Name: thermostabilization, expression, purification, and crystallization of the human serotonin transporter bound to s-citalopram
Uploaded: 2016-11-27T15:00:00
Duration: 12 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram at JoVE.com

We thank D. Cawley for generating monoclonal antibodies. We thank A. Penmatsa and K. Wang for sharing ideas and expertise developed from the dopamine transporter. L. Vaskalis for assistance with figures, H. Owen for help with manuscript preparation and other Gouaux laboratory members for helpful discussions. J.A.C. has support from a Banting postdoctoral fellowship from the Canadian Institutes of Health Research. E.M.G. is supported by the National Science Foundation Graduate Research Fellowship. We are particularly grateful to Bernie and Jennifer LaCroute for their generous support, as well as for funding from the NIH (5R37MH070039). E.G. is an investigator of the Howard Hughes Medical Institute.

<ol>
	<li>Kristensen, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLC6+neurotransmitter+transporters:+structure,+function,+and+regulation.">SLC6 neurotransmitter transporters: structure, function, and regulation.</a> Pharmacol Rev. 63 (3), 585-640 (2011).</li><li>Broer, S., Gether, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+solute+carrier+6+family+of+transporters.">The solute carrier 6 family of transporters.</a> Br J Pharmacol. 167 (2), 256-278 (2012).</li><li>Andersen, J., Kristensen, A. S., Bang-Andersen, B., Stromgaard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+understanding+of+the+interaction+of+antidepressant+drugs+with+serotonin+and+norepinephrine+transporters.">Recent advances in the understanding of the interaction of antidepressant drugs with serotonin and norepinephrine transporters.</a> Chem Commun (Camb). 25 (25), 3677-3692 (2009).</li><li>Hahn, M. K., Blakely, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+impact+of+SLC6+transporter+genetic+variation.">The functional impact of SLC6 transporter genetic variation.</a> Annu Rev Pharmacol Toxicol. 47, 401-441 (2007).</li><li>Abdul-Hussein, S., Andrell, J., Tate, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermostabilisation+of+the+serotonin+transporter+in+a+cocaine-bound+conformation.">Thermostabilisation of the serotonin transporter in a cocaine-bound conformation.</a> J Mol Biol. 425 (12), 2198-2207 (2013).</li><li>Green, E. M., Coleman, J. A., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermostabilization+of+the+human+serotonin+transporter+in+an+antidepressant-Bound+Conformation.">Thermostabilization of the human serotonin transporter in an antidepressant-Bound Conformation.</a> Plos One. 10 (12), e0145688 (2015).</li><li>Goehring, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+and+large-scale+expression+of+membrane+proteins+in+mammalian+cells+for+structural+studies.">Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies.</a> Nat Protoc. 9 (11), 2574-2585 (2014).</li><li>Kawate, T., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-detection+size-exclusion+chromatography+for+precrystallization+screening+of+integral+membrane+proteins.">Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins.</a> Structure. 14 (4), 673-681 (2006).</li><li>De Becker, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adjuvant+monophosphoryl+lipid+A+increases+the+function+of+antigen-presenting+cells.">The adjuvant monophosphoryl lipid A increases the function of antigen-presenting cells.</a> Int Immunol. 12 (6), 807-815 (2000).</li><li>Coleman, J. A., Green, E. M., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+structures+and+mechanism+of+the+human+serotonin+transporter.">X-ray structures and mechanism of the human serotonin transporter.</a> Nature. , (2016).</li><li>White, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+progress+of+membrane+protein+structure+determination.">The progress of membrane protein structure determination.</a> Protein Sci. 13 (7), 1948-1949 (2004).</li><li>Gambotto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenicity+of+enhanced+green+fluorescent+protein+(EGFP)+in+BALB/c+mice:+identification+of+an+H2-Kd-restricted+CTL+epitope.">Immunogenicity of enhanced green fluorescent protein (EGFP) in BALB/c mice: identification of an H2-Kd-restricted CTL epitope.</a> Gene Ther. 7 (23), 2036-2040 (2000).</li><li>Galfre, G., Howe, S. C., Milstein, C., Butcher, G. W., Howard, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+major+histocompatibility+antigens+produced+by+hybrid+cell+lines.">Antibodies to major histocompatibility antigens produced by hybrid cell lines.</a> Nature. 266 (5602), 550-552 (1977).</li><li>Deller, M. C., Kong, L., Rupp, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+stability:+a+crystallographer's+perspective.">Protein stability: a crystallographer's perspective.</a> Acta Crystallogr F Struct Biol Commun. 72, 72-95 (2016).</li><li>Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescence-detection+size-exclusion+chromatography-based+thermostability+assay+for+membrane+protein+precrystallization+screening.">A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening.</a> Structure. 20 (8), 1293-1299 (2012).</li><li>Tate, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+seven+different+heterologous+protein+expression+systems+for+the+production+of+the+serotonin+transporter.">Comparison of seven different heterologous protein expression systems for the production of the serotonin transporter.</a> Biochim Biophys Acta. 1610 (1), 141-153 (2003).</li><li>Rigaud, J. L., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+membrane+proteins+into+liposomes.">Reconstitution of membrane proteins into liposomes.</a> Methods Enzymol. 372, 65-86 (2003).</li><li>Caffrey, M., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallizing+membrane+proteins+using+lipidic+mesophases.">Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases.</a> Nat Protoc. 4 (5), 706-731 (2009).</li><li>Faham, S., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bicelle+crystallization:+a+new+method+for+crystallizing+membrane+proteins+yields+a+monomeric+bacteriorhodopsin+structure.">Bicelle crystallization: a new method for crystallizing membrane proteins yields a monomeric bacteriorhodopsin structure.</a> J Mol Biol. 316 (1), 1-6 (2002).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Fastsettelse av membranproteinstruktur ved biofysiske teknikker fortsatt en skremmende oppgave for mange medisinsk betydelige transportører, reseptorer, og kanaler 11. Her deler vi detaljert kunnskap utviklet for strukturbestemmelse av den menneskelige serotonin transporter bundet til S -citalopram. Vi forventer at disse metodene vil være nyttig for å bestemme strukturer av Sert i andre konforme stater samt strukturer i andre vanskelige membran proteiner. Videre kan de biokjemiske teknikker som beskrives her også brukes til å studere funksjonen av renset SERT i vaskemiddel og en tilnærmet opprinnelig lipid miljø. Sert krystallisering hengslet på utviklingen av flere verktøy og teknikker. Først forbedringer i transporter termo produsert Sert varianter som var veloppdragne i ulike vaskemiddel miceller etter ekstraksjon av transporter fra membraner 6. For det andre, brukav høyaffinitets-ligand S -citalopram hele rensing og krystallisering ytterligere forbedret stabilitet og redusert conformational heterogenitet. For det tredje, utvikling av BacMam ekspresjonssystemet 7 åpnet for produksjon av store mengder SERT i en kort periode på 2 uker, fasiliterer både immunisering og krystallisering. Til slutt, til utvikling av strategier selektere for høy-affinitets antistoffer som gjenkjenner epitoper 3D tillatt for oppdagelsen av 8B6-antistoffet som fremmer velordnet pakking av SERT-antistoffkomplekser til krystaller. Det finnes en rekke kritiske trinn og reagenser, så vel som vanlige problemer som ofte forekommer i løpet av protokollen. For det første kan generering av høy titer SERT P2 virus være problematisk. Legge til lave konsentrasjoner av P1 virus å generere P2 virus som beskrevet i denne protokollen begrenser vanligvis dette problemet, og i tilfeller der P2 virustiter er lav, kan P3 virus gjøres using virus ved en MOI på 0,0001. Virus med en titer mindre enn 1 x 10 8 viruspartikler / ml bør ikke brukes, og vil nesten alltid resultere i lave utbytter protein. For uttrykk, HEK293S GnTI - celler ble valgt fordi de mangler N -acetylglucosaminyltransferase Jeg aktivitet og dermed kan ikke syntetisere komplekse N -glycans, i stedet produserer bare høy mannose N -glycans. EndoH kløyver N -bundne glykosylering av høye mannose glykaner på to steder i ekstracellulære sløyfe 2 (EL2), forlater en N -acetylglucosamine knyttet til asparagin. Fordøyelse av N -bundne sukker reduserer overflate entropien av EL2 som sannsynligvis viktig for krystallisering. For generering av antistoffer, må SERT IC bli brukt for immunisering. GFP er sterkt immunogent 12 og bør ikke brukes som en fusjon signal for å generere antistoffer, siden det er vanskelig å fjerne ved SEC. Den fleksible N- og C-terminalen av Sert var heller ikkesom inngår i konstruksjonen, for å unngå antistoffer mot disse regionene. Mus kan immuniseres med 30 ug rekonstituerte protein; fortsette immuniserer mus inntil høye serumkonsentrasjoner av antistoffer kan påvises og fremstille hybridomceller, som beskrevet 13. En thermostabilized konstruksjon er vanligvis det beste valget for immunisering; hvis transporter er veloppdragen og beholder biologisk aktivitet etter rensing, er dette ofte tilstrekkelig til å danne antistoffer. Den 8B6 antistoff ble reist mot WT Sert. For krystallisering, bør bare toppfraksjonene fra SEC som inneholder monodisperse komplisert som bedømmes av FSEC kombineres og konsentrert. Sert-8B6 krystaller vokser i et smalt spekter av tilstander, og det finnes en rekke tiltak som bør iverksettes for å feilsøke problemer spesielt knyttet til Sert krystallvekst. Tris-base justert med HCl bør ikke brukes i reservoaret løsning, da denne bufferen tillater ikke krystallvekst; det er derfor critiske til stedet bruke Tris justert med NaOH. SERT krystaller vokse i et smalt konsentrasjonsområde av PEG 400, slik at hvis krystaller ikke vokse eller hvis mange små krystaller viser seg, vil selv en liten økning eller minskning i PEG 400-konsentrasjonen være oppmerksom på. Videre kan additivet 6-aminoheksansyre ble også brukt i den optimerte skjermen for å forbedre kjernedannelse. Dråpen Forholdet mellom protein: vel løsningen er også en viktig avgjørende faktor for krystallvekst. Drop forholdstall på 1,5 til 2: 1 er anbefalt, med drop forholdstall nærmere 2: en typisk støtte veksten av større tre-dimensjonale krystaller. Endelig er bruken av lav profil 24-brønners plater også avgjørende mot krystallvekst, sannsynligvis på grunn av endring av hastigheten av dampdiffusjon. En alternativ tilnærming til SPA-metoden har blitt utviklet for å skjerm for mutanter som stabiliserer rotte serotonintransportøren i en kokain-bundet konformasjon ved bruk av filterbindingsbestemmelse 5. I motsetning SPA-based-analyse gjør det mulig for sekvensielle oppvarmingstrinn etter ved bestemmelse av den fraksjon av SERT som forblir bundet til ligand. Således gir mulighet for den raske bestemmelse av smeltetemperaturen fra et lite antall prøver. SPA-metoden er avhengig av tilgjengeligheten av en radiomerket ligand med høy affinitet og hvis ingen ligander er kjent som binder med submicromolar affinitet deretter en annen løsning vil være nødvendig. Mange andre fremgangsmåter blir ofte brukt til å måle proteinstabilitet, for eksempel binding av fluorescerende fargestoffer og kalorimetri 14 men er lav gjennomstrømming og er enten ikke i stand til direkte å måle funksjon eller kreve store mengder protein. Hvis ikke kan anvendes SPA-metoden, er en alternativ high-throughput tilnærming en FSEC-baserte termostabilitet Assay 15 (FSEC-TS), hvor prøven blir oppvarmet etterfulgt av separering av den fraksjon av gjenværende transporter. FSEC-TS er en nyttig tilnærming for å få tilgang kromatografisk oppførsel og oligomere staten og er apowerful komplementærverktøy som kan brukes sammen med SPA-metoden. En sammenligning av ulike felles protein uttrykk systemer ble også funnet å favorisere bruk av pattedyrceller for Sert uttrykk 16 og rask dette er trolig tilfelle for mange proteiner av opphav hos pattedyr. Metodene som vi har brukt for uttrykket er skreddersydd for Sert men sannsynligvis lett tilpasses. Betingelser som favoriserer høye nivåer av ekspresjon bør være nøye identifiseres ved å variere tidspunktet for ekspresjon, temperatur, viruskonsentrasjon, og nærværet av histondeacetylase inhibitorer slik som natriumbutyrat. Vi vanligvis favorisere affinitetsrensing i en mild langkjedet vaskemiddel som C12M sammen med CHS før rekonstituering for å beholde høy affinitet ligandbinding. Rekonstituering ved hjelp av hydrofob absorpsjon er en mild teknikk som vi har funnet å være effektive for flere andre transportører og reseptorer. Hvis detteer ikke vellykket, fjerning av vaskemidler med høye kritiske micelle konsentrasjon av dialyse, fortynning, eller SEC kan være ansatt 17 forutsatt at antigenet er tilstrekkelig stabilt i slike vaskemidler. I tilfeller der det ikke egnede antistoffer er funnet, vi nesten alltid finne problemet skyldes tap av funksjon eller denaturering av antigen og i slike tilfeller vi vellykket utført nye vaksinasjoner betalende spesiell oppmerksomhet til protein biokjemi. Til slutt bør ligander og antistoffer som binder med høy affinitet danne grunnlag for et rasjonelt planlagt krystallisering eksperiment og ved å ta fordel av en termostabil variant, kan man screene et bredere spekter av tilstander ved å variere egenskapene til forskjellige vaskemidler. Videre krystallisering i et lipid mesofase 18 eller ved hjelp av bicelles 19 bør alltid betraktes som et alternativ til krystallisering i miceller. Disse prinsippene og metoder kan brukes med noen modifikation for mange andre transmembranproteiner som er vanskelig å uttrykke og rense fra andre ekspresjonsverter, og vil være spesielt nyttig for strukturbestemmelse av mål med høy affinitet legemidler.

Den serotonin transporter (Sert) er en integrert membranprotein som forenkler transport av serotonin over mobilnettet membraner 1. Sert tilhører en familie av Nevrotransmitter Sodium Symporters (NIH) som også omfatter dopamin og noradrenalin transportører 2. Sert er den molekylære målet for vidt foreskrevet antidepressiva og angstdempende medikamenter som virker å kompetitivt hemme serotonin transport tre. Sert utnytter energisk gunstig cotransport av natrium for å fjerne nevrotransmitter fra den synaptiske spalten. Omfattende karakterisering av serotonerge systemet har vist at endringer i serotonin metabolisme synes å påvirke nesten alle nevrologiske prosesser, inkludert humør, søvn, smerte, kognisjon og aggresjon atferd fire. Sert funksjonen kan endres gjennom bruk av antidepressiva og selektive serotoninreopptakshemmere (SSRI) som S -citalopram, samt av psychostimulants og vanedannende legemidler som amfetamin og 3,4-metylendioksy- N -methylamphetamine eller &quot;ecstasy&quot; 1,2. SSRI er uhyre viktig for behandlingen av stemningslidelser, men den eksakte strukturelle basis for deres virkning er ikke godt forstått. WT Sert er ustabil i vaskemiddel miceller, og dermed hindrer utvikling mot en tredimensjonal (3D) struktur av Sert 5,6. Nylig har vi utviklet varianter av SERT som er robust stabile i et bredt spekter av vaskemidler og bibeholder SSRI bindingsaktivitet 6. Disse termostabile Sert varianter ble valgt ved hjelp av en scintillation nærhet basert termo analysen. Her beskriver vi en prosedyre for generering av høy affinitet antistoffer som kan binde Sert, og rensing og krystallisering av termostabile Sert, i kompleks med antistoff og S -citalopram. Denne protokollen forutsetter at Sert og 8B6 gener har vært vellykkety klonet i BacMam 7 og insekt ekspresjonsvektorer, respektivt. For å generere antistoffer, ble cDNA som koder for residuer 73-616 av WT SERT klonet inn i vektoren BacMam med en C-terminal Strep-tag II (Sert IC). For termo skjermen, ble Sert rester 73-616 med C-terminal GFP, Strep II, og 10-Hans tags (Sert TC) som brukes. Individuelle punktmutasjoner ble generert i Sert TC bakgrunnen. For krystallisering protokollen ble Sert-GFP fusjonsprotein brukes med Twin-strep [TrpSerHisProGlnPheGluLys (GlyGlyGlySer) 2 GlyGlySerAlaTrpSerHisProGlnPheGluLys] og 10-Hans tags, bærer de termo mutanter, Y110A, I291A, og T439S og mutasjoner av overflate cysteiner C554A, C580A og C622A (Sert CC). Trombinspaltning sekvenser (LVPRGS) ble også satt inn i den SERT CC etter Q76 og T618 for å tillate fjerning av N- og C-termini. Plasmidet koder for 8B6 Fab ble konstruert for å uttrykke både de tunge og lettekjeder av antistoffet med GP67 sekresjons-sekvenser under kontroll av to atskilte promotorer polyhedrin. Den C-terminale enden av den tunge kjeden av 8B6-antistoff ble merket med en 8-His-tag og en trombin-spaltningssete ble satt inn mellom den tunge kjede og den koden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="760">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:372px;">DH10Bac</td>
			<td style="width:179px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:109px;">10361-012</td>
			<td style="width:101px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Kanamycin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP906-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gentamicin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP918-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tetracycline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-7660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bluo-gal</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15519-028</td>
			<td>5-Bromo-3-indolyl &#946;-D-galactopyranoside</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">IPTG</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>I1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Miniprep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cellfectin II</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10362-100</td>
			<td>Sf9 transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SF9</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sf-900 III SFM media</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12658-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEK-293S GnTI-</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Freestyle 293 media</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12338-018</td>
			<td>293 expression media</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>0984018DJ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium butyrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>303410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">S-citalopram</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4786</td>
			<td>Anagrade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">n-Dodecyl-?-D-Maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cholesteryl hemmisuccinate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850457P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850757P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840457P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Leupeptin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pepstatin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Aprotinin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PMSF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Desthiobiotin</td>
			<td>Iba Life Sciences</td>
			<td>2-1000-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Asolectin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cholesterol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lipid A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L5399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Brain polar lipid</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>141101C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Biobeads</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>152-3920</td>
			<td>Hydrophobic absorption resin</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Goat anti-mouse IRDye 680RD</td>
			<td>Odyssey</td>
			<td>926-68070</td>
			<td>Used as secondary for western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lauryl maltose neopentyl glycol</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>NG310</td>
			<td>Anagrade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Serotonin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pFastBac 8B6</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a name="RANGE!D35">Available from authors</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pEG Bacmam SERT Strep II</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>SERTIC, Available from authors</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pEG Bacmam SERT GFP twin Strep His</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>SERTTC, Available from authors</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pEG Bacmam SERT ts3 GFP twin Strep His</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>SERTCC, Available from authors</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imidazole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>56749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">n-Octyl &#946;-D-maltoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>O310</td>
			<td>Anagrade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Thrombin</td>
			<td>Haematologic Technologies</td>
			<td>HCT-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EndoH</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P0702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trizma-HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5941</td>
			<td>Tris used for preparation of crystallization reservoirs</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PEG 400</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>91893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">6-aminohexanoic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>MT25052CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isoplate-96 TC</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>6005070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PolyJet</td>
			<td>SignaGen</td>
			<td>SL100688</td>
			<td>Polymer transfection reagent for mamalian cells</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Copper HIS-Tag YSI SPA Beads</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>RPNQ0096</td>
			<td>His-tag affinity SPA beads</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Citalopram, [N-Methyl-3H]</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NET1039250UC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ThermoMixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000023</td>
			<td>heating block for thermostability assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ThermoTop</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5308000003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SmartBlock PCR 96, thermoblock for PCR plates</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5306000006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.2 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>25-243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1 L filter system</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2 L flat bottom tissue culture flask</td>
			<td>Genemate</td>
			<td>F-5909-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2 L baffled tissue culture flask</td>
			<td>Genemate</td>
			<td>F-5909-2000B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Forma Orbital Shaker</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Strep-Tactin resin</td>
			<td>Iba Life Sciences</td>
			<td>2-1208-025</td>
			<td>Strep affinity resin</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Extruder</td>
			<td>Northern Lipids</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Li-Cor imaging system</td>
			<td>Odyssey</td>
			<td></td>
			<td>western blot imaging system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">XK16 column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9889-37</td>
			<td>column used for Strep-Tactin and Talon purificaiton</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">100 kDa MWCO protein concentrator</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC910096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">30 kDa MWCO protein concentrator</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC903024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#196;kta FPLC</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>UPC-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HPLC</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>51476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Superose 6 (10/300) column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-5172-01</td>
			<td>Used for FSEC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tangential flow apparatus</td>
			<td>Pall Filtron</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.2 &#181;m filter tangential flow cell</td>
			<td>Pall Filtron</td>
			<td>PSM20C11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">30 kDa MWCO tangential flow concentrator</td>
			<td>Pall Filtron</td>
			<td>OS030T12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Talon resin</td>
			<td>Clonetech</td>
			<td>635504</td>
			<td>His-tag affinity resin used for Fab purification</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1 ml HiTrap SP column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17115101</td>
			<td>Cation exchanger used for Fab purification</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Superdex 200 10/300 GL column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-5175-01</td>
			<td>Used for SEC separation of SERT-8B6</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">24-well VDXm plate</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">18 mm coverslips</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-239</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Virocyt virus counter</td>
			<td>Virocyt</td>
			<td>2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MicroBeta Trilux</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>1450</td>
			<td>96-well scintillation counter</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HiTrap SP column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17115101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sertraline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6319</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

thermostabilization, expression, purification, and crystallization of the human serotonin transporter bound to s-citalopram

Serotonintransportøren er en natrium og klorid-coupled transporter som &quot;pumper&quot; ekstracellulært serotonin inn i celler. S -citalopram er et stoff som brukes til å behandle depresjon og angst ved binding til serotonin transporter med høy affinitet, blokkerer serotonin reuptake. Her rapporterer vi en effektiv prosedyre og et sett med verktøy for å stabilisere, uttrykke, renser, og krystalliserer serotonin transporter-antistoffkomplekser bundet til S -citalopram og andre antidepressiva. Mutasjoner som stabiliserer serotonintransportøren ble identifisert ved hjelp av en S -citalopram bindingsbestemmelse. Serotonin transporter uttrykt i baculovirus-omsatte HEK293S GnTI - celler, ble rekonstruert i proteoliposomes og brukes til å heve høy affinitet antistoffer. Vi har utviklet en strategi for å oppdage antistoffer som er nyttige for strukturstudier. En grei tilnærming for uttrykket av antistoff-fragmenter i Sf9 celler er også etablert.Transporter-antistoffkomplekser renset ved hjelp av denne prosedyren er veloppdragen og lett krystalliserer, produsere komplekser med S -citalopram at diffract røntgen til 3-4 en løsning. Strategiene utvikles her kan anvendes for å bestemme strukturen til andre utfordrende membranproteiner.

Et bibliotek av enkle punkt mutanter i Sert TC bakgrunn ble opprettet for å skjerm for thermostabilizing mutasjoner. Individuelle mutanter ble generert ved hjelp av standard mutagenese. Screeningen protokoll benytter transient transfektert HEK293S celler og en scintillasjons nærhet basert termostabilitet skjermen for å hurtig identitet nyttige mutasjoner for krystallisering som skissert i figur 1A. Plotting Tm-verdier versus bundne [3H] citalopram ved RT avdekker konstruksjoner med høy termostabilitet og ekspresjonsnivåer egnede for proteinrensing (figur 1B). Tre mutanter (Y110A, I291A, og T439S) ble kombinert for å generere en meget stabil konstruksjon (figur 1C). Termostabilitet er også korrelert med økt stabilitet i kortkjedede vaskemidler som er nødvendig for krystallisering av SERT-Fab-komplekset. Det store omfanget uttrykk for menneskelig Sert hjelp baculovirus-transduced HEK293S GnTI - celler kan ta mindre enn 2 uker, og kan produsere milligram-mengder, som vist i figur 2A. Bruk av GFP-merket Sert CC protein gjør Sert å være beleilig følges under uttrykk og rensing av fluorescens (figur 2B). Vår strategi involvert rensning 1) oppløsning av SERT bundet til S -citalopram fra HEK293S GnTI - celler i C12M i nærvær av CHS som en stabiliserende lipid; 2) binding av Sert til en streptokokk affinitet matrise; 3) fjerning av forurensende proteiner etter omfattende vask; og 4) eluering av det funksjonelle SERT med buffer inneholdende desthiobiotin (figur 2C). Det eluerte proteinet er stort sett fritt for andre påvisbare proteiner ved Coomassie blå farging og monodisperse som bedømt ved FSEC (figur 2D, E). En liknende strategi ble tatt for å rense SERT med en streptokokk II-kode som ble brukt til reconstitution og immunisering (figur 3A, B). Inkorporering av SERT inn proteoliposomes øker halveringstiden i serum og stabilitet av SERT og forbedrer sannsynligheten for isolering av antistoffer med høy affinitet. Videre inkludering av lipid A, en bestanddel av bakteriecelleveggen, tjener som en potent adjuvans 9. Multilamellære liposomer ble fremstilt ved tilsetning av buffer til en tørkede lipidblandingen i glassrør og slemmet opp igjen i buffer. Ekstrudering av liposomene gjennom 200 nm porestørrelse filter frembringer monodisperse unilamellære liposomale suspensjoner. Liposomene blir så mettet med rengjøringsmiddel etterfulgt av tilsetning av renset Sert i vaskemiddel. Til slutt blir vaskemiddel fjernes ved tilsetning av hydrofobe absorpsjonsharpiks til lipid: blanding vaskemiddel. Ytterligere ligand bør tilsettes til den rekonstituerte prøve for å velge antistoffer som gjenkjenner det antidepressive bundet konformasjon. Tilstedeværelsen av Sert i proteoliposomes bør bekreftes avoppløsende en liten prøve med SDS-PAGE lasting fargestoff eller C12M og kjører på SDS-PAGE og FSEC (figur 3C, D). Hybridom-cellelinjer som uttrykker SERT antistoffer kan screenes for høyaffinitets-bindemidler som gjenkjenner 3D-epitoper. Disse egenskapene er avgjørende for eventuell suksess for krystallisering, som antistoffet må forbli fast bundet til en strukturert regionen for å fremme krystall pakking av homogene, velordnet domener. I det første trinnet, blir antistoffer som gjenkjenner ustrukturerte regioner identifisert. Sert er denaturert og blottet på en nitrocellulosemembran; antistoffer som binder denaturert Sert vil være western-positive og sannsynlig gjenkjenne lineære epitoper. I figur 4A, viser vi 2 eksempler på antistoffer som er western-positive og sannsynligvis ikke nyttig å fremme crystallogenesis. I figur 4B, blir de gjenværende western-negative antistoffer inkubert med 100 nM SERT-GFP og separert vedFSEC. Antistoffer som binder Sert vil skifte GFP-positive topp til en tidligere stilling. De Sert-antistoffkomplekser kan fortynnes videre i vaskemiddel for å finne ut om de kan binde seg med nanomolar affinitet etterfulgt av analyse av FSEC. Tilsetning av serotonin fører til konformasjonsendringer i transportøren og dermed antistoffene kan bli screenet på nytt for å bestemme om de kan spesifikt gjenkjenne SSRI-bundet konformasjon. I figur 4C, blir antistoffene vist å binde SERT i nærvær av serotonin, som viser at epitopen (e) ikke endrer fra SSRI til underlaget bundet tilstand. Til slutt, i figur 4D kombinasjoner av antistoffer testet for deres evne til å binde distinkte epitoper, noe som resulterer i en ytterligere bevegelse mot venstre. Her 15B8 eller 8A11 antistoffene gjenkjenner en epitop som er forskjellig fra 8B6. Den 8B6 antistoff ble valgt for videre strukturell analyse basert på foreløpige krystall screening med papain treated Fab. Genene av 8B6 Fab ble klonet inn i et insektcelle ekspresjonsvektor. Fab kan bli uttrykt og utskilt fra Sf9-celler som vokser i suspensjon. Den 8B6 Fab kan bli renset fra Sf9 celle supernatanten ved His-tag affinitet (figur 5A, B) og kationebytter-kromatografi (figur 5C, D) som resulterer i protein som synes fri for forurensninger på SDS-PAGE-geler. I figur 5E, blir det rekombinante 8B6 Fab vist å binde SERT og anvendes i de følgende biokjemiske og biofysiske eksperimenter. Den affinitetsrenset SERT CC blir spaltet med trombin og EndoH og blandet med 8B6 Fab for å danne et kompleks i nærvær av S -citalopram. Transportøren-antistoff-komplekset ble deretter separert ved SEC i C8M (figur 6A), og toppfraksjonene inneholder både SERT og Fab, som vist ved SDS-PAGE (figur 6B). Bruk av C8M er avgjørende for krystalldannelse sannsynligvis fordikort kjede vaskemiddel gir bedre pakking mellom molekyler i krystallgitteret. FSEC anvendes for å bestemme hvilke fraksjoner som skulle være felles for krystalliseringen (figur 6C); Fraksjonene som ikke er monodisperse og / eller inneholder store mengder fri SERT eller Fab bør ikke kombineres. Prismeformede Sert-antistoff krystaller kan dyrkes i nærvær av S -citalopram bruke denne protokollen ved henging slipp damp diffusjon (figur 7A). De resulterende krystaller diffract X-stråler til en oppløsning av 3,15 Å 10 (figur 7B). <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/54792/54792fig1.jpg" /> Figur 1: Scintillation Proximity Assay-baserte termostabiliteten A.. Oversikt over protokoll for screening termostabilitet i nærvær av [3H] citalopram. B. Maksimal bundet [3 </sup&gt; H] citalopram versus tydelig smeltetemperaturen (Tm). Stiplede linjene representerer verdier for WT transporter. De 3 mest termostabile mutanter er merket. Grey området representerer mutanter som har mindre enn 10% av [3H] citalopram-binding i forhold til WT og således unøyaktige Tm-verdier på grunn av et lavt signal-til-støy. C. Termo kurver for WT Sert TC og de 3 beste mutanter. Feilfelt representerer standardavvik (SD). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54792/54792fig2.jpg" /> Figur 2: Oversikt over Pattedyr heterologe Protein Expression A.. Skjematisert oversikt over BacMam virus generasjon og uttrykk for Sert i HEK293S GnTI -. Celler B. HANK293S GnTI - celler som uttrykker Sert CC (GFP fluorescens) C.. Elueringsprofilen Sert CC på Strep affinitet harpiks. Grønne kurven representerer konsentrasjonen av desthiobiotin, 0 - 100% (0-5 mm) D.. Analyse av affinitetsrenset Sert CC på en 4-15% SDS-PAGE gel E.. FSEC av affinitetsrenset Sert CC oppdaget av GFP fluorescens (Eksitasjon: 480 nm; Emisjon: 510 nm). Toppen eluere på 15 ml er Sert (#) og 18 ml er gratis GFP (*). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54792/54792fig3.jpg" /> Figur 3: Representant Affinity Rensing og Tilberedning av Sert IC A.. Skjematisk oversikt av antistoffgenerering. &lt;strong&gt; B. Elueringsprofil observert ved 280 nm av affinitetsrensing av SERT IC på Strep affinitet harpiks. Grønne kurven representerer konsentrasjonen av desthiobiotin, 0 - 100%. (Til 0 - 5 mM) C. Analyse av affinitet renset og rekonstituert Sert på en 4-15% SDS-PAGE gel D.. FSEC av oppløste Sert etter rekonstituering. Fluorescens av tryptofan rester ble brukt til å oppdage Sert (Eksitasjon: 280 nm; Emisjon: 335 nm). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/54792/54792fig4.jpg" /> Figur 4:. Analyse av Representative Sert Antistoffer A. Screening av antistoffer ved Western blot. Omtrent 1 pg SERT CC med eller uten GFP ble applisert på en 4 - 15% SDS-PAGE-gel og blottet på en nitrocellulosemembran. Binding ble påvist ved anvendelse av et geite-anti-mus-antistoff konjugert til IR Dye. 2G4 og 10F2 er vestlige positive. B. Binding av antistoffer til 100 nM GFP-merket Sert og deteksjon av FSEC oppdages ved hjelp av GFP fluorescens. C. Binding av utvalgte Fab-fragmenter til 100 nM GFP-merket SERT i nærvær av 1 mM serotonin. D. Binding av 8A11 eller 15B8 Fabs til Sert-8B6 Fab. Mindre elueringstoppene på 18 ml er gratis GFP. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/54792/54792fig5.jpg" /> Figur 5: Representative Rensning av 8B6 Fab fra Sf9-celler A.. Elueringsprofil observert ved 280 nm for rensing av 8B6 Fab ved His-tag affinitet Chromatogr<html> hy. Grønne kurven representerer konsentrasjonen av imidazol, 0-50% (0-250 mM) B.. Ikke-reduserende og redusere SDS-PAGE gel etter His-tag affinitet rensing. Protein som går nær 50 kDa kan ikke redusert Fab (#) og mindre arter på 25 kDa er redusert Fab (*). C. Elueringsprofil observert ved 280 nm for rensing av 8B6 Fab med kationerbytte å vise en enkelt symmetrisk topp som eluerer under en lineær gradient natriumklorid. Grønne kurven representerer konsentrasjonen av NaCl, 0 - 100%. (0-500 mM) D. Analyse av 8B6 Fab på en 12,5% SDS-PAGE-gel etter rensing ved kationbytting. E. Binding av 8B6 Fab til 10 nM GFP-merket Sert, oppdaget ved hjelp av fluorescens fra GFP. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig5large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> e 6 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 54792 / 54792fig6.jpg &quot;/&gt; Figur 6: Representant Gelfiltreringskromatografi av Sert-8B6 Complex i nærvær av S -citalopram A.. Gelfiltrering elueringsprofilen renset SERT-8B6-komplekset. Hoved topp eluere på 11,5 ml er Sert-8B6 kompleks. Topp på 15-17 ml inneholder GFP og Fab B.. Analyse av det rensede SERT-8B6-komplekset på en 4 - 15% SDS-PAGE-gel. Posisjonene til SERT og de tunge og lette kjeder av Fab-er vist med en strek. C. FSEC av størrelsesseparert fraksjoner. Sert-8B6 komplekser ble oppdaget ved hjelp av tryptofan fluorescens. Fraksjon 17 inneholder en større mengde Sert som ikke kompleks med Fab. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig6large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Figur 7"src = &quot;/ files / ftp_upload / 54792 / 54792fig7.jpg&quot; /&gt; Figur 7: Krystallisasjon av SERT-8B6-komplekset bundet til S -citalopram A.. Lysmikroskopi av parallellepiped formede krystaller av Sert-8B6 kompleks etter 2 uker med vekst. Scale bar tilsvarer 200 mikrometer. B. Sert-8B6 krystaller diffract røntgen for å 3,15 Å. Blå ring representerer 3,15 Å. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig7large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> Tabell 1:. En Krystallisering Screen for Sert-8B6 Complex Bundet til S -citalopram <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792table1.xlsx">Klikk her for å laste ned denne tabellen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram at JoVE.com

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Dette manuskriptet beskriver hvordan å screene for thermostabilizing mutasjoner, rense den menneskelige serotonin transporter, generere høy affinitet antistoffer, og krystallisere serotonin transporter-antistoff kompleks bundet til antidepressive medikament S -citalopram. Denne protokollen kan tilpasses til studiet av andre utfordrende membran transportører, reseptorer og kanaler.

Thermostabilization, Expression, Rensing, og Krystallisering av Human Serotonin Transporter Bound til<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

Ekspresjon, rensing og antimikrobiell aktivitet av S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

Rekombinant Proteinuttrykk, Krystallisering og Biofysiske Studier av a<em&gt; Bacillus</em&gt; -konserverte nukleotidpyrofosforylase, BcMazG

To overcome safety restrictions and regulations when studying genes and proteins from true pathogens, their homologues can be studied. Bacillus anthracis ...

A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/&#945;

A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±

En Guide til produksjon, krystallisering og proteinstrukturer av menneskelig IKK1/α

A class of extracellular stimuli requires activation of IKK1/&#945; to induce generation of an NF-&#954;B subunit, p52, through processing of its ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

Uttrykk og rensing av pattedyr Bestrophin Ion kanaler

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Uttrykk og rensing av menneskelige Lipid-sensitive kasjon kanal-TRPC3 for strukturelle vilje av Single-partikkel Cryo-elektronmikroskop

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

Uttrykk, Solubilization og rensing av eukaryote Borate transportører

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...

Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

Uttrykk og rensing av Nuklease-gratis Oxygen renovasjons Protocatechuate 3, 4-Dioxygenase

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Uttrykk, rensing, krystallisering, og enzym analyser av Fumarylacetoacetate Hydrolase domene-inneholdende proteiner

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

PCR Mutagenesis, Cloning, Expression, Fast Protein Purification Protocols and Crystallization of the Wild Type and Mutant Forms of Tryptophan Synthase

PCR Mutagenesis, Kloning, Uttrykk, Rask Protein Rensing Protokoller og Krystallisering av Wild Type og Mutant Former for Tryptophan Synthase

Structural studies with tryptophan synthase (TS) bienzyme complex (&#945;2&#946;2 TS) from Salmonella typhimurium have been performed to better understand ...

Bacterial Expression and Purification of Human Matrix Metalloproteinase-3 using Affinity Chromatography

Bakteriell uttrykk og rensing av human matrise Metalloproteinase-3 ved hjelp av affinitet kromatografi

Matrix metalloproteinases (MMPs) belong to the family of metzincin proteases with central roles in extracellular matrix (ECM) degradation and remodeling, ...