Name: thermostabilization, expression, purification, and crystallization of the human serotonin transporter bound to s-citalopram
Uploaded: 2016-11-27T15:00:00
Duration: 12 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram at JoVE.com

We thank D. Cawley for generating monoclonal antibodies. We thank A. Penmatsa and K. Wang for sharing ideas and expertise developed from the dopamine transporter. L. Vaskalis for assistance with figures, H. Owen for help with manuscript preparation and other Gouaux laboratory members for helpful discussions. J.A.C. has support from a Banting postdoctoral fellowship from the Canadian Institutes of Health Research. E.M.G. is supported by the National Science Foundation Graduate Research Fellowship. We are particularly grateful to Bernie and Jennifer LaCroute for their generous support, as well as for funding from the NIH (5R37MH070039). E.G. is an investigator of the Howard Hughes Medical Institute.

<ol>
	<li>Kristensen, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLC6+neurotransmitter+transporters:+structure,+function,+and+regulation.">SLC6 neurotransmitter transporters: structure, function, and regulation.</a> Pharmacol Rev. 63 (3), 585-640 (2011).</li><li>Broer, S., Gether, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+solute+carrier+6+family+of+transporters.">The solute carrier 6 family of transporters.</a> Br J Pharmacol. 167 (2), 256-278 (2012).</li><li>Andersen, J., Kristensen, A. S., Bang-Andersen, B., Stromgaard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+understanding+of+the+interaction+of+antidepressant+drugs+with+serotonin+and+norepinephrine+transporters.">Recent advances in the understanding of the interaction of antidepressant drugs with serotonin and norepinephrine transporters.</a> Chem Commun (Camb). 25 (25), 3677-3692 (2009).</li><li>Hahn, M. K., Blakely, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+impact+of+SLC6+transporter+genetic+variation.">The functional impact of SLC6 transporter genetic variation.</a> Annu Rev Pharmacol Toxicol. 47, 401-441 (2007).</li><li>Abdul-Hussein, S., Andrell, J., Tate, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermostabilisation+of+the+serotonin+transporter+in+a+cocaine-bound+conformation.">Thermostabilisation of the serotonin transporter in a cocaine-bound conformation.</a> J Mol Biol. 425 (12), 2198-2207 (2013).</li><li>Green, E. M., Coleman, J. A., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermostabilization+of+the+human+serotonin+transporter+in+an+antidepressant-Bound+Conformation.">Thermostabilization of the human serotonin transporter in an antidepressant-Bound Conformation.</a> Plos One. 10 (12), e0145688 (2015).</li><li>Goehring, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+and+large-scale+expression+of+membrane+proteins+in+mammalian+cells+for+structural+studies.">Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies.</a> Nat Protoc. 9 (11), 2574-2585 (2014).</li><li>Kawate, T., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-detection+size-exclusion+chromatography+for+precrystallization+screening+of+integral+membrane+proteins.">Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins.</a> Structure. 14 (4), 673-681 (2006).</li><li>De Becker, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adjuvant+monophosphoryl+lipid+A+increases+the+function+of+antigen-presenting+cells.">The adjuvant monophosphoryl lipid A increases the function of antigen-presenting cells.</a> Int Immunol. 12 (6), 807-815 (2000).</li><li>Coleman, J. 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U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bicelle+crystallization:+a+new+method+for+crystallizing+membrane+proteins+yields+a+monomeric+bacteriorhodopsin+structure.">Bicelle crystallization: a new method for crystallizing membrane proteins yields a monomeric bacteriorhodopsin structure.</a> J Mol Biol. 316 (1), 1-6 (2002).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Biophysical तकनीक द्वारा झिल्ली प्रोटीन संरचना के निर्धारण में कई चिकित्सकीय महत्वपूर्ण ट्रांसपोर्टरों, रिसेप्टर्स, और चैनल 11 के लिए एक चुनौतीपूर्ण उपक्रम बनी हुई है। यहाँ हम मानव सेरोटोनिन ट्रांसपोर्टर एस -citalopram के लिए बाध्य की संरचना निर्धारण के लिए विकसित की विस्तृत विशेषज्ञता का हिस्सा है। हम आशा करते हैं कि इन तरीकों अन्य गठनात्मक राज्यों के साथ ही अन्य मुश्किल झिल्ली प्रोटीन के ढांचे में SERT के ढांचे को निर्धारित करने के लिए उपयोगी हो जाएगा। इसके अलावा, जैव रासायनिक यहाँ वर्णित तकनीक भी डिटर्जेंट में शुद्ध SERT और एक के पास देशी लिपिड पर्यावरण के समारोह का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। SERT क्रिस्टलीकरण कई उपकरणों और तकनीकों के विकास पर hinged। सबसे पहले, ट्रांसपोर्टर thermostability में सुधार SERT वेरिएंट जो झिल्ली 6 से ट्रांसपोर्टर की निकासी के बाद विभिन्न डिटर्जेंट micelles में अच्छी तरह से व्यवहार कर रहे थे उत्पादन किया। दूसरा, उपयोगशुद्धि और क्रिस्टलीकरण भर में उच्च आत्मीयता ligand एस -citalopram आगे स्थिरता में सुधार और कम गठनात्मक विविधता की। तीसरा, BacMam अभिव्यक्ति प्रणाली 7 2 सप्ताह की एक छोटी सी अवधि में SERT की बड़ी मात्रा के उत्पादन के लिए अनुमति दी है, दोनों प्रतिरक्षण और क्रिस्टलीकरण की सुविधा का विकास। अंत में, रणनीतियों के विकास के उच्च आत्मीयता एंटीबॉडी जो 3 डी epitopes 8B6 एंटीबॉडी की खोज की है जो क्रिस्टल में SERT एंटीबॉडी परिसरों का भी आदेश दिया पैकिंग को बढ़ावा के लिए अनुमति दी है पहचान के लिए चयन करने के लिए। महत्वपूर्ण कदम और अभिकर्मकों के साथ ही आम समस्या है जो अक्सर प्रोटोकॉल भर में होने का एक नंबर रहे हैं। सबसे पहले, उच्च अनुमापांक SERT p2 के वायरस की पीढ़ी समस्याग्रस्त किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में p2 के वायरस उत्पन्न करने के लिए पी 1 वायरस की कम मात्रा जोड़ने से आम तौर पर इस समस्या mitigates, और मामलों में जहां p2 के वायरस अनुमापांक कम है, पी 3 वायरस usin बनाया जा सकता है0.0001 के MOI में जी वायरस। एक अनुमापांक 1 एक्स 10 8 वायरस कणों से भी कम समय के साथ वायरस / एमएल नहीं किया जाना चाहिए और लगभग हमेशा कम प्रोटीन की पैदावार में परिणाम होगा। अभिव्यक्ति के लिए, HEK293S GnTI - कोशिकाओं के बाद से वे कमी एन मैं गतिविधि -acetylglucosaminyltransferase और इस तरह जटिल एन -glycans synthesize नहीं कर सकते चुने गए हैं, बजाय केवल उच्च mannose एन -glycans का निर्माण किया। Endoh cleaves एन बाह्य पाश 2 (EL2) में दो स्थलों पर उच्च mannose ग्लाइकान की ग्लाइकोसिलेशन से जुड़े, एक एन -acetylglucosamine asparagine से जुड़ी जा रही है। एन के पाचन से जुड़े शर्करा EL2 की सतह एन्ट्रापी जो क्रिस्टलीकरण के लिए संभावना महत्वपूर्ण है कम कर देता है। एंटीबॉडी की पीढ़ी के लिए, SERT आईसी टीकाकरण के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए। GFP अत्यधिक immunogenic 12 है और जब से यह मुश्किल है पूरी तरह से एसईसी द्वारा दूर करने के लिए एंटीबॉडी उत्पन्न करने के लिए एक संलयन टैग के रूप में इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए। लचीला एन और SERT की सी टर्मिनस भी नहीं थेआदेश में इन क्षेत्रों के खिलाफ एंटीबॉडी से बचने के लिए निर्माण में शामिल थे। चूहे पुनर्गठन प्रोटीन की 30 ग्राम के साथ प्रतिरक्षित किया जा सकता है; immunizing चूहों जारी रखने के लिए जब तक एंटीबॉडी के उच्च सांद्रता सीरम का पता लगाया जा सकता है और वर्णित के रूप में 13 हाइब्रिडोमा कोशिकाओं का उत्पादन। एक thermostabilized का निर्माण आम तौर पर टीकाकरण के लिए सबसे अच्छा विकल्प है; यदि ट्रांसपोर्टर अच्छी तरह से व्यवहार किया है और शुद्धि के बाद जैविक गतिविधि को बरकरार रखे हुए है, यह अक्सर एंटीबॉडी बढ़ाने के लिए पर्याप्त है। 8B6 एंटीबॉडी गुम्मट SERT के खिलाफ उठाया गया था। क्रिस्टलीकरण के लिए, एसईसी से केवल चोटी अंशों monodisperse जटिल युक्त रूप FSEC द्वारा न्याय संयुक्त और ध्यान केंद्रित किया जाना चाहिए। SERT-8B6 क्रिस्टल की स्थिति की एक सीमित दायरे में आगे बढ़ने और कदम है जो विशेष रूप से SERT क्रिस्टल विकास से संबंधित समस्याओं का निवारण करने के लिए लिया जाना चाहिए की एक नंबर रहे हैं। Tris आधार एचसीएल के साथ समायोजित किया जलाशय समाधान में नहीं किया जाना चाहिए, क्योंकि इस बफर क्रिस्टल विकास का समर्थन नहीं करता; यह इस प्रकार है CRIराजनैतिक बजाय Tris का उपयोग करने के NaOH के साथ समायोजित। SERT क्रिस्टल, खूंटी 400 के एक संकीर्ण एकाग्रता रेंज में बढ़ने इसलिए यदि क्रिस्टल हो जाना नहीं है या कई छोटे क्रिस्टल मनाया जाता है, खूंटी 400 एकाग्रता में भी एक छोटा सा वृद्धि या कमी की सलाह दी जाएगी। इसके अलावा, एडिटिव 6-aminohexanoic एसिड भी अनुकूलित स्क्रीन में इस्तेमाल किया गया था न्यूक्लिएशन में सुधार होगा। प्रोटीन की बूंद अनुपात: अच्छी तरह से समाधान भी क्रिस्टल विकास के लिए कारक का निर्धारण करने के लिए महत्वपूर्ण है। ड्रॉप 1.5 का अनुपात - 2: 1 सिफारिश कर रहे हैं, ड्रॉप 2 के करीब अनुपात के साथ: 1 आमतौर पर बड़े 3-आयामी क्रिस्टल के विकास का समर्थन। अंत में, कम प्रोफ़ाइल 24 अच्छी तरह प्लेटें का उपयोग भी शायद वाष्प प्रसार की दर के संशोधन के कारण क्रिस्टल विकास की ओर महत्वपूर्ण है। स्पा विधि करने के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण म्यूटेंट जो एक कोकीन बाध्य रचना एक फिल्टर बाध्यकारी परख 5 का प्रयोग करने में चूहे सेरोटोनिन ट्रांसपोर्टर को स्थिर करने के लिए स्क्रीन करने के लिए विकसित किया गया है। इसके विपरीत, स्पा बीएएसईडी परख SERT के अंश जो ligand के लिए बाध्य रहता है के निर्धारण के द्वारा निम्नलिखित अनुक्रमिक हीटिंग चरणों के लिए अनुमति देता है। इस प्रकार, इस नमूने की एक छोटी संख्या से पिघलने के तापमान में तेजी से निर्धारण के लिए अनुमति देता है। स्पा विधि एक radiolabeled उच्च आत्मीयता ligand की उपलब्धता पर निर्भर करता है और कोई ligands के नाम से जाना जाता है, तो जो submicromolar आत्मीयता के साथ बाँध तो एक वैकल्पिक दृष्टिकोण आवश्यक हो जाएगा। कई अन्य तरीकों आमतौर पर इस तरह फ्लोरोसेंट रंगों और उष्मामिति 14 के बंधन के रूप में प्रोटीन स्थिरता को मापने के लिए उपयोग किया जाता है, लेकिन कम throughput और या तो सीधे समारोह को मापने या प्रोटीन की बड़ी मात्रा की आवश्यकता करने में असमर्थ हैं। स्पा विधि का इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है, एक वैकल्पिक उच्च throughput दृष्टिकोण एक FSEC आधारित thermostability परख 15 (FSEC टीएस), जहां नमूना शेष ट्रांसपोर्टर के अंश की जुदाई के द्वारा पीछा गरम किया जाता है। FSEC टीएस chromatographic व्यवहार और oligomeric राज्य पहुँचने के लिए एक उपयोगी तरीका है और एपी हैowerful पूरक उपकरण स्पा विधि के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है। विभिन्न आम प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रणालियों की तुलना से भी SERT अभिव्यक्ति के लिए 16 स्तनधारी कोशिकाओं के उपयोग के पक्ष में पाया गया था और हैरानगी इस संभावना स्तनधारी मूल के कई प्रोटीन के लिए मामला है। तरीकों जो हम अभिव्यक्ति के लिए इस्तेमाल किया है SERT के लिए अनुरूप किया गया है, लेकिन संभावना आसानी से निभा रहे हैं। स्थितियां जो अभिव्यक्ति के उच्च स्तर के पक्ष में सावधानी जैसे सोडियम butyrate के रूप में अभिव्यक्ति, तापमान, वायरस एकाग्रता, और उपस्थिति हिस्टोन deacetylase अवरोधकों के समय अलग से पहचान की जानी चाहिए। हम आम तौर पर सीएचएस के साथ मिलकर इस तरह के C12M रूप में एक हल्के लंबी श्रृंखला डिटर्जेंट में आत्मीयता शुद्धि के पक्ष से पहले बाध्यकारी उच्च आत्मीयता ligand बनाए रखने के लिए पुनर्गठन करने के लिए। हाइड्रोफोबिक अवशोषण का उपयोग कर पुनर्गठन एक हल्के तकनीक है जो हम कई अन्य ट्रांसपोर्टरों और रिसेप्टर्स के लिए प्रभावी होना पाया गया है। अगर यहसफल नहीं, डायलिसिस, कमजोर पड़ने, या एसईसी द्वारा उच्च महत्वपूर्ण मिसेल सांद्रता के साथ डिटर्जेंट को हटाने के 17 प्रदान की प्रतिजन ऐसे डिटर्जेंट में पर्याप्त रूप से स्थिर है नियोजित किया जा सकता है। मामलों में जहां कोई उपयुक्त एंटीबॉडी पाया जाता है, हम लगभग हमेशा मिल मुद्दा समारोह या प्रतिजन का विकृतीकरण के नुकसान की वजह से है और ऐसे मामलों में हम सफलतापूर्वक प्रोटीन जैव रसायन पर विशेष ध्यान दे नए टीकाकरण प्रदर्शन किया। अंत में, ligands और एंटीबॉडी जो उच्च आत्मीयता के साथ बाँध एक तर्क से योजना बनाई क्रिस्टलीकरण प्रयोग के लिए आधार के रूप में करना चाहिए और एक थर्मास्टाइबल संस्करण का लाभ लेने से, एक अलग डिटर्जेंट के गुणों को अलग से स्थितियों की एक व्यापक रेंज स्क्रीन कर सकते हैं। इसके अलावा, एक lipídic mesophase 18 में क्रिस्टलीकरण या bicelles 19 का उपयोग कर हमेशा micelles में क्रिस्टलीकरण के लिए एक विकल्प के रूप में माना जाना चाहिए। इन प्रिंसिपलों और तरीकों कुछ modifi साथ प्रयोग किया जा सकता हैकई अन्य transmembrane प्रोटीन है जो एक्सप्रेस और अन्य अभिव्यक्ति मेजबान से शुद्ध, और उच्च आत्मीयता दवाओं के लक्ष्यों की संरचना निर्धारण के लिए विशेष रूप से उपयोगी हो जाएगा करने के लिए मुश्किल हो जाता है के लिए केशन।

सेरोटोनिन ट्रांसपोर्टर (SERT) एक अभिन्न झिल्ली प्रोटीन है कि सेलुलर झिल्ली 1 भर में सेरोटोनिन के परिवहन की सुविधा है। SERT स्नायुसंचारी सोडियम Symporters (NSSs) जो भी डोपामाइन और norepinephrine ट्रांसपोर्टरों 2 शामिल है के एक परिवार के अंतर्गत आता है। SERT व्यापक रूप से निर्धारित एंटी और विरोधी चिंता दवाओं जो प्रतिस्पर्धात्मक रूप सेरोटोनिन परिवहन 3 को बाधित करने के लिए अधिनियम की आणविक लक्ष्य है। SERT synaptic फांक से न्यूरोट्रांसमीटर दूर करने के लिए सोडियम की उर्जा अनुकूल cotransport कारनामे। Serotonergic प्रणाली के व्यापक लक्षण वर्णन से पता चला है कि सेरोटोनिन चयापचय में परिवर्तन लगभग मूड, नींद, दर्द, अनुभूति सहित सभी मस्तिष्क संबंधी प्रक्रियाओं को प्रभावित करने के लिए दिखाई देते हैं, और आक्रामकता 4 व्यवहार। SERT समारोह एस -citalopram, जैसे antidepressants और चयनात्मक serotonin reuptake inhibitors (SSRIs) के उपयोग के माध्यम के रूप में अच्छी तरह से psychostimula द्वारा संशोधित किया जा सकताएनटीएस और एम्फेटामाइन और 3,4-methylenedioxy- एन -methylamphetamine या &quot;परमानंद&quot; 1,2 के रूप में की लत की दवाओं। SSRIs मूड विकारों के उपचार के लिए काफी महत्वपूर्ण हैं, अभी तक उनकी कार्रवाई के लिए सटीक संरचनात्मक आधार अच्छी तरह से समझ नहीं है। गुम्मट SERT इस प्रकार SERT 5,6 की एक तीन आयामी (3 डी) संरचना की दिशा में प्रगति में बाधा, डिटर्जेंट micelles में अस्थिर है। हाल ही में, हम जो मजबूती के साथ डिटर्जेंट की एक विस्तृत श्रृंखला में स्थिर रहे हैं और बाध्यकारी गतिविधि 6 SSRI बनाए रखने SERT के वेरिएंट विकसित की है। ये थर्मास्टाइबल SERT वेरिएंट एक जगमगाहट निकटता आधारित thermostability परख का उपयोग कर चयन किया गया था। यहाँ हम एंटीबॉडी और एस -citalopram के साथ परिसर में उच्च आत्मीयता एंटीबॉडी जो SERT बाध्य कर सकते हैं की पीढ़ी के लिए एक प्रक्रिया है, और शुद्धि और थर्मास्टाइबल SERT के क्रिस्टलीकरण का वर्णन है,। इस प्रोटोकॉल मानता है कि SERT और 8B6 जीन सफल किया गया हैY क्रमश BacMam 7 और कीट अभिव्यक्ति वैक्टर में क्लोन। एंटीबॉडी उत्पन्न करने के लिए, सीडीएनए एन्कोडिंग अवशेषों गुम्मट SERT की 73-616 एक सी टर्मिनल Strep द्वितीय टैग (SERT आईसी) के साथ BacMam वेक्टर में क्लोन किया गया था। Thermostability स्क्रीन के लिए, SERT अवशेषों सी टर्मिनल GFP के साथ 73-616, strep द्वितीय, और 10-उनका टैग (SERT टीसी) का इस्तेमाल किया गया था। व्यक्तिगत बिंदु उत्परिवर्तन SERT टीसी पृष्ठभूमि में उत्पन्न किया गया। क्रिस्टलीकरण प्रोटोकॉल के लिए, SERT-GFP संलयन प्रोटीन के साथ ट्विन-Strep [TrpSerHisProGlnPheGluLys (GlyGlyGlySer) 2 GlyGlySerAlaTrpSerHisProGlnPheGluLys] और 10-उनका टैग इस्तेमाल किया गया था, थर्मास्टाइबल म्यूटेंट, Y110A, I291A, और T439S और सतह cysteines C554A, C580A के म्यूटेशन को ले जाने और C622A (SERT सीसी)। थ्रोम्बिन दरार दृश्यों (LVPRGS) भी Q76 और T618 के बाद SERT सीसी में डाला गया एन के हटाने और सी-Termini की अनुमति है। प्लाज्मिड 8B6 फैब एन्कोडिंग दोनों भारी और हल्के व्यक्त करने के लिए इंजीनियर थादो अलग-अलग polyhedrin प्रमोटरों के नियंत्रण में GP67 स्राव दृश्यों के साथ एंटीबॉडी की जंजीरों। 8B6 एंटीबॉडी की भारी श्रृंखला के सी टर्मिनस एक 8 उनकी टैग के साथ टैग किया गया था और एक थ्रोम्बिन दरार साइट भारी श्रृंखला और टैग के बीच डाला गया था।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="760">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:372px;">DH10Bac</td>
			<td style="width:179px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:109px;">10361-012</td>
			<td style="width:101px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Kanamycin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP906-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gentamicin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP918-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tetracycline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-7660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bluo-gal</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15519-028</td>
			<td>5-Bromo-3-indolyl &#946;-D-galactopyranoside</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">IPTG</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>I1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Miniprep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cellfectin II</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10362-100</td>
			<td>Sf9 transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SF9</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sf-900 III SFM media</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12658-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEK-293S GnTI-</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Freestyle 293 media</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12338-018</td>
			<td>293 expression media</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>0984018DJ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium butyrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>303410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">S-citalopram</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4786</td>
			<td>Anagrade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">n-Dodecyl-?-D-Maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cholesteryl hemmisuccinate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850457P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850757P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840457P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Leupeptin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pepstatin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Aprotinin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PMSF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Desthiobiotin</td>
			<td>Iba Life Sciences</td>
			<td>2-1000-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Asolectin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cholesterol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lipid A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L5399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Brain polar lipid</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>141101C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Biobeads</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>152-3920</td>
			<td>Hydrophobic absorption resin</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Goat anti-mouse IRDye 680RD</td>
			<td>Odyssey</td>
			<td>926-68070</td>
			<td>Used as secondary for western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lauryl maltose neopentyl glycol</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>NG310</td>
			<td>Anagrade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Serotonin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pFastBac 8B6</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a name="RANGE!D35">Available from authors</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pEG Bacmam SERT Strep II</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>SERTIC, Available from authors</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pEG Bacmam SERT GFP twin Strep His</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>SERTTC, Available from authors</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pEG Bacmam SERT ts3 GFP twin Strep His</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>SERTCC, Available from authors</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imidazole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>56749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">n-Octyl &#946;-D-maltoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>O310</td>
			<td>Anagrade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Thrombin</td>
			<td>Haematologic Technologies</td>
			<td>HCT-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EndoH</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P0702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trizma-HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5941</td>
			<td>Tris used for preparation of crystallization reservoirs</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PEG 400</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>91893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">6-aminohexanoic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>MT25052CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isoplate-96 TC</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>6005070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PolyJet</td>
			<td>SignaGen</td>
			<td>SL100688</td>
			<td>Polymer transfection reagent for mamalian cells</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Copper HIS-Tag YSI SPA Beads</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>RPNQ0096</td>
			<td>His-tag affinity SPA beads</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Citalopram, [N-Methyl-3H]</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NET1039250UC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ThermoMixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000023</td>
			<td>heating block for thermostability assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ThermoTop</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5308000003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SmartBlock PCR 96, thermoblock for PCR plates</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5306000006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.2 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>25-243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1 L filter system</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2 L flat bottom tissue culture flask</td>
			<td>Genemate</td>
			<td>F-5909-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2 L baffled tissue culture flask</td>
			<td>Genemate</td>
			<td>F-5909-2000B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Forma Orbital Shaker</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Strep-Tactin resin</td>
			<td>Iba Life Sciences</td>
			<td>2-1208-025</td>
			<td>Strep affinity resin</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Extruder</td>
			<td>Northern Lipids</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Li-Cor imaging system</td>
			<td>Odyssey</td>
			<td></td>
			<td>western blot imaging system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">XK16 column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9889-37</td>
			<td>column used for Strep-Tactin and Talon purificaiton</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">100 kDa MWCO protein concentrator</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC910096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">30 kDa MWCO protein concentrator</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC903024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#196;kta FPLC</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>UPC-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HPLC</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>51476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Superose 6 (10/300) column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-5172-01</td>
			<td>Used for FSEC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tangential flow apparatus</td>
			<td>Pall Filtron</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.2 &#181;m filter tangential flow cell</td>
			<td>Pall Filtron</td>
			<td>PSM20C11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">30 kDa MWCO tangential flow concentrator</td>
			<td>Pall Filtron</td>
			<td>OS030T12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Talon resin</td>
			<td>Clonetech</td>
			<td>635504</td>
			<td>His-tag affinity resin used for Fab purification</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1 ml HiTrap SP column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17115101</td>
			<td>Cation exchanger used for Fab purification</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Superdex 200 10/300 GL column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-5175-01</td>
			<td>Used for SEC separation of SERT-8B6</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">24-well VDXm plate</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">18 mm coverslips</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-239</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Virocyt virus counter</td>
			<td>Virocyt</td>
			<td>2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MicroBeta Trilux</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>1450</td>
			<td>96-well scintillation counter</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HiTrap SP column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17115101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sertraline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6319</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

thermostabilization, expression, purification, and crystallization of the human serotonin transporter bound to s-citalopram

सेरोटोनिन ट्रांसपोर्टर एक सोडियम और क्लोराइड युग्मित ट्रांसपोर्टर है कि &quot;पंप&quot; कोशिकाओं में बाह्य सेरोटोनिन है। एस -citalopram उच्च आत्मीयता के साथ सेरोटोनिन ट्रांसपोर्टर के लिए बाध्य, सेरोटोनिन अवरोध अवरुद्ध करके अवसाद और चिंता के इलाज के लिए इस्तेमाल एक दवा है। यहाँ हम एक कुशल प्रक्रिया और उपकरण, स्थिर करने के लिए एक्सप्रेस, शुद्ध, और सेरोटोनिन ट्रांसपोर्टर-प्रतिरक्षी परिसरों एस -citalopram और अन्य अवसादरोधी दवाओं के लिए बाध्य मणिभ का एक सेट की रिपोर्ट। म्यूटेशन जो सेरोटोनिन ट्रांसपोर्टर को स्थिर एक एस -citalopram बाध्यकारी परख का उपयोग पहचान की गई। सेरोटोनिन ट्रांसपोर्टर में baculovirus-transduced HEK293S GnTI व्यक्त - कोशिकाओं, proteoliposomes में पुनर्गठन और उच्च आत्मीयता एंटीबॉडी बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया गया था। हम एंटीबॉडी कि संरचनात्मक अध्ययन के लिए उपयोगी होते हैं खोज करने के लिए एक रणनीति विकसित किया है। Sf9 कोशिकाओं में एंटीबॉडी अंशों की अभिव्यक्ति के लिए एक स्पष्ट दृष्टिकोण भी स्थापित किया गया है।ट्रांसपोर्टर-प्रतिरक्षी परिसरों इस प्रक्रिया का उपयोग कर शुद्ध अच्छी तरह से व्यवहार और आसानी से मणिभ, कि 3-4 एक प्रस्ताव को टुकड़े एक्स रे एस -citalopram साथ परिसरों का निर्माण कर रहे हैं। रणनीतियों यहाँ विकसित अन्य चुनौतीपूर्ण झिल्ली प्रोटीन की संरचना निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जा सकता है।

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Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

इस पांडुलिपि का वर्णन करता है, म्यूटेशन thermostabilizing के लिए स्क्रीन कैसे करने के लिए मानव सेरोटोनिन ट्रांसपोर्टर को शुद्ध उच्च संबंध एंटीबॉडी पैदा करते हैं, और सेरोटोनिन ट्रांसपोर्टर एंटीबॉडी जटिल एंटी दवा एस -citalopram के लिए बाध्य मणिभ। इस प्रोटोकॉल अन्य चुनौतीपूर्ण झिल्ली ट्रांसपोर्टरों, रिसेप्टर्स, और चैनल के अध्ययन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

Thermostabilization, अभिव्यक्ति, शोधन, और मानव सेरोटोनिन ट्रांसपोर्टर के क्रिस्टलीकरण के लिए बाध्य<em&gt; S</em&gt; -citalopram

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