Name: thermostabilization, expression, purification, and crystallization of the human serotonin transporter bound to s-citalopram
Uploaded: 2016-11-27T15:00:00
Duration: 12 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram at JoVE.com

We thank D. Cawley for generating monoclonal antibodies. We thank A. Penmatsa and K. Wang for sharing ideas and expertise developed from the dopamine transporter. L. Vaskalis for assistance with figures, H. Owen for help with manuscript preparation and other Gouaux laboratory members for helpful discussions. J.A.C. has support from a Banting postdoctoral fellowship from the Canadian Institutes of Health Research. E.M.G. is supported by the National Science Foundation Graduate Research Fellowship. We are particularly grateful to Bernie and Jennifer LaCroute for their generous support, as well as for funding from the NIH (5R37MH070039). E.G. is an investigator of the Howard Hughes Medical Institute.

<ol>
	<li>Kristensen, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLC6+neurotransmitter+transporters:+structure,+function,+and+regulation.">SLC6 neurotransmitter transporters: structure, function, and regulation.</a> Pharmacol Rev. 63 (3), 585-640 (2011).</li><li>Broer, S., Gether, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+solute+carrier+6+family+of+transporters.">The solute carrier 6 family of transporters.</a> Br J Pharmacol. 167 (2), 256-278 (2012).</li><li>Andersen, J., Kristensen, A. S., Bang-Andersen, B., Stromgaard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+understanding+of+the+interaction+of+antidepressant+drugs+with+serotonin+and+norepinephrine+transporters.">Recent advances in the understanding of the interaction of antidepressant drugs with serotonin and norepinephrine transporters.</a> Chem Commun (Camb). 25 (25), 3677-3692 (2009).</li><li>Hahn, M. K., Blakely, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+impact+of+SLC6+transporter+genetic+variation.">The functional impact of SLC6 transporter genetic variation.</a> Annu Rev Pharmacol Toxicol. 47, 401-441 (2007).</li><li>Abdul-Hussein, S., Andrell, J., Tate, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermostabilisation+of+the+serotonin+transporter+in+a+cocaine-bound+conformation.">Thermostabilisation of the serotonin transporter in a cocaine-bound conformation.</a> J Mol Biol. 425 (12), 2198-2207 (2013).</li><li>Green, E. M., Coleman, J. A., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermostabilization+of+the+human+serotonin+transporter+in+an+antidepressant-Bound+Conformation.">Thermostabilization of the human serotonin transporter in an antidepressant-Bound Conformation.</a> Plos One. 10 (12), e0145688 (2015).</li><li>Goehring, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+and+large-scale+expression+of+membrane+proteins+in+mammalian+cells+for+structural+studies.">Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies.</a> Nat Protoc. 9 (11), 2574-2585 (2014).</li><li>Kawate, T., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-detection+size-exclusion+chromatography+for+precrystallization+screening+of+integral+membrane+proteins.">Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins.</a> Structure. 14 (4), 673-681 (2006).</li><li>De Becker, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adjuvant+monophosphoryl+lipid+A+increases+the+function+of+antigen-presenting+cells.">The adjuvant monophosphoryl lipid A increases the function of antigen-presenting cells.</a> Int Immunol. 12 (6), 807-815 (2000).</li><li>Coleman, J. A., Green, E. M., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+structures+and+mechanism+of+the+human+serotonin+transporter.">X-ray structures and mechanism of the human serotonin transporter.</a> Nature. , (2016).</li><li>White, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+progress+of+membrane+protein+structure+determination.">The progress of membrane protein structure determination.</a> Protein Sci. 13 (7), 1948-1949 (2004).</li><li>Gambotto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenicity+of+enhanced+green+fluorescent+protein+(EGFP)+in+BALB/c+mice:+identification+of+an+H2-Kd-restricted+CTL+epitope.">Immunogenicity of enhanced green fluorescent protein (EGFP) in BALB/c mice: identification of an H2-Kd-restricted CTL epitope.</a> Gene Ther. 7 (23), 2036-2040 (2000).</li><li>Galfre, G., Howe, S. C., Milstein, C., Butcher, G. W., Howard, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+major+histocompatibility+antigens+produced+by+hybrid+cell+lines.">Antibodies to major histocompatibility antigens produced by hybrid cell lines.</a> Nature. 266 (5602), 550-552 (1977).</li><li>Deller, M. C., Kong, L., Rupp, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+stability:+a+crystallographer's+perspective.">Protein stability: a crystallographer's perspective.</a> Acta Crystallogr F Struct Biol Commun. 72, 72-95 (2016).</li><li>Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescence-detection+size-exclusion+chromatography-based+thermostability+assay+for+membrane+protein+precrystallization+screening.">A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening.</a> Structure. 20 (8), 1293-1299 (2012).</li><li>Tate, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+seven+different+heterologous+protein+expression+systems+for+the+production+of+the+serotonin+transporter.">Comparison of seven different heterologous protein expression systems for the production of the serotonin transporter.</a> Biochim Biophys Acta. 1610 (1), 141-153 (2003).</li><li>Rigaud, J. L., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+membrane+proteins+into+liposomes.">Reconstitution of membrane proteins into liposomes.</a> Methods Enzymol. 372, 65-86 (2003).</li><li>Caffrey, M., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallizing+membrane+proteins+using+lipidic+mesophases.">Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases.</a> Nat Protoc. 4 (5), 706-731 (2009).</li><li>Faham, S., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bicelle+crystallization:+a+new+method+for+crystallizing+membrane+proteins+yields+a+monomeric+bacteriorhodopsin+structure.">Bicelle crystallization: a new method for crystallizing membrane proteins yields a monomeric bacteriorhodopsin structure.</a> J Mol Biol. 316 (1), 1-6 (2002).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

קביעת מבנה חלבון הממברנה על ידי טכניקות biophysical נשארת התחייבות מרתיעה עבור מובילים משמעותיים מבחינה רפואית רבים, קולטנים, וערוצי 11. כאן אנו לחלוק את המומחיות מפורטת שפתחה עבור קביעת המבנה של טרנספורטר הסרוטונין אדם כבול S -citalopram. אנו צופים כי שיטות אלו תהיינה שימושיות כדי לקבוע מבנים של בהלבשה במדינות קונפורמציה אחרות, כמו גם מבנים של חלבונים בממברנה קשים אחרים. יתר על כן, הטכניקות ביוכימיות המתוארות כאן יכולות לשמש גם כדי ללמוד לתפקד של בהלבשה מטוהרת דטרגנט וסביבת שומנים כמעט טבעית. התגבשות בהלבשת צירים על ההתפתחות מספר כלים וטכניקות. ראשית, שיפורים thermostability טרנספורטר הפיק גרסאות בהלבשה שהיו מחונך ב מיצלות חומר ניקוי שונים הבאים החילוץ של טרנספורטר מן הקרומים 6. השימוש שנית,של -citalopram S ליגנד הגבוה זיקה ברחבי טיהור התגבשות יציבות משופרת נוספת וההטרוגניות קונפורמציה המופחתת. שלישית, התפתחות מערכת ביטוי BacMam 7 מותר לייצור כמויות גדולות של בהלבשה בתוך פרק זמן קצר של 2 שבועות, בהנחיית שני חיסונים התגבשות. לבסוף, פיתוח אסטרטגיות כדי לבחור עבור נוגדנים גבוהה זיקת מכירי אפיטופים 3D מותר על הגילוי של הנוגדן 8B6 מקדם וסדורה אריזה של מתחמים בהלבשה-נוגדן לגבישים. ישנם מספר הצעדים ריאגנטים קריטיים כמו גם בעיות נפוצות אשר לעתים קרובות להתרחש לאורך כל הפרוטוקול. ראשית, הדור של וירוס בהלבשה P2 כייל גבוה יכול להיות בעייתי. הוספת ריכוזים נמוכים של וירוס P1 כדי ליצור וירוס P2 כמתואר בפרוטוקול זה בדרך כלל מפחית את הבעיה הזו, ובמקרים בהם כייל P2 וירוס הוא נמוך, וירוס P3 יכול להתבצע usinוירוס גרם ב משרד הפנים של 0.0001. וירוסים עם כייל פחות מ -1 x 10 8 חלקיקי נגיף / מ&quot;ל לא אמור לשמש ויהיה כמעט תמיד לגרום תשואות חלבון נמוכה. עבור ביטוי, HEK293S GnTI - תאים נבחרו משום שהם חסרי N -acetylglucosaminyltransferase שאני פעילות ועל כן אינו יכול לסנתז -glycans N המורכב, במקום לייצר -glycans מנוז N הגבוה בלבד. EndoH מסלקת N -linked glycosylation של גליקנים מנוז גבוהים בשני אתרי לולאה תאית 2 (EL2), עוזב N -acetylglucosamine המצורפת asparagine. עיכול של N -linked סוכרים מפחית האנטרופיה פני EL2 וזה חשוב סביר להתגבשות. עבור הדור של נוגדנים, IC בהלבשה אמור לשמש עבור חיסון. GFP מאוד immunogenic 12 ולא אמור לשמש כתווית היתוך לייצר נוגדנים משום שקשה להסיר לחלוטין על ידי ה- SEC. N- הגמיש C- הסופי של בהלבשה היה גם לאנכלל לבנות כדי למנוע נוגדנים נגד אזורים אלה. עכברים יכולים להתחסן עם 30 מיקרוגרם של חלבון מחדש; להמשיך עכברים מחסנים עד ניתן לאתר ומייצר hybridoma תאים כמתוארים 13 ריכוזי נוגדנים בסרום גבוה. בונת thermostabilized היא בדרך כלל הבחירה הטובה ביותר עבור חיסון; אם טרנספורטר הוא ומחונך ושומרת פעילות ביולוגית הבאים טיהור, זה הוא לעתים קרובות מספיק כדי להעלות נוגדנים. הנוגדן 8B6 הועלה נגד WT בהלבשה. עבור התגבשות, רק שברי השיא מ SEC המכילים קומפלקס monodisperse כמו להישפט על ידי FSEC צריכים להיות משולבים ומרוכז. גבישים בהלבשה-8B6 לגדול בטווח צר של תנאים ויש מספר צעדים שיש לנקוט כדי לפתור בעיות הקשורות ספציפי צמיחת קריסטל בהלבשה. טריס בסיס מותאם עם HCl לא אמור לשמש בפתרון המאגר, מאז חיץ זה אינו תומך צמיחה קריסטל; זה ובכך CRIזהה לזו במקום להשתמש טריס מותאם עם NaOH. גבישים בהלבשה לגדול במגוון ריכוז צר של PEG 400, כך שאם גבישים לא גדלים או אם גבישים קטנים רבים הם נצפו, אפילו עלייה קלה או ירידה בריכוזיות PEG 400 תהיה מומלצת. יתר על כן, חומצה 6-aminohexanoic כתוסף שימשה גם המסך מותאם לשפר התגרענות. יחס הירידה של חלבון: פתרון טוב הוא גם מפתח בקביעת גורם לצמיחת קריסטל. זרוק יחסי של 1.5 - 2: 1 מומלץ, עם יחס טיפה קרוב יותר ל -2: 1 בדרך כלל ומעודד את המשך צמיחת גבישים 3 ממדים גדולים. לבסוף, השימוש 24 גם צלחות פרופיל נמוך הוא גם משמעותי שיוכל להוביל לצמיחה קריסטל, ככל הנראה בשל שינוי של קצב דיפוזיה אדי. גישה חלופית לשיטת SPA פותחה למסך עבור מוטנטים אשר לייצב את טרנספורטר הסרוטונין עכברוש קונפורמציה קוקאין הנכנס באמצעות מסנן מחייב assay 5. לעומת זאת, ba SPAassay SED מאפשר צעדי חימום רציפים הבאים על ידי קביעת החלק היחסית של בהלבשה אשר נשאר קשור ליגנד. לכן, זה מאפשר הקביעה המהירה של טמפרטורת ההתכה ממספר קטן של דגימות. שיטת SPA מסתמכת על הזמינות של ליגנד גבוהה זיקת radiolabeled ואם לא הליגנדים ידועים אשר לאגד עם זיקת submicromolar אז גישה חלופית תהיה צורך. רבי שיטות אחרות משמשות למדידת יציבות חלבון כגון עקידת צבעי ניאון ו calorimetry 14 אבל הם תפוקה נמוכה והם מסוגלים גם כדי למדוד את התפקוד ישירות או דורשים כמויות גדולות של חלבון. אם שיטת SPA לא ניתן להשתמש, אחד גישת תפוקה גבוהה וחלופה היא Assay FSEC המבוססת Thermostability 15 (FSEC-TS), שבו המדגם מחומם ואחריו הפריד את החלק היחסי של יתרת טרנספורטר. FSEC-TS היא גישה שימושית לצורך גישת התנהגות chromatographic ומדינת oligomeric והוא apכלי משלים owerful אשר יכול לשמש לצד שיטת SPA. השוואת מערכות ביטוי חלבון שונות הנפוצים נמצאה גם להעדיף את השימוש בתאי יונקים לביטוי בהלבשה 16 ובאופן לא מפתיע זה עשוי המקרה עבור חלבונים רבים ממוצא יונק. השיטות אשר השתמשנו לביטוי נתפרו במיוחד בהלבשה אך סביר בקלות להתאמה. תנאים אשר מעדיפים רמות גבוהות של ביטוי יש לזהות בקפידה על ידי שינוי זמן ביטוי, טמפרטורה, ריכוז וירוס, ונוכחות של מעכבי deacetylase היסטון כגון בוטיראט נתרן. בדרך כלל אנחנו מעדיפים טיהור זיקת חומר ניקוי ארוכת שרשרת קלה כגון C12M יחד עם CHS לפני הכינון לשמור ליגנד גבוהה זיקה מחייבת. כינון באמצעות קליטת הידרופובי הוא טכניקה קלה שמצאנו כיעיל במשך כמה מובילי קולטנים אחרים. אם זההוא לא מוצלח, הסרת דטרגנטים עם ריכוזי micelle ביקורתיים גבוהים על ידי דיאליזה, דילול, או SEC יכולה להיות מועסקת 17 ספקו את אנטיגן היא יציבה מספיק בדטרגנטים כאלה. במקרים בהם לא נוגדנים מתאימים נמצאים, אנחנו כמעט תמיד מצא את הבעיה נובעת אובדן תפקוד או denaturation של אנטיגן ובמקרים כאלה בהצלחה ביצענו חיסונים חדשים תשומת לב מיוחדת ביוכימיה חלבון. לבסוף, הליגנדים ונוגדנים אשר לאגד עם זיקה גבוהה צריכים להוות את הבסיס עבור ניסוי התגבשות מתוכננת בצורה רציונלית על ידי ניצול של גרסת thermostable, אפשר להקרין מגוון רחב של תנאים על ידי שינוי המאפיינים של דטרגנטים שונים. יתר על כן, התגבשות בתוך mesophase lipidic 18 או באמצעות bicelles 19 תמיד צריך להיחשב כאלטרנטיבה התגבשות מיצלות. מנהלי שיטות אלה יכולים לשמש עם כמה modifiקטיון עבור חלבון טראנסממברנלי רב אחר אשר קשה לבטא ולטהר ממארחי ביטוי אחרים, ויהיה שימושי במיוחד עבור קביעת המבנה של מטרות של תרופות גבוהה זיקה.

טרנספורטר הסרוטונין (בהלבשה) הוא חלבון ממברנלי אינטגרלי המאפשר התחבורה של סרוטונין על פני קרום התא 1. בהלבשה שייך למשפחה של נוירוטרנסמיטר נתרן Symporters (NSSs) אשר כוללת גם את דופאמין ונוראפינפרין מובילי 2. בהלבשה היא היעד המולקולרי של תרופות נוגדות דיכאון שנקבעו נרחב נגד חרדה אשר פועלות לעכב תחבורת סרוטונין תחרותית 3. בהלבשה מנצלת את cotransport הנוח האנרגטי של נתרן כדי להסיר הנוירוטרנסמיטר מן השסע הסינפטי. אפיון נרחב של מערכת serotonergic הוכיח כי שינויים במטבוליזם של סרוטונין מראית עין של השפעה כמעט כל תהליכי הנוירולוגיות כוללים מצב רוח, שינה, כאבים, קוגניציה, ותוקפנות התנהגויות 4. פונקציה בהלבשה ניתן לשנות באמצעות השימוש בתרופות נוגדות דיכאון ו סלקטיבי סרוטונין reuptake מעכבי (SSRI) כמו S -citalopram, כמו גם על ידי psychostimulants וסמים של התמכרות כגון אמפטמין ו 3,4-methylenedioxy- N -methylamphetamine או &quot;אקסטזה&quot; 1,2. SSRIs הן בעלות חשיבות עצומה לטיפול הפרעות במצב רוח, עדיין את הבסיס המבני המדויק לפעולה שלהם אינו מובן היטב. בהלבשת WT היא יציבה מיצלות חומרי ניקוי, ובכך מעכב את התקדמות לקראת מבנה תלת-ממדי (3D) של בהלבשה 5,6. לאחרונה, פיתחנו גרסאות של בהלבשה אשר יציבים וחסונה במגוון רחב של חומרי ניקוי ולשמר SSRI מחייב פעילות 6. גרסות בהלבשת thermostable אלה נבחרו באמצעות assay thermostability קרב מבוסס נצנץ. כאן אנו מתארים הליך לייצור נוגדנים גבוהה זיקה אשר יכול לקשור סרט, ואת טיהור התגבשות של בהלבשה thermostable, בקומפלקס עם נוגדן ו- S -citalopram. פרוטוקול זה מבוסס על ההנחה כי בהלבשה ו 8B6 גנים כבר מוצלחy משובט לתוך וקטורי ביטוי BacMam 7 חרקים, בהתאמה. כדי ליצור נוגדנים, שאריות קידוד cDNA 73-616 של WT בהלבשה שובט לתוך וקטור BacMam עם תג בטרמינל C-סטרפטוקוקוס השנייה (בהלבשה IC). לקבלת המסך thermostability, שאריות בהלבשה 73-616 עם GFP C- מסוף, סטרפטוקוקוס השנייה, ו -10 שלו תגים (TC בהלבשה) היה בשימוש. מוטציות נקודה בודדת נוצרו ברקע TC בהלבשה. בשביל הפרוטוקול התגבשות, החלבון היתוך-GFP בהלבשה שימש עם Twin-סטרפטוקוקוס [TrpSerHisProGlnPheGluLys (GlyGlyGlySer) 2 GlyGlySerAlaTrpSerHisProGlnPheGluLys] ו -10 שלו תגים, נושאת את מוטציות thermostable, Y110A, I291A, ו T439S ומוטציות של C554A cysteines השטח, C580A , ו C622A (CC בהלבשה). רצפים מחשוף תרומבין (LVPRGS) הוכנסו גם CC בהלבשה לאחר Q76 ו- T618 כדי לאפשר הסרה של N- ו- C-טרמיני. הפלסמיד קידוד Fab 8B6 היה שהונדסו הן כבד וקלשרשרות של הנוגדן עם רצפי הפרשת GP67 בשליטת שני יזמי polyhedrin נפרדים. C- הסופית של השרשרת הכבדה של נוגדן 8B6 תויג עם התג 8-שלו ואתר מחשוף תרומבין הוכנס בין השרשרת הכבדה ואת התג.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="760">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:372px;">DH10Bac</td>
			<td style="width:179px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:109px;">10361-012</td>
			<td style="width:101px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Kanamycin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP906-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gentamicin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP918-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tetracycline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-7660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bluo-gal</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15519-028</td>
			<td>5-Bromo-3-indolyl &#946;-D-galactopyranoside</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">IPTG</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>I1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Miniprep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cellfectin II</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10362-100</td>
			<td>Sf9 transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SF9</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sf-900 III SFM media</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12658-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEK-293S GnTI-</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Freestyle 293 media</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12338-018</td>
			<td>293 expression media</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>0984018DJ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium butyrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>303410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">S-citalopram</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4786</td>
			<td>Anagrade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">n-Dodecyl-?-D-Maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cholesteryl hemmisuccinate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850457P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850757P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840457P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Leupeptin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pepstatin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Aprotinin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PMSF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Desthiobiotin</td>
			<td>Iba Life Sciences</td>
			<td>2-1000-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Asolectin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cholesterol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lipid A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L5399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Brain polar lipid</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>141101C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Biobeads</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>152-3920</td>
			<td>Hydrophobic absorption resin</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Goat anti-mouse IRDye 680RD</td>
			<td>Odyssey</td>
			<td>926-68070</td>
			<td>Used as secondary for western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lauryl maltose neopentyl glycol</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>NG310</td>
			<td>Anagrade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Serotonin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pFastBac 8B6</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a name="RANGE!D35">Available from authors</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pEG Bacmam SERT Strep II</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>SERTIC, Available from authors</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pEG Bacmam SERT GFP twin Strep His</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>SERTTC, Available from authors</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pEG Bacmam SERT ts3 GFP twin Strep His</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>SERTCC, Available from authors</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imidazole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>56749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">n-Octyl &#946;-D-maltoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>O310</td>
			<td>Anagrade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Thrombin</td>
			<td>Haematologic Technologies</td>
			<td>HCT-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EndoH</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P0702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trizma-HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5941</td>
			<td>Tris used for preparation of crystallization reservoirs</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PEG 400</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>91893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">6-aminohexanoic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>MT25052CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isoplate-96 TC</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>6005070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PolyJet</td>
			<td>SignaGen</td>
			<td>SL100688</td>
			<td>Polymer transfection reagent for mamalian cells</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Copper HIS-Tag YSI SPA Beads</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>RPNQ0096</td>
			<td>His-tag affinity SPA beads</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Citalopram, [N-Methyl-3H]</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NET1039250UC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ThermoMixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000023</td>
			<td>heating block for thermostability assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ThermoTop</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5308000003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SmartBlock PCR 96, thermoblock for PCR plates</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5306000006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.2 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>25-243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1 L filter system</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2 L flat bottom tissue culture flask</td>
			<td>Genemate</td>
			<td>F-5909-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2 L baffled tissue culture flask</td>
			<td>Genemate</td>
			<td>F-5909-2000B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Forma Orbital Shaker</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Strep-Tactin resin</td>
			<td>Iba Life Sciences</td>
			<td>2-1208-025</td>
			<td>Strep affinity resin</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Extruder</td>
			<td>Northern Lipids</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Li-Cor imaging system</td>
			<td>Odyssey</td>
			<td></td>
			<td>western blot imaging system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">XK16 column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9889-37</td>
			<td>column used for Strep-Tactin and Talon purificaiton</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">100 kDa MWCO protein concentrator</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC910096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">30 kDa MWCO protein concentrator</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC903024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#196;kta FPLC</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>UPC-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HPLC</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>51476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Superose 6 (10/300) column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-5172-01</td>
			<td>Used for FSEC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tangential flow apparatus</td>
			<td>Pall Filtron</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.2 &#181;m filter tangential flow cell</td>
			<td>Pall Filtron</td>
			<td>PSM20C11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">30 kDa MWCO tangential flow concentrator</td>
			<td>Pall Filtron</td>
			<td>OS030T12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Talon resin</td>
			<td>Clonetech</td>
			<td>635504</td>
			<td>His-tag affinity resin used for Fab purification</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1 ml HiTrap SP column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17115101</td>
			<td>Cation exchanger used for Fab purification</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Superdex 200 10/300 GL column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-5175-01</td>
			<td>Used for SEC separation of SERT-8B6</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">24-well VDXm plate</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">18 mm coverslips</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-239</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Virocyt virus counter</td>
			<td>Virocyt</td>
			<td>2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MicroBeta Trilux</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>1450</td>
			<td>96-well scintillation counter</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HiTrap SP column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17115101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sertraline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6319</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

thermostabilization, expression, purification, and crystallization of the human serotonin transporter bound to s-citalopram

טרנספורטר הסרוטונין הוא טרנספורטר נתרן כלוריד מצמידים כי &quot;משאבות&quot; סרוטונין תאיים לתאים. -citalopram S היא תרופה המשמשת לטיפול בדיכאון וחרדה על ידי קשירה של טרנספורטר הסרוטונין עם זיקה גבוהה, חסימת ספיגה חוזרת של סרוטונין. כאן אנו מדווחים הליך יעיל סט של כלים כדי לייצב, מפורשת, לטהר, ולגבש מתחמי טרנספורטר-נוגדן סרוטונין כבול S -citalopram וכן תרופות נוגדות דיכאון אחרות. מוטציות אשר לייצב את טרנספורטר הסרוטונין זוהו באמצעות S -citalopram מחייב assay. טרנספורטר הסרוטונין לידי ביטוי baculovirus-transduced HEK293S GnTI - תאים, היה מחדש לתוך proteoliposomes והשתמשו להעלות נוגדנים גבוהה זיקה. פיתחנו אסטרטגיה לגלות נוגדנים כי הם שימושיים עבור מחקרים מבניים. גישה פשוטה על מנת לתת ביטוי שברי נוגדן בתאי Sf9 גם כבר נקבעה.מתחמי Transporter-נוגדן מטוהרים באמצעות הליך זה הם התנהגו היטב בקלות להתגבש, הפקת מתחמי עם S -citalopram כי diffract צילומי רנטגן 3-4 ברזולוציה Å. האסטרטגיות שפותחו כאן יכולות להיות מנוצלות כדי לקבוע את המבנה של חלבונים בממברנה אחרים אתגרים.

ספריה של מוטציות נקודה אחת ברקע בהלבשה TC נוצר למסך עבור thermostabilizing מוטציות. מוטציות בודדות שהופקו באמצעות mutagenesis סטנדרטי. פרוטוקול ההקרנה מנצל transfected transiently תאי HEK293S וכן נצנץ קרב מבוסס thermostability מסך במהירות זהות מוטציות שימוש התגבשות כמתוארת באיור 1 א. ערכי Tm שרטוט לעומת הכבול [3 ח] citalopram ב RT חושף בונה עם רמות thermostability והביטוי הגבוהים מתאימות עבור טיהור חלבונים (1B איור). שלושה מוטנטים (Y110A, I291A, ו T439S) אוחדו כדי ליצור מבנה יציב ביותר (תרשים 1C). Thermostability מתואם גם עם יציבות מוגברת שרשרת קצרה דטרגנטים דרושי ההתגבשות של המתחם בהלבשה-Fab. הביטוי בקנה המידה הגדול של בהלבשת אדם באמצעות baculovirus-TRansduced HEK293S GnTI - תאים יכול לקחת פחות מ -2 שבועות והוא יכול לייצר כמויות מיליגרם, כפי שמודגם איור 2 א. השתמש של חלבון ה- GFP-tagged בהלבשה CC מאפשר בהלבשה להיות אחריו בנוחות בזמן ביטוי וטיהור על ידי הקרינה (איור 2 ב). טיהור האסטרטגיה שלנו מעורבת 1) solubilization של בהלבשת כבול S -citalopram מ HEK293S GnTI - תאי C12M בנוכחות CHS בתור שומני ייצוב; 2) עקד בהלבשה למטריצת זיקת סטרפטוקוקוס; 3) הסרת החלבונים מזהמים על ידי שטיפה נרחבת; ו -4) elution של בהלבשה הפונקציונלית עם מאגר המכיל desthiobiotin (איור 2 ג). החלבון eluted ללא תשלום, במידה רבה של חלבונים לזיהוי אחרים על ידי מכתים כחול Coomassie ו monodisperse כמו להישפט על ידי FSEC (איור 2 ד, ה). אסטרטגיה דומה ננקטה לטהר בהלבשה עם תג סטרפטוקוקוס השנייה ששימש reconstitution וחיסון (איור 3 א &#39;, ב&#39;). התאגדות של בהלבשה לתוך proteoliposomes מגבירה את הנסיוב מחצית החיים ויציבות של בהלבשה ומשפרת את הסיכוי של בידוד של נוגדנים גבוהה זיקה. יתר על כן, הכללת שומנים, מרכיב של קיר תא החיידק, משמשת אדג&#39;ובנט חזק 9. ליפוזומים Multilamellar הוכנו על ידי התוספת של חיץ לתערובת שומנים יבש צינורות זכוכית resuspended במאגר. שחול של ליפוזומים דרך מסנני גודל נקבובי 200 ננומטר מייצר השעיות liposomal unilamellar monodisperse. ליפוזומים אז רוויים עם חומר ניקוי ואחריו התוספת של בהלבשה מטוהרת דטרגנט. לבסוף, חומרי הניקוי הוסר על ידי תוספת של שרף קליטה הידרופובי על שומנים: תערובת אבקת כביסה. ליגנד נוסף אמור להתווסף המדגם מחדש כדי לבחור עבור נוגדנים שמזהים את הקונפורמציה כבול נוגדות דיכאון. הנוכחות של בהלבשה ב proteoliposomes חייבת להיות מאושרת על ידיsolubilizing מדגם קטן עם צבע טעינת SDS-PAGE או C12M והפעלה על SDS-PAGE ו FSEC (איור 3 ג, ד). שורות תאי Hybridoma להביע נוגדנים בהלבשה יכולות להיות מוקרנות עבור קלסרים גבוהה זיקה מכירי אפיטופים 3D. מאפיינים אלה הם קריטיים להצלחה הסופית של התגבשות, כמו הנוגדן חייב להישאר כבול בחוזקה לאזור מובנה לקדם אריזת קריסטל של תחומים הומוגנית, מסודרים. בשלב הראשון, נוגדנים אשר מכירים אזורים בלתי מובנים מזוהים. בהלבשה היא מפוגלת ומחתה על קרום nitrocellulose; נוגדנים הנקשרים בהלבשה מפוגלת יהיו מערבי חיובי וסבירים להכיר אפיטופים ליניארי. באיור 4 א, אנו מציגים 2 דוגמאות של נוגדנים אשר מערביים חיוביות וסביר לא שימושיים כדי לקדם crystallogenesis. באיור 4B, הנוגדנים מערביים שליליים הנותרים מודגרת עם 100 ננומטר בהלבשה-GFP והופרדוFSEC. נוגדנים הנקשרים בהלבשה תעבור שיא GFP החיובי לעמדה קודמת. מתחמי בהלבשה-נוגדן ניתן מדולל יותר דטרגנט כדי לקבוע אם הם יכולים לקשור עם זיקה nanomolar ואחריו ניתוח על ידי FSEC. תוספת של תוצאות הסרוטונין שינויי קונפורמציה טרנספורטר ובכך הנוגדנים ניתן rescreened כדי לקבוע אם הם יכולים במיוחד להכיר את הקונפורמציה הנכנסת SSRI. באיור 4C, הנוגדנים מוצגים להיקשר בהלבשה בנוכחות סרוטונין, מראה כי epitope (הים) לא לשנות מן SSRI למצע מדינה נכנסת. לבסוף, באיור 4D שילובים של נוגדנים נבדקים על יכולת להיקשר אפיטופים שונים, דבר שהוביל לשינוי שמאלה נוסף. כאן 15B8 או 8A11 נוגדנים להכיר אפיטופ שונה 8B6. הנוגדן 8B6 נבחר לניתוח מבני נוסף המבוסס על הקרנת גביש ראשונית עם בגיד פפאיןטד Fab. הגנים של Fab 8B6 היו משובטים לתוך וקטור ביטוי התא חרק. Fab ניתן לבטא ומופרשת מתאי Sf9 גוברת השעיה. 8B6 Fab יכול להיות מטוהרים מן supernatant תא Sf9 ידי זיקתו-תג (איור 5 א &#39;, ב&#39;) ו כרומטוגרפיה החליפין קטיון (איור 5 ג, ד) וכתוצאה מכך חלבון המופיע ללא מזהמים על ג&#39;לים SDS-PAGE. באיור 5E, את רקומביננטי 8B6 Fab מוצג להיקשר בהלבשה והוא משמש ניסויים ביוכימיים biophysical שלאחר מכן. סמ&quot;ק בהלבשה מטוהר הזיקה מתעכל עם תרומבין EndoH ומעורבב עם 8B6 Fab להקים קומפלקס בנוכחות -citalopram S. מתחם טרנספורטר-נוגדן מופרד ולאחר מכן על ידי ה- SEC ב C8M (איור 6 א) ואת שברי השיא מכילים הוא בהלבשה ו- Fab כפי שמוצג על ידי SDS-PAGE (איור 6). שימוש C8M חיוני היווצרות גבישים כנראה בגללחומר ניקוי השרשרת קצרה מאפשר אריזה טובה יותר בין מולקולות בסריג הגבישי. FSEC מועסק כדי לקבוע אילו שברים צריך להיות ונקווה להתגבשות (איור 6 ג); שברים שאינם monodisperse ו / או מכילים כמויות גדולות של בהלבשה בחינם או Fab לא צריכים להיות משולבים. גבישים בהלבשה-נוגדן בצורת פריזמה ניתן לגדל בנוכחות -citalopram S באמצעות פרוטוקול זה בתלייה דיפוזיה אדי ירידה (איור 7 א). הגבישים וכתוצאה diffract צילומי רנטגן כדי רזולוציה של 3.15 A 10 (איור 7). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54792/54792fig1.jpg" /> איור 1: נצנץ סמיך מבוסס Thermostability Assay.. סקירה כללית של פרוטוקול לסינון thermostability בנוכחות [3 ח] citalopram. B. מקסימום כבול [3 </sup&gt; H] citalopram לעומת טמפרטורת ההתכה לכאורה (Tm). קווים מקווקווים מייצגים ערכים עבור טרנספורטר WT. 3 מוטציות thermostable ביותר מסומנים בתוויות. אזור האפור מייצג מוטציות שיש להם פחות מ -10% של [3 ח] citalopram מחייב ביחס WT ובכך ערכי Tm מדויקים עקב אות לרעש נמוך. ג. עקומות Thermostability עבור WT בהלבשת TC ואת מוטנטים 3 העליונים. ברי שגיאה מייצגים סטיית תקן (SD). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig1large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54792/54792fig2.jpg" /> איור 2: מבט כולל של ביטוי חלבון יונקים Heterologous A.. סקירת Schematized של דור וירוס BacMam וביטוי של בהלבשה ב HEK293S GnTI -. תאי B. הואK293S GnTI - התאים המבטאים את CC בהלבשה (GFP הקרינה) C.. פרופיל Elution של CC בהלבשה על שרף זיקה סטרפטוקוקוס. עקבות ירוקות מייצגות את הריכוז של desthiobiotin, 0 - 100% (0 - 5 מ&quot;מ) D.. ניתוח של CC בהלבשה מטוהר זיקה על 4 - ג&#39;ל 15% SDS-PAGE E.. FSEC של CC בהלבשה מטוהרת זיקה זוהה על ידי קרינת GFP (עירור: 480 ננומטר; פליטה: 510 ננומטר). שיא משחררים ב 15 מיליליטר הוא בהלבשה (#) ו -18 מיליליטר הוא GFP חינם (*). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig2large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54792/54792fig3.jpg" /> איור 3: נציג זיקת טיהור כינון של בהלבשת IC A.. סקירה סכמטי של דור נוגדן. &lt;strong&gt; B. פרופיל Elution נצפה ב 280 ננומטר של טיהור הזיקה של בהלבשה IC על שרף זיקת סטרפטוקוקוס. עקבות ירוקות מייצגות את הריכוז של desthiobiotin, 0 - 100%. (0 - 5 מ&quot;מ) ג. ניתוח של זיקה מטוהרת ומשוחזר בהלבשה על 4 - ג&#39;ל 15% SDS-PAGE D.. FSEC של בהלבשה solubilized הבאה הכינון מחדש. הקרינה של שאריות טריפטופן שימש לאיתור בהלבשה (עירור: 280 ננומטר; פליטה: 335 ננומטר). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig3large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/54792/54792fig4.jpg" /> איור 4:. ניתוח של נוגדני נציג בהלבשת A. הקרנת נוגדנים על ידי כתם המערבי. כ 1 מיקרוגרם של CC בהלבשה עם או בלי GFP היה מוחל על 4 -% 15 SDS-ג&#39;ל עמוד ומחתה על קרום nitrocellulose. כריכה זוהתה באמצעות נוגדן אנטי עכבר עז מצומדות כדי IR דיי. 2G4 ו 10F2 הוא מערבי חיובי. B. עקדת נוגדנים ל -100 ננומטר-tagged GFP בהלבשה וזיהוי על ידי FSEC זוהה באמצעות הקרינה GFP. C. עקדת Fabs שנבחרו בהלבשה GFP-tagged 100 ננומטר בנוכחות סרוטונין 1 מ&quot;מ. D. עקדת Fabs 8A11 או 15B8 כדי בהלבשה-8B6 Fab. פסגות מינור משחרר ב 18 מיליליטר חופשי GFP. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/54792/54792fig5.jpg" /> איור 5: טיהור נציג של Fab 8B6 מתאי Sf9 A.. פרופיל Elution נצפה ב 280 ננומטר של הטיהור של 8B6 Fab ידי chromatograp זיקת התג שלו<html> HY. עקבות ירוקות מייצגות את הריכוז של imidazole, 0 - 50% (0 - 250 מ&quot;מ) B.. ללא צמצום והפחתת SDS-PAGE ג&#39;ל לאחר טיהור זיקת התג שלו. חלבון אשר פועל ליד 50 kDa הוא Fab הלא מופחת (#) ומינים משניים ב 25 kDa מצטמצם Fab (*). ג. פרופיל Elution נצפה ב 280 ננומטר של הטיהור של 8B6 Fab ידי קטיוני מוצג לשיא סימטרי יחיד אשר elutes תחת שיפוע נתרן כלורי ליניארי. עקבות ירוקות מייצגות את ריכוז NaCl, 0 - 100%. (0 - 500 מ&quot;מ) D. ניתוח של 8B6 Fab על ג&#39;ל 12.5% SDS-PAGE הבאים טיהור ידי קטיוני. E. כריכה של 8B6 Fab 10 ננומטר-tagged GFP בהלבשה, זוהה באמצעות הקרינה של GFP. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> דואר 6 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 54792 / 54792fig6.jpg &quot;/&gt; איור 6: כרומטוגרפיה סינון נציג ג&#39;ל של קומפלקס בהלבשה-8B6 בנוכחות S -citalopram A.. פרופיל elution סינון ג&#39;ל של מורכבות בהלבשה-8B6 מטוהרים. השיא ראשי משחררים ב 11.5 מיליליטר הוא מורכב בהלבשה-8B6. שיא של 15 - 17 מ&quot;ל מכיל GFP ו- Fab B.. ניתוח של המתחם בהלבשה-8B6 מטוהרים על 4 - ג&#39;ל 15% SDS-PAGE. העמדות של בהלבשה ואת השרשרות הכבדות לאור Fab מוצגות באמצעות מקף. C. FSEC של שברים מופרדים גודל. מתחמים בהלבשה-8B6 התגלו באמצעות קרינת טריפטופן. חלק 17 מכיל כמות גדולה של בהלבשה אשר לא מורכב עם Fab. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 7"src = &quot;/ files / ftp_upload / 54792 / 54792fig7.jpg&quot; /&gt; איור 7: התגבשות של קומפלקס בהלבשה-8B6 Bound ל S -citalopram A.. במיקרוסקופ אור גבישים בצורת פאות של המתחם בהלבשה-8B6 לאחר 2 שבועות של צמיחה. סרגל קנה מידה שווה 200 מיקרומטר. B. גבישים בהלבשה-8B6 diffract צילומי רנטגן כדי 3.15 Å. טבעת כחול מייצג 3.15 Å. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig7large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> טבלה 1:. מסך התגבשות עבור קומפלקס בהלבשה-8B6 Bound ל S -citalopram <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792table1.xlsx">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הטבלה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram at JoVE.com

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

כתב יד זה מתאר כיצד למסך מוטציות thermostabilizing, לטהר את טרנספורטר הסרוטונין האדם, ליצור נוגדנים זיקה גבוהה, ולגבש במתחם טרנספורטר-נוגדן סרוטונין מאוגד -citalopram S תרופה נגד דיכאון. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם המחקר של מובילי קרום מאתגר אחרים, קולטנים, ותעלות.

Thermostabilization, ביטוי, טיהור, התגבשות של Transporter סרוטונין האדם Bound כדי<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

הביטוי, טיהור, פעילות אנטי מיקרוביאלית של S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

ביטוי חלבון רקומביננטי, התגבשות, מחקרים ביופיסיקליים של א<em&gt; Bacillus</em&gt; -שמר Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

To overcome safety restrictions and regulations when studying genes and proteins from true pathogens, their homologues can be studied. Bacillus anthracis ...

A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/&#945;

A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±

מדריך הייצור, התגבשות ונחישות מבנה של IKK1 האנושי/α

A class of extracellular stimuli requires activation of IKK1/&#945; to induce generation of an NF-&#954;B subunit, p52, through processing of its ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

ביטוי וטיהור של תעלות יונים Bestrophin מידע יונקים

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

הביטוי ולטיהור TRPC3 האדם רגיש השומנים הקטיון ערוץ לקביעת מבניים על-ידי הקפאה יחיד-חלקיקים-מיקרוסקופ

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

ביטוי Solubilization, טיהור של בוראט האיקריוטים שנאים

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...

Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

ביטוי וטיהור של Nuclease-מזבל החמצן חינם Protocatechuate 3, 4-דיחמצן

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

ביטוי, טיהור, התגבשות ואנזים אנזימים המכילים חלבונים בתחום הידרוקלז

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

PCR Mutagenesis, Cloning, Expression, Fast Protein Purification Protocols and Crystallization of the Wild Type and Mutant Forms of Tryptophan Synthase

PCR מוטגנסיס, שיבוט, ביטוי, פרוטוקולי טיהור חלבונים מהירים והתגבשות של סוג הבר וצורות מוטציה של טריפטופן סינתאז

Structural studies with tryptophan synthase (TS) bienzyme complex (&#945;2&#946;2 TS) from Salmonella typhimurium have been performed to better understand ...

Bacterial Expression and Purification of Human Matrix Metalloproteinase-3 using Affinity Chromatography

ביטוי חיידקי וטיהור של מטריקס אנושי Metalloproteinase-3 באמצעות כרומטוגרפיה זיקה

Matrix metalloproteinases (MMPs) belong to the family of metzincin proteases with central roles in extracellular matrix (ECM) degradation and remodeling, ...