prøve at selektere for antistoffer, der genkender den antidepressive bundne konformation. Tilstedeværelsen af ​​SERT i proteoliposomer bør bekræftes vedsolubilisering en lille prøve med SDS-PAGE lastning farvestof eller C12M og kører på SDS-PAGE og FSEC (figur 3C, D). Hybridomacellelinier udtrykker SERT antistoffer kan screenes for høj affinitet bindere som genkender 3D epitoper. Disse egenskaber er afgørende for et vellykket resultat af krystallisering, som antistoffet skal forblive fast bundet til en struktureret region til at fremme krystal pakning af homogene, velordnede domæner. I det første trin, er antistoffer, som genkender ustrukturerede regioner identificeret. SERT er denatureret og blottet på en nitrocellulosemembran; antistoffer, der binder denatureret SERT vil være western-positive og sandsynligvis genkender lineære epitoper. I figur 4A viser vi 2 eksempler på antistoffer, som er western-positive og sandsynligvis ikke hensigtsmæssigt at fremme crystallogenesis. I figur 4B, er de resterende western-negative antistoffer inkuberet med 100 nM SERT-GFP og separeret vedFSEC. Antistoffer, som binder SERT vil flytte GFP-positive spidsværdi til en tidligere position. De SERT-antistof-komplekser kan fortyndes yderligere i detergent at bestemme, om de kan binde med nanomolær affinitet efterfulgt af analyse ved FSEC. Tilsætning af serotonin resulterer i konformationelle ændringer i transportøren og således de antistoffer kan screenes igen for at bestemme om de specifikt kan genkende SSRI-bundne konformation. I figur 4C antistofferne vist sig at binde SERT i nærvær af serotonin, hvilket viser, at epitopen (er) ikke ændrer fra SSRI til substrat bundne tilstand. Endelig i figur 4D kombinationer af antistoffer testes for deres evne til at binde forskellige epitoper, hvilket resulterer i yderligere venstregående forskydning. Her 15B8 eller 8A11 antistoffer genkender en epitop, som er forskellig fra 8B6. Den 8B6 antistof blev valgt til yderligere strukturel analyse baseret på foreløbige krystal screening med papain skaTed Fab. Generne af 8B6 Fab blev klonet ind i en insektcelle ekspressionsvektor. Fab kan udtrykkes og secerneres fra Sf9 celler, der vokser i suspension. Den 8B6 Fab kan oprenses fra Sf9 cellesupernatanten ved His-mærke affinitet (figur 5A, B) og kationbytterkromatografi (figur 5C, D) resulterer i protein, som forekommer forurenende stoffer på SDS-PAGE geler. I figur 5E er den rekombinante 8B6 Fab vist at binde SERT og anvendes i efterfølgende biokemiske og biofysiske eksperimenter. Det affinitetsoprensede SERT CC fordøjes med thrombin og EndoH og blandes med 8B6 Fab at danne et kompleks i nærvær af S -citalopram. Transportøren-antistof-kompleks derefter adskilt ved SEC i C8M (figur 6A) og toppen fraktioner indeholder både SERT og Fab som vist ved SDS-PAGE (figur 6B). Anvendelse af C8M er afgørende for krystaldannelse sandsynligvis fordiden kortkædede vaskemiddel giver bedre pakning mellem molekyler i krystalgitteret. FSEC er ansat til at bestemme, hvilke fraktioner skulle samles til krystallisering (figur 6C); fraktioner, som ikke er monodisperse og / eller indeholder store mængder frit SERT eller Fab bør ikke kombineres. Prism formet SERT-antistof krystaller kan dyrkes i tilstedeværelsen af S -citalopram ved hjælp af denne protokol ved at hænge dråbedampdiffusion (figur 7A). De resulterende krystaller diffrakterer røntgenstråler til en opløsning på 3,15 Å 10 (figur 7B). <img alt="figur 1" src="/files/ftp_upload/54792/54792fig1.jpg" /> Figur 1: Scintillation Proximity-baserede Termostabilitet Assay A.. Oversigt over protokol til screening termostabilitet i tilstedeværelsen af [3 H] citalopram. B. Maksimal bundet [3 </sup&gt; H] citalopram versus tilsyneladende smeltetemperatur (Tm). Stiplede linjer repræsenterer værdier for WT transporteren. De 3 mest termostabile mutanter er mærket. Grå område repræsenterer mutanter, der har mindre end 10% af [3H] citalopram bindende i forhold til WT og dermed unøjagtige Tm-værdier på grund af et lavt signal-til-støj. C. Termostabilitetsforsøg kurver for WT SERT TC og top 3 mutanter. Fejl søjler repræsenterer standardafvigelse (SD). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig1large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54792/54792fig2.jpg" /> Figur 2: Oversigt over Mammalian heterologt protein Expression A.. Skematiseret oversigt over BacMam virus generering og udtryk for SERT i HEK293S GNTI -. Celler B. HANK293S GNTI - celler, der udtrykker SERT CC (GFP-fluorescens) C.. Elueringsprofil af SERT CC på Strep affinitetsharpiks. Grøn spor repræsenterer koncentrationen af desthiobiotin 0 - 100% (med 0 - 5 mM) D.. Analyse af affinitetsoprenset SERT CC på en 4 - 15% SDS-PAGE-gel E.. FSEC affinitet renset SERT CC opdaget af GFP-fluorescens (excitation: 480 nm; Emission: 510 nm). Toppen eluering ved 15 ml er SERT (#) og 18 ml er gratis GFP (*). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54792/54792fig3.jpg" /> Figur 3: Repræsentativ Affinitetsrensning og Rekonstituering af SERT IC A.. Skematisk oversigt over antistof generation. &lt;strong&gt; B. Elueringsprofil observeret ved 280 nm af affinitetsoprensning af SERT IC om Strep affinitetsharpiks. Grøn spor repræsenterer koncentrationen af desthiobiotin 0 - 100%. (0 - 5, mM) C. Analyse af affinitetsoprenset og rekonstitueret SERT på en 4 - 15% SDS-PAGE-gel D.. FSEC af opløst SERT efter rekonstituering. Den fluorescens af tryptophan rester blev brugt til at detektere SERT (Excitation: 280 nm; Emission: 335 nm). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig3large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/54792/54792fig4.jpg" /> Figur 4:. Analyse af Repræsentative SERT antistoffer A. Screening af antistoffer ved western-blot. Ca. 1 ug SERT CC med eller uden GFP blev påført en 4 - 15% SDS-PAGE-gel og blottet på en nitrocellulosemembran. Binding blev detekteret ved anvendelse af et gede-anti-muse-antistof konjugeret til IR-farve. 2G4 og 10F2 er vestlige positive. B. Binding af antistoffer mod 100 nM GFP-mærkede SERT og påvisning ved FSEC detekteret ved anvendelse GFP-fluorescens. C. Binding af udvalgte Fabs til 100 nM GFP-mærkede SERT i nærvær af 1 mM serotonin. D. Binding af 8A11 eller 15B8 Fabs til SERT-8B6 Fab. Mindre toppe eluerer ved 18 ml er gratis GFP. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig4large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/54792/54792fig5.jpg" /> Figur 5: Repræsentativ Oprensning af 8B6 Fab fra Sf9 Cells A.. Elueringsprofil observeret ved 280 nm af oprensning af 8B6 Fab ved His-mærke affinitet chromatograp<html> hy. Grøn spor repræsenterer koncentrationen af imidazol 0 - 50% (0 - 250 mM) B.. Ikke-reducerende og reducerende SDS-PAGE gel efter His-mærke affinitetsoprensning. Protein, der kører nær 50 kDa er ikke-reducerede Fab (#) og mindre arter på 25 kDa er reduceret Fab (*). C. Elueringsprofil observeret ved 280 nm af oprensning af 8B6 Fab ved kationbytning vise en enkelt symmetrisk som eluerer under en lineær natriumchlorid gradient. Grøn spor repræsenterer koncentrationen af NaCl 0 - 100%. (0 - 500 mM) D. Analyse af 8B6 Fab på en 12,5% SDS-PAGE-gel efter oprensning ved kationbytning. E. Binding af 8B6 Fab til 10 nM GFP-mærkede SERT, påvises ved anvendelse af fluorescens af GFP. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig5large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> e 6 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 54.792 / 54792fig6.jpg &quot;/&gt; Figur 6: Repræsentativ Gelfiltrering Kromatografi af SERT-8B6 Complex i nærvær af S -citalopram A.. Gelfiltrering elueringsprofilen for oprenset SERT-8B6 kompleks. Main elueredes efter 11,5 ml er SERT-8B6-kompleks. Peak ved 15 - 17 ml indeholder GFP og Fab B.. Analyse af det oprensede SERT-8B6 kompleks på en 4 - 15% SDS-PAGE-gel. Positionerne af SERT og de tunge og lette kæder af Fab er vist med en tankestreg. C. FSEC af størrelse-separeret fraktioner. SERT-8B6 komplekser blev detekteret ved anvendelse af tryptofan fluorescens. Fraktion 17 indeholder en større mængde SERT som ikke kompleks med Fab. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig6large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> <img alt="Figur 7"src = &quot;/ files / ftp_upload / 54.792 / 54792fig7.jpg&quot; /&gt; Figur 7: Krystallisation af SERT-8B6-komplekset bundet til S -citalopram A.. Lysmikroskopi af parallelepipedumformede formede krystaller af SERT-8B6 kompleks efter 2 ugers vækst. Scale bar lig 200 B um.. SERT-8B6 krystaller afbøje røntgenstråler til 3,15 Å. Blå ring repræsenterer 3,15 Å. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig7large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> Tabel 1:. En Krystallisation skærm til SERT-8B6 Complex Bound til S -citalopram <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792table1.xlsx">Klik her for at downloade denne tabel.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram at JoVE.com

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Dette håndskrift beskriver, hvordan man screene for thermostabilizing mutationer, oprense det humane serotonin transporteren, generere antistoffer med høj affinitet, og krystallisere serotonintransporteren-antistof komplekset bundet til det antidepressive lægemiddel S -citalopram. Denne protokol kan tilpasses til studiet af andre udfordrende membrantransportører, receptorer og kanaler.

Termostabilisering, Expression, Rensning, og Krystallisation af Human Serotonin Transporter Bundet til<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

Ekspression, oprensning og antimikrobiell aktivitet af S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

Rekombinant Protein Ekspression, Krystallisering og Biofysiske Studier af a<em&gt; Bacillus</em&gt; -konserveret nucleotidpyrophosphorylase, BcMazG

To overcome safety restrictions and regulations when studying genes and proteins from true pathogens, their homologues can be studied. Bacillus anthracis ...

A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/&#945;

A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±

En Guide til produktion, krystallisering og struktur bestemmelse af menneskelige IKK1/α

A class of extracellular stimuli requires activation of IKK1/&#945; to induce generation of an NF-&#954;B subunit, p52, through processing of its ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

Proteinekspression og -oprensning af pattedyr Bestrophin Ion kanaler

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Proteinekspression og -oprensning af menneskelige Lipid-følsomme kation kanal TRPC3 for Strukturbestemmelse af enkelt-partikel kryo-elektronmikroskopi

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

Udtryk, oploesning og rensning af eukaryote Borat transportører

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...

Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

Udtryk og rensning af nuklease-fri oxygen Scavenger Protocatechuate 3, 4-Dioxygenase

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Ekspression, rensning, krystallisering og enzym assays af Fumarylacetoacetat hydrolase-domæne-holdige proteiner

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

PCR Mutagenesis, Cloning, Expression, Fast Protein Purification Protocols and Crystallization of the Wild Type and Mutant Forms of Tryptophan Synthase

PCR Mutagenesis, Kloning, Expression, Fast Protein Rensning Protokoller og krystallisering af wild type og mutant former for Tryptophan Synthase

Structural studies with tryptophan synthase (TS) bienzyme complex (&#945;2&#946;2 TS) from Salmonella typhimurium have been performed to better understand ...

Bacterial Expression and Purification of Human Matrix Metalloproteinase-3 using Affinity Chromatography

Bakteriel ekspression og oprensning af human matrixmetalloproteinase-3 ved anvendelse af affinitetskromatografi

Matrix metalloproteinases (MMPs) belong to the family of metzincin proteases with central roles in extracellular matrix (ECM) degradation and remodeling, ...