Name: thermostabilization, expression, purification, and crystallization of the human serotonin transporter bound to s-citalopram
Uploaded: 2016-11-27T15:00:00
Duration: 12 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram at JoVE.com

We thank D. Cawley for generating monoclonal antibodies. We thank A. Penmatsa and K. Wang for sharing ideas and expertise developed from the dopamine transporter. L. Vaskalis for assistance with figures, H. Owen for help with manuscript preparation and other Gouaux laboratory members for helpful discussions. J.A.C. has support from a Banting postdoctoral fellowship from the Canadian Institutes of Health Research. E.M.G. is supported by the National Science Foundation Graduate Research Fellowship. We are particularly grateful to Bernie and Jennifer LaCroute for their generous support, as well as for funding from the NIH (5R37MH070039). E.G. is an investigator of the Howard Hughes Medical Institute.

<ol>
	<li>Kristensen, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLC6+neurotransmitter+transporters:+structure,+function,+and+regulation.">SLC6 neurotransmitter transporters: structure, function, and regulation.</a> Pharmacol Rev. 63 (3), 585-640 (2011).</li><li>Broer, S., Gether, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+solute+carrier+6+family+of+transporters.">The solute carrier 6 family of transporters.</a> Br J Pharmacol. 167 (2), 256-278 (2012).</li><li>Andersen, J., Kristensen, A. S., Bang-Andersen, B., Stromgaard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+understanding+of+the+interaction+of+antidepressant+drugs+with+serotonin+and+norepinephrine+transporters.">Recent advances in the understanding of the interaction of antidepressant drugs with serotonin and norepinephrine transporters.</a> Chem Commun (Camb). 25 (25), 3677-3692 (2009).</li><li>Hahn, M. K., Blakely, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+impact+of+SLC6+transporter+genetic+variation.">The functional impact of SLC6 transporter genetic variation.</a> Annu Rev Pharmacol Toxicol. 47, 401-441 (2007).</li><li>Abdul-Hussein, S., Andrell, J., Tate, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermostabilisation+of+the+serotonin+transporter+in+a+cocaine-bound+conformation.">Thermostabilisation of the serotonin transporter in a cocaine-bound conformation.</a> J Mol Biol. 425 (12), 2198-2207 (2013).</li><li>Green, E. M., Coleman, J. A., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermostabilization+of+the+human+serotonin+transporter+in+an+antidepressant-Bound+Conformation.">Thermostabilization of the human serotonin transporter in an antidepressant-Bound Conformation.</a> Plos One. 10 (12), e0145688 (2015).</li><li>Goehring, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+and+large-scale+expression+of+membrane+proteins+in+mammalian+cells+for+structural+studies.">Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies.</a> Nat Protoc. 9 (11), 2574-2585 (2014).</li><li>Kawate, T., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-detection+size-exclusion+chromatography+for+precrystallization+screening+of+integral+membrane+proteins.">Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins.</a> Structure. 14 (4), 673-681 (2006).</li><li>De Becker, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adjuvant+monophosphoryl+lipid+A+increases+the+function+of+antigen-presenting+cells.">The adjuvant monophosphoryl lipid A increases the function of antigen-presenting cells.</a> Int Immunol. 12 (6), 807-815 (2000).</li><li>Coleman, J. A., Green, E. M., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+structures+and+mechanism+of+the+human+serotonin+transporter.">X-ray structures and mechanism of the human serotonin transporter.</a> Nature. , (2016).</li><li>White, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+progress+of+membrane+protein+structure+determination.">The progress of membrane protein structure determination.</a> Protein Sci. 13 (7), 1948-1949 (2004).</li><li>Gambotto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenicity+of+enhanced+green+fluorescent+protein+(EGFP)+in+BALB/c+mice:+identification+of+an+H2-Kd-restricted+CTL+epitope.">Immunogenicity of enhanced green fluorescent protein (EGFP) in BALB/c mice: identification of an H2-Kd-restricted CTL epitope.</a> Gene Ther. 7 (23), 2036-2040 (2000).</li><li>Galfre, G., Howe, S. C., Milstein, C., Butcher, G. W., Howard, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+major+histocompatibility+antigens+produced+by+hybrid+cell+lines.">Antibodies to major histocompatibility antigens produced by hybrid cell lines.</a> Nature. 266 (5602), 550-552 (1977).</li><li>Deller, M. C., Kong, L., Rupp, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+stability:+a+crystallographer's+perspective.">Protein stability: a crystallographer's perspective.</a> Acta Crystallogr F Struct Biol Commun. 72, 72-95 (2016).</li><li>Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescence-detection+size-exclusion+chromatography-based+thermostability+assay+for+membrane+protein+precrystallization+screening.">A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening.</a> Structure. 20 (8), 1293-1299 (2012).</li><li>Tate, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+seven+different+heterologous+protein+expression+systems+for+the+production+of+the+serotonin+transporter.">Comparison of seven different heterologous protein expression systems for the production of the serotonin transporter.</a> Biochim Biophys Acta. 1610 (1), 141-153 (2003).</li><li>Rigaud, J. L., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+membrane+proteins+into+liposomes.">Reconstitution of membrane proteins into liposomes.</a> Methods Enzymol. 372, 65-86 (2003).</li><li>Caffrey, M., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallizing+membrane+proteins+using+lipidic+mesophases.">Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases.</a> Nat Protoc. 4 (5), 706-731 (2009).</li><li>Faham, S., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bicelle+crystallization:+a+new+method+for+crystallizing+membrane+proteins+yields+a+monomeric+bacteriorhodopsin+structure.">Bicelle crystallization: a new method for crystallizing membrane proteins yields a monomeric bacteriorhodopsin structure.</a> J Mol Biol. 316 (1), 1-6 (2002).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Bepaling van membraaneiwit structuur door biofysische technieken blijft een enorme onderneming voor veel medisch significante transporters, receptoren en kanalen 11. Hier delen we gedetailleerde kennis ontwikkeld voor de structuur bepaling van de menselijke serotonine transporter gebonden aan S-citalopram. We verwachten dat deze methoden nuttig zijn om structuren van SERT bepalen in andere conformationele staten, alsook structuren van andere moeilijke membraaneiwitten zal zijn. Bovendien is de biochemische technieken die hier beschreven kunnen ook worden gebruikt om de functie van gezuiverd SERT schoonmaakmiddel en een bijna-natieve lipide omgeving bestuderen. SERT kristallisatie scharnierend op de ontwikkeling van diverse tools en technieken. Ten eerste, verbeteringen in de transporter thermostabiliteit geproduceerd SERT varianten die werden goed gedragen in verschillende detergent micellen na extractie van de vervoerder van membranen 6. Ten tweede, het gebruikvan de hoge affiniteit ligand S-citalopram gedurende zuivering en kristallisatie verder verbeterde stabiliteit en verminderde conformationele heterogeniteit. Ten derde, de ontwikkeling van het expressiesysteem BacMam 7 toegelaten voor de productie van grote hoeveelheden SERT in een korte periode van 2 weken, vergemakkelijkt zowel immunisatie en kristallisatie. Tenslotte, de ontwikkeling van strategieën om te selecteren op antilichamen met hoge affiniteit die 3D epitopen toegelaten voor de ontdekking van het 8B6 antilichaam dat geordende pakking van SERT-antilichaamcomplexen in kristallen bevordert herkennen. Er zijn een aantal kritische stappen en reagentia alsmede gemeenschappelijke problemen die vaak optreden gedurende het protocol. Ten eerste kan de vorming van hoge titer virus SERT P2 problematisch zijn. Toevoegen van lage concentraties van P1 tot P2 virus virus te genereren zoals beschreven in dit protocol vermindert meestal dit probleem, en wanneer de P2 virustiter laag is, kan P3 virus usin wordeng virus bij een MOI van 0,0001. Virussen met een titer van minder dan 1 x 10 8 virusdeeltjes / ml mag niet worden gebruikt en zullen vrijwel altijd tot lage eiwitopbrengsten. Voor expressie, HEK293S GNTI - cellen werden gekozen omdat ze geen N -acetylglucosaminyltransferase I-activiteit en daardoor niet synthetiseren complexe N-glycanen, maar uitsluitend hoog- mannose N-glycanen. EndoH splitst N-gebonden glycosylering van hoge mannose glycanen op twee locaties in de extracellulaire lus 2 (EL2), waardoor een N-acetylglucosamine gekoppeld aan asparagine. Vertering van N-gebonden suikers vermindert oppervlak entropie van EL2 die waarschijnlijk belangrijk is voor kristallisatie. Voor het genereren van antilichamen, zou de SERT IC worden gebruikt voor immunisatie. GFP zeer immunogeen 12 en mag niet worden gebruikt als een fusie-tag antilichamen omdat het moeilijk volledig te verwijderen door SEC. De flexibele N- en C-terminus van SERT waren evenminin het construct om antilichamen tegen deze gebieden te voorkomen. Muizen kunnen worden geïmmuniseerd met 30 ug opgeloste eiwit; verder immuniseren van muizen tot hoge serumconcentraties van antilichamen kan worden gedetecteerd en produceren hybridoomcellen zoals beschreven 13. Een thermostabilized construct is meestal de beste keuze voor immunisatie; indien de vervoerder is goed gedragen en behoudt biologische activiteit na zuivering, is dit vaak voldoende om antilichamen op te wekken. De 8B6 antilichaam werd opgewekt tegen WT SERT. Kristallisatieoplosmiddel moet alleen het piekfracties van SEC met monodisperse complex zoals beoordeeld door FSEC worden gecombineerd en geconcentreerd. SERT-8B6 kristallen groeien in een beperkt aantal omstandigheden en er zijn een aantal stappen die moeten worden genomen om specifieke problemen in verband met SERT kristalgroei lossen. Tris-base ingesteld met HCl mag niet worden gebruikt in de reservoiroplossing, aangezien deze buffer ondersteunt geen kristalgroei; het is dus crische gebruiken in plaats Tris ingesteld met NaOH. SERT kristallen groeien in een smal concentratiegebied van PEG 400, dus als kristallen niet groeien of als er veel kleine kristallen worden waargenomen, zou zelfs een kleine toename of afname van de concentratie PEG 400 worden geadviseerd. Verder werd het additief 6-aminohexaanzuur ook gebruikt in de geoptimaliseerde scherm om kiemvorming te verbeteren. De daling verhouding eiwit: goed oplossing ook een belangrijke bepalende factor voor kristalgroei. Daling verhouding van 1,5-2: 1 de voorkeur, met drop ratio dichter bij 2: 1 typisch ondersteunen van de groei van grote 3-dimensionale kristallen. Tenslotte, het gebruik van lage profile 24-well platen is ook cruciaal richting kristalgroei, waarschijnlijk als gevolg van wijziging van de snelheid van dampdiffusie. Een alternatieve benadering voor de SPA methode ontwikkeld voor het screenen voor mutanten die de rat serotonine transporter stabiliseren in een cocaïne gebonden conformatie met een filter bindingsbepaling 5. Daarentegen is de SPA based-test zorgt voor sequentiële verwarming stappen gevolgd door het bepalen van de fractie van SERT, die gebonden is aan ligand blijft. Aldus maakt dit de snelle bepaling van de smelttemperatuur van een klein aantal monsters. De SPA werkwijze berust op de beschikbaarheid van een radioactief gemerkte hoge affiniteit ligand en als er geen liganden bekend die binden submicromolaire affiniteit dan een alternatieve benadering nodig. Vele andere werkwijzen worden gewoonlijk toegepast om eiwitstabiliteit meten zoals binding van fluorescente kleurstoffen en calorimetrie 14 maar zijn laag-throughput en hetzij niet rechtstreeks functie te meten of vereisen grote hoeveelheden eiwit. Indien de SPA methode niet kan worden gebruikt, een alternatieve high-throughput benadering is een FSEC gebaseerde thermostabiliteit test 15 (FSEC-TS), waarbij het monster wordt verwarmd en vervolgens afscheiding van de fractie van overblijvende transporter. FSEC-TS is een nuttige aanpak voor de toegang tot chromatografisch gedrag en oligomere staat en is apowerful aanvullend instrument die naast de SPA-werkwijze kan worden gebruikt. Een vergelijking van verschillende gemeenschappelijke eiwitexpressiesystemen bleek ook het gebruik van zoogdiercellen voor expressie SERT 16 bevorderen en verrassend is dit waarschijnlijk het geval is voor veel eiwitten van zoogdieren. De methoden die we hebben gebruikt voor expressie zijn op maat gemaakt voor SERT, maar zijn waarschijnlijk gemakkelijk aan te passen. Omstandigheden die hoge expressieniveaus bevorderen moeten zorgvuldig worden geïdentificeerd door het variëren van het tijdstip van expressie, temperatuur, virusconcentratie en aanwezigheid van histon deacetylase inhibitoren zoals natriumbutyraat. Wij zijn voorstander van het algemeen affiniteit zuivering in een milde lange-keten detergent zoals C12M samen met CHS vóór reconstitutie met hoge affiniteit ligand binding te behouden. Reconstructie met behulp van hydrofobe absorptie is een milde techniek die we hebben gevonden effectief voor een aantal andere vervoerders en receptoren te zijn. Als ditis niet succesvol, verwijdering of detergentia aan hoge kritische micelconcentratie door dialyse, verdunning of SEC worden toegepast 17 verschaft het antigeen voldoende stabiel in dergelijke wasmiddelen. In gevallen waarin geen geschikte antistoffen worden gevonden, vinden we bijna altijd het probleem is te wijten aan het verlies van functie of denaturatie van het antigeen en in dergelijke gevallen hebben we met succes nieuwe vaccinaties met speciale aandacht voor eiwit biochemie uitgevoerd. Tenslotte liganden en antilichamen die binden met hoge affiniteit zou de basis voor een rationeel geplande kristallisatie experiment vormen en door gebruik te maken van een thermostabiel variant kan men een grotere verscheidenheid van omstandigheden screenen door het variëren van de eigenschappen van verschillende detergentia. Verder kristallisatie in een lipide mesofase 18 of via bicelles 19 moet altijd worden beschouwd als een alternatief voor kristallisatie in micellen. Deze principes en werkwijzen kunnen worden gebruikt met bepaalde wijzicatie voor vele andere transmembraan eiwitten die moeilijk uit te drukken en te zuiveren van andere expressiegastheren en zullen bijzonder nuttig zijn voor de structuurbepaling van doelwitten met hoge affiniteit drugs zijn.

De serotonine transporter (SERT) een integraal membraaneiwit dat het transport van serotonine in celmembranen 1 vergemakkelijkt. SERT behoort tot een familie van Neurotransmitter Natrium symporter (NSS), die ook de dopamine en noradrenaline transporters 2. SERT is het moleculaire doelwit van veel voorgeschreven antidepressiva en anxiolytica die werken competitief remmen serotonine transport 3. SERT exploiteert de energetisch gunstige cotransport natrium om neurotransmitter uit de synaptische spleet verwijderen. Uitgebreide karakterisering van het serotonerge systeem blijkt dat veranderingen in serotonine metabolisme beïnvloeden blijken vrijwel alle neurologische processen zoals stemmingswisselingen, slaapstoornissen, pijn, cognitie en agressie gedragingen 4. SERT functie kan worden aangepast door het gebruik van antidepressiva en selectieve serotonineheropnameremmers (SSRI&#39;s) zoals S-citalopram, alsmede door psychostimulagen en drugs van verslaving zoals amfetamine en 3,4-methylenedioxy- N -methylamphetamine of &quot;ecstasy&quot; 1,2. SSRIs zijn enorm belangrijk voor de behandeling van stemmingsstoornissen, maar de exacte structurele basis voor hun werking wordt niet goed begrepen. WT SERT instabiel in detergens micellen, waardoor de voortgang belemmeren naar een driedimensionale (3D) structuur van SERT 5,6. Onlangs ontwikkelden we varianten SERT die robuust stabiel in een breed scala van detergentia en behouden SSRI bindingsactiviteit 6. Deze thermostabiele SERT varianten werden geselecteerd onder toepassing van een scintillatie proximity-gebaseerde assay thermostabiliteit. Hier beschrijven we een werkwijze voor het opwekken van antilichamen met hoge affiniteit die SERT kunnen binden, en de zuivering en kristallisatie van thermostabiele SERT, in complex met antilichamen en S-citalopram. Dit protocol wordt ervan uitgegaan dat de SERT en 8B6 genen succesvol zijn geweesty gekloneerd in de BacMam 7 en insecten expressievectoren respectievelijk. Om antilichamen cDNA dat codeert residuen 73-616 van WT SERT werd gekloneerd in de vector BacMam met een C-terminaal StrepII-aanhangsel (SERT IC). Voor de thermostabiliteit scherm, werd SERT resten 73-616 met C-terminale GFP, Strep II, en 10-His-tags (SERT TC) gebruikt. Afzonderlijke puntmutaties werden gegenereerd in de SERT TC achtergrond. Voor de kristallisatie-protocol, was de SERT-GFP-fusie-eiwit gebruikt met Twin-Strep [TrpSerHisProGlnPheGluLys (GlyGlyGlySer) 2 GlyGlySerAlaTrpSerHisProGlnPheGluLys] en 10-His-tags, het dragen van de thermostabiele mutanten, Y110A, I291A, en T439S en mutaties van het oppervlak cysteines C554A, C580A en C622A (SERT CC). Trombinesplitsing sequenties (LVPRGS) werden ook opgenomen in de SERT CC na Q76 en T618 om verwijdering van de N- en C-termini mogelijk. Het plasmide codeert voor het 8B6 Fab is ontworpen om zowel de zware als lichte expressketens van het antilichaam met GP67 secretie sequenties onder de controle van twee afzonderlijke polyhedrine promoters. Het C-uiteinde van de zware keten van het 8B6 antilichaam werd gelabeld met een 8-His tag en een thrombine splitsingsplaats werd ingebracht tussen de zware keten en de tag.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="760">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:372px;">DH10Bac</td>
			<td style="width:179px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:109px;">10361-012</td>
			<td style="width:101px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Kanamycin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP906-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gentamicin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP918-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tetracycline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-7660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bluo-gal</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15519-028</td>
			<td>5-Bromo-3-indolyl &#946;-D-galactopyranoside</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">IPTG</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>I1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Miniprep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cellfectin II</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10362-100</td>
			<td>Sf9 transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SF9</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sf-900 III SFM media</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12658-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEK-293S GnTI-</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Freestyle 293 media</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12338-018</td>
			<td>293 expression media</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>0984018DJ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium butyrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>303410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">S-citalopram</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4786</td>
			<td>Anagrade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">n-Dodecyl-?-D-Maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cholesteryl hemmisuccinate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850457P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850757P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840457P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Leupeptin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pepstatin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Aprotinin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PMSF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Desthiobiotin</td>
			<td>Iba Life Sciences</td>
			<td>2-1000-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Asolectin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cholesterol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lipid A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L5399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Brain polar lipid</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>141101C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Biobeads</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>152-3920</td>
			<td>Hydrophobic absorption resin</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Goat anti-mouse IRDye 680RD</td>
			<td>Odyssey</td>
			<td>926-68070</td>
			<td>Used as secondary for western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lauryl maltose neopentyl glycol</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>NG310</td>
			<td>Anagrade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Serotonin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pFastBac 8B6</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a name="RANGE!D35">Available from authors</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pEG Bacmam SERT Strep II</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>SERTIC, Available from authors</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pEG Bacmam SERT GFP twin Strep His</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>SERTTC, Available from authors</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pEG Bacmam SERT ts3 GFP twin Strep His</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>SERTCC, Available from authors</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imidazole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>56749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">n-Octyl &#946;-D-maltoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>O310</td>
			<td>Anagrade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Thrombin</td>
			<td>Haematologic Technologies</td>
			<td>HCT-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EndoH</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P0702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trizma-HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5941</td>
			<td>Tris used for preparation of crystallization reservoirs</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PEG 400</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>91893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">6-aminohexanoic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>MT25052CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isoplate-96 TC</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>6005070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PolyJet</td>
			<td>SignaGen</td>
			<td>SL100688</td>
			<td>Polymer transfection reagent for mamalian cells</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Copper HIS-Tag YSI SPA Beads</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>RPNQ0096</td>
			<td>His-tag affinity SPA beads</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Citalopram, [N-Methyl-3H]</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NET1039250UC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ThermoMixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000023</td>
			<td>heating block for thermostability assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ThermoTop</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5308000003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SmartBlock PCR 96, thermoblock for PCR plates</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5306000006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.2 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>25-243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1 L filter system</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2 L flat bottom tissue culture flask</td>
			<td>Genemate</td>
			<td>F-5909-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2 L baffled tissue culture flask</td>
			<td>Genemate</td>
			<td>F-5909-2000B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Forma Orbital Shaker</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Strep-Tactin resin</td>
			<td>Iba Life Sciences</td>
			<td>2-1208-025</td>
			<td>Strep affinity resin</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Extruder</td>
			<td>Northern Lipids</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Li-Cor imaging system</td>
			<td>Odyssey</td>
			<td></td>
			<td>western blot imaging system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">XK16 column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9889-37</td>
			<td>column used for Strep-Tactin and Talon purificaiton</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">100 kDa MWCO protein concentrator</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC910096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">30 kDa MWCO protein concentrator</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC903024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#196;kta FPLC</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>UPC-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HPLC</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>51476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Superose 6 (10/300) column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-5172-01</td>
			<td>Used for FSEC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tangential flow apparatus</td>
			<td>Pall Filtron</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.2 &#181;m filter tangential flow cell</td>
			<td>Pall Filtron</td>
			<td>PSM20C11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">30 kDa MWCO tangential flow concentrator</td>
			<td>Pall Filtron</td>
			<td>OS030T12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Talon resin</td>
			<td>Clonetech</td>
			<td>635504</td>
			<td>His-tag affinity resin used for Fab purification</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1 ml HiTrap SP column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17115101</td>
			<td>Cation exchanger used for Fab purification</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Superdex 200 10/300 GL column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-5175-01</td>
			<td>Used for SEC separation of SERT-8B6</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">24-well VDXm plate</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">18 mm coverslips</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-239</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Virocyt virus counter</td>
			<td>Virocyt</td>
			<td>2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MicroBeta Trilux</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>1450</td>
			<td>96-well scintillation counter</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HiTrap SP column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17115101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sertraline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6319</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

thermostabilization, expression, purification, and crystallization of the human serotonin transporter bound to s-citalopram

De serotonine transporter is een natrium en chloride gekoppeld transporter dat &quot;pompen&quot; extracellulair serotonine in cellen. S-citalopram is een geneesmiddel dat gebruikt wordt voor de behandeling van depressie en angst door binding aan de serotonine transporter met een hoge affiniteit, het blokkeren van serotonine heropname. Hier melden wij een efficiënte procedure en een set van tools te stabiliseren, express, zuiveren en kristalliseren serotonine transporter antilichaam-complexen gebonden aan S-citalopram en andere antidepressiva. Mutaties die de serotonine transporter stabiliseren werden geïdentificeerd met een S-citalopram bindingsassay. Serotonine transporter tot expressie gebracht in baculovirus-getransduceerde HEK293S GNTI - cellen werd gereconstitueerd in proteoliposomen en gebruikt om hoge-affiniteit-antilichamen opwekken. Wij hebben een strategie ontwikkeld om antilichamen die bruikbaar zijn voor structurele studies ontdekt. Een eenvoudige benadering voor de expressie van antilichaamfragmenten in Sf9-cellen werd ook vastgesteld.Transporter-antilichaam complexen gezuiverd door het gebruik van deze procedure zijn goed gedragen en gemakkelijk te kristalliseren, het produceren van complexen met S-citalopram dat X-stralen breken tot 3-4 resolutie Å. De ontwikkelde strategieën kunnen worden gebruikt om de structuur van andere uitdagende membraaneiwitten bepalen.

Een bibliotheek van enkel punt mutanten in het SERT TC achtergrond is gemaakt om het scherm voor thermostabilizing mutaties. Individuele mutanten werden gegenereerd onder gebruikmaking van standaard mutagenese. De screening protocol maakt gebruik van tijdelijk getransfecteerde HEK293S cellen en een scintillatie nabijheid gebaseerde thermostabiliteit scherm snel identiteit nuttig mutaties voor kristallisatie zoals in Figuur 1A. Plotten Tm-waarden tegen gebonden [3H] citalopram bij kamertemperatuur onthult constructen met hoge thermostabiliteit en expressieniveaus geschikt voor eiwitzuivering (Figuur 1B). Drie mutanten (Y110A, I291A en T439S) werden gecombineerd om een zeer stabiele constructie (figuur 1C) te genereren. De thermostabiliteit is ook gecorreleerd met verhoogde stabiliteit in kortketenige detergentia noodzakelijk is voor de kristallisatie van de SERT-Fab complex. De grootschalige expressie van humaan SERT gebruik van baculovirus-transduced HEK293S GNTI - cellen minder dan 2 weken en kan milligram hoeveelheden produceren, zoals geïllustreerd in figuur 2A. Gebruik van het GFP-gelabeld eiwitten SERT CC laat SERT gemakkelijk te volgen tijdens expressie en zuivering door fluorescentie (figuur 2B). Onze zuiveringsstrategie betrokken 1) oplossen van SERT gebonden aan S-citalopram uit HEK293S GNTI - cellen C12M in aanwezigheid van CHS als stabiliserende lipide; 2) de binding van SERT een Strep affiniteitsmatrix; 3) verwijdering van verontreinigende eiwitten door uitgebreid wassen; en 4) elutie van de functionele SERT met buffer bevattende desthiobiotine (figuur 2C). Het geëlueerde eiwit grotendeels vrij van andere eiwitten gedetecteerd door Coomassie blauwkleuring en monodisperse zoals beoordeeld door FSEC (figuur 2D, E). Een soortgelijke strategie werd naar SERT zuiveren met StrepII die is gebruikt voor reconstitution en immunisatie (Figuur 3A, B). Incorporatie van SERT in proteoliposomen verhoogt het serum halfwaardetijd en stabiliteit van SERT en verbetert de kans isolatie van hoge affiniteit-antilichamen. Bovendien opname van lipide A, een component van de bacteriële celwand dient als een krachtig adjuvans 9. Multilamellaire liposomen werden bereid door de toevoeging van buffer tot een gedroogde lipidemengsel in glazen buizen en geresuspendeerd in buffer. Extrusie van de liposomen door middel van 200 nm poriegrootte filters produceert monodisperse unilamellaire liposomale suspensies. De liposomen worden vervolgens verzadigd met detergens, gevolgd door de toevoeging van gezuiverd SERT in detergens. Tenslotte wordt detergens verwijderd door toevoeging van hydrofobe absorptie hars om de lipide: detergensmengsel. Aanvullende ligand worden toegevoegd aan het opgeloste monster antilichamen te selecteren die het antidepressivum conformatie herkennen. De aanwezigheid van SERT in de proteoliposomen moet worden bevestigd doorsolubiliserende een klein monster met SDS-PAGE loading dye of C12M en actief is op SDS-PAGE en FSEC (Figuur 3C, D). Hybridoma cellijnen SERT antilichamen kunnen worden gescreend op hoge-affiniteit binders die 3D-epitopen herkennen. Deze eigenschappen zijn belangrijk voor het uiteindelijke succes van kristallisatie, als het antilichaam verankerd moet blijven gebonden aan een gestructureerd regio pakkingspatronen homogene, goed geordende domeinen bevorderen. In de eerste stap worden antilichamen die ongestructureerde regio herkennen geïdentificeerd. SERT is gedenatureerd en geblot op een nitrocellulose membraan; antilichamen die gedenatureerde SERT binden zal western-positief zijn en waarschijnlijk herkennen lineaire epitopen. In figuur 4A tonen wij 2 voorbeelden van antilichamen die western-positieve en waarschijnlijk niet nuttig crystallogenesis bevorderen zijn. In figuur 4B, worden de resterende western-negatieve antilichamen geïncubeerd met 100 nM SERT-GFP en gescheiden doorFSEC. Antilichamen die binden SERT de GFP-positieve piek verschuiven naar een eerdere positie. De SERT-antilichaam complexen kunnen verder worden verdund reinigingsmiddel te bepalen of zij met nanomolaire affiniteit gevolgd door analyse door FSEC kan binden. Toevoeging van serotonine leidt tot conformatieveranderingen in de transporter en dus de antilichamen worden gescreend om te bepalen of ze specifiek de SSRI-gebonden conformatie kan herkennen. In figuur 4C worden de antilichamen aangetoond SERT binden in de aanwezigheid van serotonine, waaruit blijkt dat de epitoop (en) niet veranderen van de SSRI gebonden toestandsubstraat. Tenslotte in figuur 4D combinaties van antilichamen getest op hun vermogen om verschillende epitopen binden, wat resulteert in een verdere verschuiving naar links. Hier de 15B8 of antilichamen 8A11 herkennen een epitoop die verschilt van 8B6. De 8B6 antilichaam werd gekozen voor verdere structurele analyse op basis van voorlopige kristal screening met papaïne Treated Fab. De genen van de 8B6 Fab gekloneerd in een insectencel expressievector. Fab kan worden uitgedrukt en afgescheiden door Sf9-cellen in suspensie te groeien. De 8B6 Fab kan worden gezuiverd uit Sf9 celsupernatant door His-tag affiniteit (Figuur 5A, B) en kationenuitwisselingschromatografie (figuur 5C, D) resulteert in eiwit dat vrij is van verontreinigingen op SDS-PAGE gelen weergegeven. In figuur 5E is de recombinante 8B6 Fab aangetoond SERT binden en in aansluitende biochemische en biofysische experimenten. De affiniteit gezuiverde SERT CC wordt gedigereerd met thrombine en EndoH en gemengd met 8B6 Fab van een complex in de aanwezigheid van S-citalopram te vormen. De transporter-antilichaamcomplex wordt vervolgens gescheiden door SEC C8M (figuur 6A) en de piekfracties bevatten zowel SERT en Fab zoals getoond door SDS-PAGE (Figuur 6B). Het gebruik van C8M is cruciaal voor kristalvorming waarschijnlijk omdatde korte keten wasmiddel mogelijk maakt betere verpakking tussen moleculen in het kristalrooster. FSEC wordt gebruikt om te bepalen welke fracties worden samengevoegd voor kristallisatie (figuur 6C); fracties die niet monodispers zijn en / of grote hoeveelheden vrije SERT of Fab mag niet worden gecombineerd. Prismavormige kristallen SERT-antilichaam kan worden gekweekt in aanwezigheid van S-citalopram met dit protocol door opknoping druppel dampdiffusie (Figuur 7A). De resulterende kristallen buigen röntgenstralen een resolutie van 3,15 A 10 (figuur 7B). <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/54792/54792fig1.jpg" /> Figuur 1: Scintillation Proximity-gebaseerde Thermostabiliteit Assay A.. Overzicht protocol voor het screenen thermostabiliteit in aanwezigheid van [3H] citalopram. B. Maximale gebonden [3 </sup&gt; H] citalopram versus schijnbare smelttemperatuur (Tm). De gestippelde lijnen geven waarden voor de WT transporter. De 3 meest thermostabiele mutanten zijn gelabeld. Grijze gebied representeert mutanten die minder dan 10% van [3H] citalopram binding ten opzichte van WT en dus onnauwkeurig Tm waarden als gevolg van een lage signaal-ruis. C. Thermostabiliteit curves voor WT SERT TC en de top 3 mutanten. Fout balken geven de standaarddeviatie (SD). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/54792/54792fig2.jpg" /> Figuur 2: Overzicht van Mammalian heterologe eiwitexpressie A.. Schematisch overzicht van BacMam virus generatie en expressie van SERT in HEK293S GNTI -. Cellen B. HIJK293S GNTI - cellen die het SERT CC (GFP fluorescentie) C.. Elutieprofiel van SERT CC op Strep affiniteit hars. Groene spoor geeft de concentratie van desthiobiotine, 0-100% (0-5 mM) D.. Analyse van affiniteit gezuiverd SERT CC op een 4-15% SDS-PAGE gel E.. FSEC van affiniteit gezuiverd SERT CC gedetecteerd door GFP-fluorescentie (excitatie: 480 nm; Emissie: 510 nm). De piek eluerend bij 15 ml is SERT (#) en 18 ml is gratis GFP (*). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 3" src="/files/ftp_upload/54792/54792fig3.jpg" /> Figuur 3: Representatieve Affiniteit Zuivering en Reconstructie van het SERT IC A.. Schematisch overzicht van generatie antilichaam. &lt;strong&gt; B. Elutieprofiel waargenomen bij 280 nm van de affiniteitszuivering van SERT IC op Strep affiniteitshars. Groene spoor geeft de concentratie van desthiobiotine, 0 - 100%. (0-5 mM) C. Analyse van affiniteit gezuiverd en opnieuw SERT op een 4-15% SDS-PAGE gel D.. FSEC van opgeloste SERT na reconstitutie. De fluorescentie van tryptofaan residuen werd gebruikt om SERT (excitatie: 280 nm; Emissie: 335 nm) te detecteren. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 4" src="/files/ftp_upload/54792/54792fig4.jpg" /> Figuur 4:. Analyse van representatieve SERT antilichamen A. Screening van antilichamen door western blot. Ongeveer 1 ug SERT CC met of zonder GFP werd op een 4-15% SDS-PAGE gel en geblot op een nitrocellulose membraan. Binding werd gedetecteerd met een geit anti-muis-antilichaam geconjugeerd met IR Dye. 2G4 en 10F2 zijn westerse positief. B. Binding van antilichamen tegen 100 nM GFP-gelabeld SERT en detectie door FSEC gedetecteerd met GFP-fluorescentie. C. Binding van geselecteerde Fabs tot 100 nM GFP-gelabeld SERT in aanwezigheid van 1 mM serotonine. D. Binding van 8A11 of 15B8 Fabs aan SERT-8B6 Fab. Kleine pieken eluerend bij 18 ml zijn gratis GFP. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 5" src="/files/ftp_upload/54792/54792fig5.jpg" /> Figuur 5: Representatieve Zuivering van de 8B6 Fab van Sf9 cellen A.. Elutieprofiel waargenomen bij 280 nm van de zuivering van de 8B6 Fab door His-tag affiniteit chromatograp<html> hy. Groen trace vertegenwoordigt de concentratie van imidazool, 0-50% (0-250 mM) B.. Niet-reducerende en reducerende SDS-PAGE gel na His-tag affiniteitszuivering. Eiwit dat wordt uitgevoerd in de buurt van 50 kDa is niet-gereduceerde Fab (#) en kleinere soorten bij 25 kDa wordt gereduceerd Fab (*). C. Elutieprofiel waargenomen bij 280 nm van de zuivering van de 8B6 Fab door kationenuitwisseling tonen een symmetrische piek die elueerde onder een lineaire natriumchloridegradiënt. Groene spoor geeft de concentratie van NaCl, 0 - 100%. (0-500 mM) D. Analyse van de 8B6 Fab op een 12,5% SDS-PAGE-gel na zuivering door kationenuitwisseling. E. Binding van de 8B6 Fab tot 10 nM-GFP-tag SERT, gedetecteerd met behulp van fluorescentie van GFP. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> e 6 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 54792 / 54792fig6.jpg &quot;/&gt; Figuur 6: Representatieve gelfiltratiechromatografie van de SERT-8B6 complex in aanwezigheid van S-citalopram A.. Gelfiltratie elutieprofiel gezuiverd SERT-complex 8B6. Hoofdpiek elueerde bij 11,5 ml is het SERT-8B6 complex. Piek bij 15-17 ml bevat GFP en Fab B.. Analyse van het gezuiverde SERT-8B6 complex op een 4-15% SDS-PAGE gel. De posities van SERT en de zware en lichte ketens van het Fab wordt getoond door een streepje. C. FSEC van het formaat gescheiden fracties. SERT-8B6 complexen werden gedetecteerd met behulp tryptofaan fluorescentie. Fractie 17 bevat een grotere hoeveelheid SERT die niet complex deed met Fab. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="figuur 7"src = &quot;/ files / ftp_upload / 54792 / 54792fig7.jpg&quot; /&gt; Figuur 7: kristallisatie van het SERT-8B6 Complex Bound to S-citalopram A.. Lichtmicroscopie van parallellepipedum gevormde kristallen van de SERT-complex 8B6 na 2 weken groei. Schaal bar is gelijk aan 200 pm. B. SERT-8B6 kristallen buigen X-stralen tot 3,15 Å. Blauwe ring vertegenwoordigt 3,15 Å. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig7large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> Tabel 1:. Kristallisatie scherm voor de SERT-8B6 Complex Bound to S-citalopram <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792table1.xlsx">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram at JoVE.com

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Dit manuscript beschrijft hoe om te screenen op thermostabilizing mutaties, zuiveren de menselijke serotonine transporter, het genereren van antilichamen met hoge affiniteit, en kristalliseren de serotonine transporter antilichaam-complex gebonden aan het antidepressivum citalopram S. Dit protocol kan worden aangepast aan de studie van andere uitdagende membraantransporteiwitten, receptoren en kanalen.

Thermostabilization, expressie, zuivering en kristallisatie van het Human serotonine transporter Gebonden aan<em&gt; S</em&gt; citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

Expressie, zuivering en antimicrobiële activiteit van S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

Recombinant Proteïne Expressie, Kristallisatie en Biofysische Studies van a<em&gt; Bacillus</em&gt; -conserveerd nucleotide pyrophosphorylase, BcMazG

To overcome safety restrictions and regulations when studying genes and proteins from true pathogens, their homologues can be studied. Bacillus anthracis ...

A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/&#945;

A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±

Een gids voor productie, kristallisatie en structuurbepaling van menselijke IKK1/α

A class of extracellular stimuli requires activation of IKK1/&#945; to induce generation of an NF-&#954;B subunit, p52, through processing of its ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

Meningsuiting en zuivering van zoogdier Bestrophin ionenkanalen

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Meningsuiting en zuivering van de TRPC3 mens lipide-gevoelige catie kanaal voor structurele bepaling door Single-deeltje Cryo-elektronenmicroscopie

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

Meningsuiting, solubilisatie en zuivering van eukaryotische boraat Transporters

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...

Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

Expressie en zuivering van Nuclease-vrije zuurstof Scavenger Protocatechuate 3, 4-dioxygenase

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Expressie, zuivering, kristallisatie, en enzym assays van Fumarylacetoacetate hydrolase domein-bevattende eiwitten

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

PCR Mutagenesis, Cloning, Expression, Fast Protein Purification Protocols and Crystallization of the Wild Type and Mutant Forms of Tryptophan Synthase

PCR Mutagenese, Klonen, Expressie, Snelle Eiwitzuiveringsprotocollen en Kristallisatie van het Wilde Type en Mutante Vormen van Tryptofaan Synthase

Structural studies with tryptophan synthase (TS) bienzyme complex (&#945;2&#946;2 TS) from Salmonella typhimurium have been performed to better understand ...

Bacterial Expression and Purification of Human Matrix Metalloproteinase-3 using Affinity Chromatography

Bacteriële expressie en zuivering van humane matrix metalloproteinase-3 met behulp van affiniteitschromatografie

Matrix metalloproteinases (MMPs) belong to the family of metzincin proteases with central roles in extracellular matrix (ECM) degradation and remodeling, ...