Name: thermostabilization, expression, purification, and crystallization of the human serotonin transporter bound to s-citalopram
Uploaded: 2016-11-27T15:00:00
Duration: 12 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram at JoVE.com

We thank D. Cawley for generating monoclonal antibodies. We thank A. Penmatsa and K. Wang for sharing ideas and expertise developed from the dopamine transporter. L. Vaskalis for assistance with figures, H. Owen for help with manuscript preparation and other Gouaux laboratory members for helpful discussions. J.A.C. has support from a Banting postdoctoral fellowship from the Canadian Institutes of Health Research. E.M.G. is supported by the National Science Foundation Graduate Research Fellowship. We are particularly grateful to Bernie and Jennifer LaCroute for their generous support, as well as for funding from the NIH (5R37MH070039). E.G. is an investigator of the Howard Hughes Medical Institute.

<ol>
	<li>Kristensen, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLC6+neurotransmitter+transporters:+structure,+function,+and+regulation.">SLC6 neurotransmitter transporters: structure, function, and regulation.</a> Pharmacol Rev. 63 (3), 585-640 (2011).</li><li>Broer, S., Gether, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+solute+carrier+6+family+of+transporters.">The solute carrier 6 family of transporters.</a> Br J Pharmacol. 167 (2), 256-278 (2012).</li><li>Andersen, J., Kristensen, A. S., Bang-Andersen, B., Stromgaard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+understanding+of+the+interaction+of+antidepressant+drugs+with+serotonin+and+norepinephrine+transporters.">Recent advances in the understanding of the interaction of antidepressant drugs with serotonin and norepinephrine transporters.</a> Chem Commun (Camb). 25 (25), 3677-3692 (2009).</li><li>Hahn, M. K., Blakely, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+impact+of+SLC6+transporter+genetic+variation.">The functional impact of SLC6 transporter genetic variation.</a> Annu Rev Pharmacol Toxicol. 47, 401-441 (2007).</li><li>Abdul-Hussein, S., Andrell, J., Tate, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermostabilisation+of+the+serotonin+transporter+in+a+cocaine-bound+conformation.">Thermostabilisation of the serotonin transporter in a cocaine-bound conformation.</a> J Mol Biol. 425 (12), 2198-2207 (2013).</li><li>Green, E. M., Coleman, J. A., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermostabilization+of+the+human+serotonin+transporter+in+an+antidepressant-Bound+Conformation.">Thermostabilization of the human serotonin transporter in an antidepressant-Bound Conformation.</a> Plos One. 10 (12), e0145688 (2015).</li><li>Goehring, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+and+large-scale+expression+of+membrane+proteins+in+mammalian+cells+for+structural+studies.">Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies.</a> Nat Protoc. 9 (11), 2574-2585 (2014).</li><li>Kawate, T., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-detection+size-exclusion+chromatography+for+precrystallization+screening+of+integral+membrane+proteins.">Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins.</a> Structure. 14 (4), 673-681 (2006).</li><li>De Becker, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adjuvant+monophosphoryl+lipid+A+increases+the+function+of+antigen-presenting+cells.">The adjuvant monophosphoryl lipid A increases the function of antigen-presenting cells.</a> Int Immunol. 12 (6), 807-815 (2000).</li><li>Coleman, J. A., Green, E. M., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+structures+and+mechanism+of+the+human+serotonin+transporter.">X-ray structures and mechanism of the human serotonin transporter.</a> Nature. , (2016).</li><li>White, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+progress+of+membrane+protein+structure+determination.">The progress of membrane protein structure determination.</a> Protein Sci. 13 (7), 1948-1949 (2004).</li><li>Gambotto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenicity+of+enhanced+green+fluorescent+protein+(EGFP)+in+BALB/c+mice:+identification+of+an+H2-Kd-restricted+CTL+epitope.">Immunogenicity of enhanced green fluorescent protein (EGFP) in BALB/c mice: identification of an H2-Kd-restricted CTL epitope.</a> Gene Ther. 7 (23), 2036-2040 (2000).</li><li>Galfre, G., Howe, S. C., Milstein, C., Butcher, G. W., Howard, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+major+histocompatibility+antigens+produced+by+hybrid+cell+lines.">Antibodies to major histocompatibility antigens produced by hybrid cell lines.</a> Nature. 266 (5602), 550-552 (1977).</li><li>Deller, M. C., Kong, L., Rupp, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+stability:+a+crystallographer's+perspective.">Protein stability: a crystallographer's perspective.</a> Acta Crystallogr F Struct Biol Commun. 72, 72-95 (2016).</li><li>Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescence-detection+size-exclusion+chromatography-based+thermostability+assay+for+membrane+protein+precrystallization+screening.">A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening.</a> Structure. 20 (8), 1293-1299 (2012).</li><li>Tate, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+seven+different+heterologous+protein+expression+systems+for+the+production+of+the+serotonin+transporter.">Comparison of seven different heterologous protein expression systems for the production of the serotonin transporter.</a> Biochim Biophys Acta. 1610 (1), 141-153 (2003).</li><li>Rigaud, J. L., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+membrane+proteins+into+liposomes.">Reconstitution of membrane proteins into liposomes.</a> Methods Enzymol. 372, 65-86 (2003).</li><li>Caffrey, M., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallizing+membrane+proteins+using+lipidic+mesophases.">Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases.</a> Nat Protoc. 4 (5), 706-731 (2009).</li><li>Faham, S., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bicelle+crystallization:+a+new+method+for+crystallizing+membrane+proteins+yields+a+monomeric+bacteriorhodopsin+structure.">Bicelle crystallization: a new method for crystallizing membrane proteins yields a monomeric bacteriorhodopsin structure.</a> J Mol Biol. 316 (1), 1-6 (2002).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Bestämning av membranproteinstruktur genom biofysiska tekniker fortfarande en skrämmande företag för många medicinskt viktiga transportörer, receptorer, och kanaler 11. Här delar vi detaljerad kunskap som utvecklats för strukturbestämning av den mänskliga serotonintransportören bunden till S -citalopram. Vi räknar med att dessa metoder kommer att vara användbart för att bestämma strukturer av Sert i andra konformationstillstånd samt strukturer för andra svåra membranproteiner. Vidare kan de biokemiska metoder som beskrivs här också användas för att studera funktionen av renat SERT i diskmedel och en nästan infödda lipid miljö. SERT kristallise gångjärn på utvecklingen av flera verktyg och tekniker. Först, förbättringar i transportören termo producerade sert varianter som hjälpsökande i olika detergentmiceller efter extraktion av transportören från membranen 6. För det andra, användningenav high-affinitetsligand S -citalopram hela rening och kristallisation ytterligare förbättrad stabilitet och minskad konforma heterogenitet. Tredje, utveckling av BacMam expressionssystemet 7 tillåtna för produktion av stora mängder av SERT i en kort period av 2 veckor, vilket underlättar både immunisering och kristallisation. Slutligen, för utvecklingen av strategier för att välja för hög affinitet antikroppar som känner igen 3D-epitoper tillåts för upptäckten av 8B6 antikropp som främjar välordnad förpackning av sert-antikroppskomplex i kristaller. Det finns ett antal kritiska steg och reagens samt vanliga problem som ofta förekommer i hela protokollet. För det första kan alstringen av hög titer SERT P2-virus vara problematisk. Lägga låga koncentrationer av P1-virus för att generera P2 virus som beskrivs i detta protokoll minskar vanligtvis detta problem, och i de fall där P2 virus titer är låg, kan P3 virus göras using-virus vid en MOI av 0,0001. Virus med en titer mindre än 1 x 10 8 viruspartiklar / ml bör inte användas och kommer nästan alltid att resultera i låga proteinutbyten. För expression, HEK293S GnTI - celler valdes eftersom de saknar N -acetylglucosaminyltransferase I-aktivitet och kan därför inte syntetisera komplexa N-glykaner, istället producerar endast hög mannos N-glykaner. EndoH klyver N-kopplad glykosylering av hög mannos glykaner på två platser i extracellulära slingan 2 (EL2), vilket ger en N -acetylglucosamine fäst vid asparagin. Nedbrytning av N-kopplade socker minskar ytan entropi EL2 som sannolikt viktigt för kristallisation. För genereringen av antikroppar, bör den SERT IC användas för immunisering. GFP är höggradigt immunogent 12 och bör inte användas som ett fusions tagg för att generera antikroppar eftersom det är svårt att helt ta bort genom SEC. Den flexibla N- och C-terminalen av SERT var också inteingår i konstruktionen i syfte att undvika antikroppar mot dessa regioner. Möss kan immuniseras med 30 mikrogram färdigberedd protein; fortsätta immunisering av möss tills höga serumkoncentrationer av antikroppar kan detekteras och producera hybridomceller som beskrivits 13. En thermostabilized konstruktion är oftast det bästa valet för immunisering; om transportören är uppfört sig väl och bibehåller biologisk aktivitet efter rening, är detta ofta tillräckligt för att framkalla antikroppar. Den 8B6 antikropp höjdes mot WT SERT. För kristallisation, bör endast de toppfraktionerna från SEC innehållande monodispersa komplex som bedöms av FSEC kombineras och koncentreras. SERT-8B6 kristaller växa i ett snävt intervall av villkor och det finns ett antal steg som bör vidtas för att felsöka problem specifikt relaterade till SERT kristalltillväxt. Tris-bas justerades med HCl bör inte användas i reservoarlösningen, eftersom denna buffert inte stöder kristalltillväxt; är det således critisk att istället använda Tris justerad med NaOH. SERT kristaller växa i ett smalt koncentrationsintervall av PEG 400, så om kristaller inte växer eller om många små kristaller observeras, skulle även en liten ökning eller minskning i PEG 400 koncentrationen rådas. Vidare har tillsatsen 6-aminohexansyra används också i den optimerade skärmen för att förbättra kärnbildning. Nedgången förhållandet protein: väl lösningen är också en avgörande faktor för kristalltillväxt. Drop-förhållanden på 1,5 - 2: 1 rekommenderas, med drop-förhållanden närmare 2: 1 typiskt stödja tillväxten av större 3-dimensionella kristaller. Slutligen är också avgörande mot kristalltillväxt användningen av lågprofil 24-brunnars plattor, förmodligen beroende på modifiering av hastigheten för ångdiffusion. Ett alternativt tillvägagångssätt till SPA metoden har utvecklats för att skärmen för mutanter som stabiliserar råtta serotonintransportören i en kokain bunden konforma med hjälp av en filterbindningsanalys 5. Däremot SPA baSED analysen möjliggör sekventiella upphettningssteg följt av bestämning av den fraktion av Sert som är bundet till ligand. Således tillåter detta för snabb bestämning av smälttemperaturen från ett litet antal prover. SPA metod förlitar sig på tillgängligheten av en radiomärkt med hög affinitetsligand och om inga ligander är kända, vilka binder med submicromolar affinitet sedan ett alternativt tillvägagångssätt kommer att bli nödvändigt. Många andra metoder används allmänt för att mäta proteinstabilitet såsom bindning av fluorescerande färgämnen och kalorimetri 14 men är låg genomströmning och är antingen oförmögna att direkt mäta funktionen eller kräver stora mängder protein. Om SPA metoden inte kan användas, är ett alternativ med hög genomströmning tillvägagångssätt en FSEC-baserade Termostabilitet analys 15 (FSEC-TS), där provet värms följt av separation av den fraktion av resterande transportör. FSEC-TS är en användbar metod för att komma åt kromatografiska beteende och oligomera tillstånd och är apowerful kompletterande verktyg som kan användas tillsammans med SPA-metoden. En jämförelse av olika gemensamma proteinexpressionssystem konstaterades också att främja användningen av däggdjursceller för SERT uttryck 16 och förvånande detta sannolikt är fallet för många proteiner av däggdjursursprung. De metoder som vi har använt för uttryck har skräddarsytts för SERT men sannolikt lätt anpassningsbar. Betingelser som gynnar höga nivåer av uttryck ska identifieras noggrant genom att variera tiden för uttryck, temperatur, viruskoncentration, och närvaron av histondeacetylas hämmare såsom natriumbutyrat. Vi föredrar i allmänhet affinitetsrening i en mild lång kedja rengöringsmedel såsom C12M tillsammans med CHS före beredning för att behålla hög affinitet ligandbindning. Rekonstitution med användning av hydrofob absorption är en mild teknik som vi har funnit vara effektiva för flera andra transportörer och receptorer. Om det härär inte lyckas, avlägsnande av tvättmedel med hög kritisk micellkoncentration genom dialys, utspädning eller SEC kan användas 17 förutsatt att antigenet är tillräckligt stabil i sådana rengöringsmedel. I de fall där inga lämpliga antikroppar påträffas, vi nästan alltid hitta problemet beror på förlust av funktion eller denaturering av antigenet och i sådana fall vi framgångsrikt utfört nya vaccinationer med särskild uppmärksamhet på proteinbiokemi. Slutligen bör ligander och antikroppar som binder med hög affinitet ligger till grund för en rationellt planerad kristallisa experimentet och genom att dra fördel av ett termostabilt variant kan man screena ett bredare spektrum av betingelser genom att variera egenskaperna hos olika detergenter. Dessutom bör kristallisation i en lipidisk mesofas 18 eller med hjälp av bicelles 19 alltid betraktas som ett alternativ till kristallisation i miceller. Dessa principer och metoder kan användas med viss modifikatjon för många andra transmembranproteiner, som är svåra att uttrycka och rena från andra expressionsvärdar, och kommer att vara speciellt användbara för strukturbestämning av måltavlor för hög affinitet droger.

Serotonintransportören (Sert) är en integrerad membranprotein som underlättar transporten av serotonin över cellmembran 1. Sert tillhör en familj av Neuro Sodium Symporters (NSSS) som också innehåller dopamin och noradrenalin transportörer 2. SERT är det molekylära målet för allmänt föreskrivna antidepressiva och ångestdämpande läkemedel som verkar för att kompetitivt hämma serotonin transporter 3. Sert utnyttjar energiskt gynnsamma cotransport av natrium för att avlägsna signalsubstans från synaptiska klyftan. Omfattande karaktärisering av det serotonerga systemet har visat att förändringar i serotonin metabolism tycks påverka praktiskt taget alla neurologiska processer inklusive humör, sömn, smärta, kognition, och aggression beteenden 4. SERT funktion kan modifieras genom användning av antidepressiva läkemedel och selektiva serotoninåterupptagshämmare (SSRI) som S -citalopram, liksom genom psychostimulaNTS och droger av missbruk, såsom amfetamin och 3,4-metylendioxi- N -methylamphetamine eller &quot;extas&quot; 1,2. SSRI är oerhört viktiga för behandling av affektiva störningar, men den exakta strukturella basen för deras agerande är inte väl förstådd. WT SERT är instabil i detergentmiceller, vilket hindrar utvecklingen mot ett tredimensionellt (3D) struktur Sert 5,6. Nyligen utvecklade vi varianter av Sert som är kraftigt stabil i ett brett spektrum av tvättmedel och behålla SSRI-bindande aktivitet 6. Dessa termo sert varianter valdes med hjälp av en Scintillation Proximity baserad termoanalys. Här beskriver vi ett förfarande för generering av antikroppar med hög affinitet som kan binda SERT, och rening och kristallisation av termostabilt SERT, i komplex med antikropp och S -citalopram. Detta protokoll förutsätter att Sert och 8B6 gener har varit framgångsriky klonades in i BacMam 7 och insekts expressionsvektorer, respektive. Att generera antikroppar, ades cDNA som kodar för resterna 73-616 av WT SERT klonades in i BacMam vektor med en C-terminal Strep Il-tag (SERT IC). För termo skärmen var Sert resterna 73-616 med C-terminal GFP, Strep II, och 10-His-taggar (SERT TC) användas. Individuella punktmutationer genererades i Sert TC bakgrunden. För kristallisa protokollet var Sert-GFP-fusionsprotein som används med Twin-Strep [TrpSerHisProGlnPheGluLys (GlyGlyGlySer) 2 GlyGlySerAlaTrpSerHisProGlnPheGluLys] och 10-his-märkningar, bär termo mutanter, Y110A, I291A och T439S och mutationer av ytan cysteiner C554A, C580A och C622A (SERT CC). Trombin klyvningssekvenser (LVPRGS) var också insatt i SERT CC efter F76 och T618 för att tillåta avlägsnande av den N- och C-terminalerna. Den plasmid som kodar för 8B6 Fab var konstruerad för att uttrycka både tunga och lättakedjor av antikroppen med gp67 utsöndringssekvenser som styrs av två separata polyhedrin-promotorer. C-terminalen av den tunga kedjan av 8B6 antikropp märktes med en 8-His-markör och en trombinklyvningsställe insattes mellan den tunga kedjan och den taggen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="760">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:372px;">DH10Bac</td>
			<td style="width:179px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:109px;">10361-012</td>
			<td style="width:101px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Kanamycin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP906-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gentamicin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP918-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tetracycline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-7660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bluo-gal</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15519-028</td>
			<td>5-Bromo-3-indolyl &#946;-D-galactopyranoside</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">IPTG</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>I1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Miniprep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cellfectin II</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10362-100</td>
			<td>Sf9 transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SF9</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sf-900 III SFM media</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12658-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEK-293S GnTI-</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Freestyle 293 media</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12338-018</td>
			<td>293 expression media</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>0984018DJ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium butyrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>303410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">S-citalopram</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4786</td>
			<td>Anagrade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">n-Dodecyl-?-D-Maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cholesteryl hemmisuccinate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850457P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850757P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840457P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Leupeptin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pepstatin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Aprotinin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PMSF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Desthiobiotin</td>
			<td>Iba Life Sciences</td>
			<td>2-1000-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Asolectin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cholesterol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lipid A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L5399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Brain polar lipid</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>141101C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Biobeads</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>152-3920</td>
			<td>Hydrophobic absorption resin</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Goat anti-mouse IRDye 680RD</td>
			<td>Odyssey</td>
			<td>926-68070</td>
			<td>Used as secondary for western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lauryl maltose neopentyl glycol</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>NG310</td>
			<td>Anagrade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Serotonin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pFastBac 8B6</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a name="RANGE!D35">Available from authors</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pEG Bacmam SERT Strep II</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>SERTIC, Available from authors</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pEG Bacmam SERT GFP twin Strep His</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>SERTTC, Available from authors</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pEG Bacmam SERT ts3 GFP twin Strep His</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>SERTCC, Available from authors</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imidazole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>56749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">n-Octyl &#946;-D-maltoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>O310</td>
			<td>Anagrade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Thrombin</td>
			<td>Haematologic Technologies</td>
			<td>HCT-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EndoH</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P0702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trizma-HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5941</td>
			<td>Tris used for preparation of crystallization reservoirs</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PEG 400</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>91893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">6-aminohexanoic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>MT25052CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isoplate-96 TC</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>6005070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PolyJet</td>
			<td>SignaGen</td>
			<td>SL100688</td>
			<td>Polymer transfection reagent for mamalian cells</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Copper HIS-Tag YSI SPA Beads</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>RPNQ0096</td>
			<td>His-tag affinity SPA beads</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Citalopram, [N-Methyl-3H]</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NET1039250UC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ThermoMixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000023</td>
			<td>heating block for thermostability assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ThermoTop</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5308000003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SmartBlock PCR 96, thermoblock for PCR plates</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5306000006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.2 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>25-243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1 L filter system</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2 L flat bottom tissue culture flask</td>
			<td>Genemate</td>
			<td>F-5909-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2 L baffled tissue culture flask</td>
			<td>Genemate</td>
			<td>F-5909-2000B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Forma Orbital Shaker</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Strep-Tactin resin</td>
			<td>Iba Life Sciences</td>
			<td>2-1208-025</td>
			<td>Strep affinity resin</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Extruder</td>
			<td>Northern Lipids</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Li-Cor imaging system</td>
			<td>Odyssey</td>
			<td></td>
			<td>western blot imaging system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">XK16 column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9889-37</td>
			<td>column used for Strep-Tactin and Talon purificaiton</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">100 kDa MWCO protein concentrator</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC910096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">30 kDa MWCO protein concentrator</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC903024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#196;kta FPLC</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>UPC-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HPLC</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>51476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Superose 6 (10/300) column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-5172-01</td>
			<td>Used for FSEC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tangential flow apparatus</td>
			<td>Pall Filtron</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.2 &#181;m filter tangential flow cell</td>
			<td>Pall Filtron</td>
			<td>PSM20C11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">30 kDa MWCO tangential flow concentrator</td>
			<td>Pall Filtron</td>
			<td>OS030T12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Talon resin</td>
			<td>Clonetech</td>
			<td>635504</td>
			<td>His-tag affinity resin used for Fab purification</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1 ml HiTrap SP column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17115101</td>
			<td>Cation exchanger used for Fab purification</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Superdex 200 10/300 GL column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-5175-01</td>
			<td>Used for SEC separation of SERT-8B6</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">24-well VDXm plate</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">18 mm coverslips</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-239</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Virocyt virus counter</td>
			<td>Virocyt</td>
			<td>2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MicroBeta Trilux</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>1450</td>
			<td>96-well scintillation counter</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HiTrap SP column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17115101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sertraline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6319</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

thermostabilization, expression, purification, and crystallization of the human serotonin transporter bound to s-citalopram

Serotonintransportören är en natrium och klorid kopplade transportör som &quot;pumpar&quot; extracellulärt serotonin in i celler. S -citalopram är ett läkemedel som används för behandling av depression och ångest genom att binda till serotonintransportören med hög affinitet, blockerar serotoninåterupptags. Här rapporterar vi ett effektivt förfarande och en uppsättning verktyg för att stabilisera, Express, renar och kristalliserar serotonintransportören-antikroppskomplex bundna till S -citalopram och andra antidepressiva läkemedel. Mutationer som stabiliserar serotonintransportören identifierades med användning av en S -citalopram bindningsanalysen. Serotonintransportör uttryckt i baculovirus-transducerade HEK293S GnTI - celler, rekonstituerades in i proteoliposomer och används för att höja antikroppar med hög affinitet. Vi har utvecklat en strategi för att upptäcka antikroppar som är användbara för strukturstudier. En enkel metod för expression av antikroppsfragment i Sf9-celler har också etablerats.Transporter-antikroppskomplex som renats med hjälp av detta förfarande är väluppfostrade och lätt kristalliserar, vilket ger komplex med S -citalopram som avböja röntgen till 3-4 Å upplösning. De strategier som utvecklats här kan användas för att bestämma strukturen av andra utmanande membranproteiner.

Ett bibliotek av enstaka punktmutanterna i Sert TC bakgrunden skapades för att screena för thermostabilizing mutationer. Individuella mutanter genererades med användning av standardmutagenes. Screeningsprotokollet utnyttjar transient transfekterade HEK293S celler och en scintillations-närhetsbaserad termostabilitet skärmen för att snabbt identiteten användbara mutationer för kristallisation som beskrivs översiktligt i fig 1A. Plotting Tm-värden kontra bunden [3H] citalopram vid RT avslöjar konstruktioner med hög termostabilitet och expressionsnivåer som är lämpliga för proteinrening (Figur 1B). Tre mutanter (Y110A, I291A, och T439S) kombinerades för att generera en mycket stabil konstruktion (Figur 1C). Termostabilitet är också korrelerad med ökad stabilitet i kortkedjiga detergenter som är nödvändiga för kristallisering av SERT-Fab-komplexet. Den storskaliga uttryck av humant Sert användning av baculovirus-transduced HEK293S GnTI - celler kan ta mindre än 2 veckor och kan producera milligramkvantiteter, såsom illustreras i figur 2A. Användning av GFP-märkta SERT CC-protein tillåter SERT att enkelt följas under expression och rening genom fluorescens (figur 2B). Vår reningsstrategi involverade 1) solubilisering av SERT bundet till S -citalopram från HEK293S GnTI - celler i C12M i närvaro av CHS som stabiliserande lipid; 2) bindning av Sert till en Strep affinitetsmatris; 3) avlägsnande av kontaminerande proteiner genom omfattande tvättning; och 4) eluering av den funktionella SERT med buffert innehållande destiobiotin (figur 2C). Det eluerade proteinet är i stort sett fri från andra detekterbara proteiner genom Coomassie blåfärgning och monodispersa som bedöms av FSEC (figur 2D, E). En liknande strategi togs för att rena SERT med en Strep Il-tag, som användes för reconstitution och immunisering (Figur 3A, B). Inkorporering av SERT i proteoliposomer ökar serumhalveringstiden och stabiliteten hos SERT och förbättrar sannolikheten för isolering av antikroppar med hög affinitet. Vidare inkludering av lipid A, en komponent i bakteriecellväggen, tjänar som en potent adjuvans 9. Multilamellära liposomer framställdes genom tillsats av buffert till en torkad lipidblandning i glasrör och återsuspenderades i buffert. Extrudering av liposomerna genom 200 nm porstorlek filter ger monodispersa unilamellära liposomala suspensioner. Liposomerna därefter mättades med detergent, följt av tillsats av renat SERT i tvättmedel. Slutligen tvättmedel avlägsnas genom tillsats av hydrofoba absorption harts till lipid: tvättmedelsblandning. Ytterligare ligand bör läggas till det rekonstituerade provet för att selektera för antikroppar som känner igen den antidepressiva bundna konformation. Närvaron av Sert i proteoliposomer bör bekräftas genomsolubilisering ett litet prov med SDS-PAGE-laddningsfärg eller C12M och körs på SDS-PAGE och FSEC (figur 3C, D). Hybridom-cellinjer som uttrycker SERT antikroppar kan screenas med avseende på hög affinitet bindemedel som känner igen 3D-epitoper. Dessa egenskaper är avgörande för en eventuell framgång kristall som antikroppen måste förbli fast bundna till en strukturerad regionen för att främja kristall förpackning av homogena, välordnade domäner. I det första steget, är antikroppar som känner igen ostrukturerade regioner identifieras. Sert är denaturerad och blottades på ett nitrocellulosamembran; antikroppar som binder denaturerad Sert kommer att vara västerländsk positiv och sannolikt känner igen linjära epitoper. I figur 4A, visar vi 2 exempel på antikroppar som är western-positiv och sannolikt inte lämpligt att främja crystallogenesis. I figur 4B, är de återstående väst negativa antikroppar inkuberades med 100 nM SERT-GFP och åtskilda avFSEC. Antikroppar som binder Sert kommer att förskjuta GFP-positiva topp till ett tidigare läge. De sert-antikroppskomplex kan spädas ytterligare i rengöringsmedel för att avgöra om de kan binda med nanomolar affinitet följt av analys av FSEC. Tillsats av serotonin resulterar i konformationsförändringar i transportören och därmed de antikroppar kan återscreenades för att bestämma om de specifikt kan känna igen SSRI-bunden konformation. I figur 4C är antikropparna visade sig binda SERT i närvaro av serotonin, som visar att epitopen (er) inte ändrar från SSRI till substrat bundet tillstånd. Slutligen, i figur 4D kombinationer av antikroppar testas med avseende på deras förmåga att binda distinkta epitoper, vilket resulterar i en ytterligare vänstervridning. Här den 15B8 eller 8A11 antikroppar känner igen en epitop som skiljer sig från 8B6. Den 8B6 antikropp valdes för ytterligare strukturanalys baserad på preliminära kristall screening med papain treaTed Fab. Generna enligt 8B6 Fab klenades in i en insektscell-expressionsvektor. Fab kan uttryckas och utsöndras från Sf9-celler som växer i suspension. Den 8B6 Fab kan renas från Sf9-cell supernatanten genom His-tag affinitet (fig 5A, B) och katjonbyteskromatografi (Figur 5C, D) som resulterar i protein som förefaller fri från föroreningar på SDS-PAGE-geler. I fig 5E, är den rekombinanta 8B6 Fab visades binda SERT och används i efterföljande biokemiska och biofysiska experiment. Det affinitetsrenade SERT CC spjälkas med trombin och EndoH och blandades med 8B6 Fab att bilda ett komplex i närvaro av S -citalopram. Transportören-antikroppskomplexet separeras sedan genom SEC i C8M (figur 6A) och toppfraktionerna innehåller både SERT och Fab, såsom visas genom SDS-PAGE (Figur 6B). Användning av C8M är avgörande för kristallbildning troligen på grundden kortkedjiga detergent medger bättre packning mellan molekyler i kristallgittret. FSEC används för att bestämma vilka fraktioner bör slås samman för kristallisation (figur 6C); fraktioner som inte är monodispersa och / eller innehåller stora mängder av fri Sert eller Fab bör inte kombineras. Prism formade sert-antikropp kristaller kan odlas i närvaro av S -citalopram användning av detta protokoll genom att hänga droppångdiffusion (figur 7A). De resulterande kristallerna diffrakterar röntgenstrålar till en upplösning på 3,15 Å 10 (Figur 7B). <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/54792/54792fig1.jpg" /> Figur 1: Scintillation Proximity-baserade Termostabilitet analys A.. Översikt över protokoll för screening termo i närvaro av [3H] citalopram. B. Maximal bunden [3 </sup&gt; H] citalopram kontra skenbar smälttemperatur (Tm). Streckade linjerna representerar värden för WT-transportören. De 3 mest termo mutanter är märkta. Grå området representerar mutanter som har mindre än 10% av [3H] citalopram bindande i förhållande till WT och därmed felaktiga Tm-värden på grund av en låg signal-till-brus. C. Termokurvor för WT SERT TC och de bästa 3-mutanter. Felstaplar representerar standardavvikelse (SD). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> <img alt="figur 2" src="/files/ftp_upload/54792/54792fig2.jpg" /> Figur 2: Översikt över Mammalian heterologt protein Expression A.. Schematiskt översikt över BacMam virusgenerering och uttryck av SERT i HEK293S GnTI -. Celler B. HANK293S GnTI - celler som uttrycker SERT CC (GFP fluorescens) C.. Elueringsprofilen för SERT CC på Strep affinitetsharts. Grön spår representerar koncentrationen av destiobiotin, 0 - 100% (0-5 mM) D.. Analys av affinitetsrenat SERT CC på en 4 - 15% SDS-PAGE-gel E.. FSEC av affinitetsrenat SERT CC detekteras av GFP fluorescens (excitation: 480 nm; Emission: 510 nm). Elueringstoppen på 15 ml är Sert (#) och 18 ml är fri GFP (*). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54792/54792fig3.jpg" /> Figur 3: Representant Affinitetsrening och Rekonstituering av SERT IC A.. Schematisk översikt av antikroppsgenerering. &lt;strong&gt; B. Elueringsprofilen observerades vid 280 nm av affinitetsrening av Sert IC på Strep affinitetsharts. Grön spår representerar koncentrationen av destiobiotin, 0 - 100%. (0-5 mM) C. Analys av affinitetsrenat och rekonstituerades SERT på en 4 - 15% SDS-PAGE-gel D.. FSEC av solubiliserat Sert efter beredning. Fluorescensen hos tryptofan rester användes för att detektera Sert (excitation: 280 nm; Emission: 335 nm). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> <img alt="figur 4" src="/files/ftp_upload/54792/54792fig4.jpg" /> Figur 4:. Analys av representativa Sert antikroppar A. Screening av antikroppar med Western blöt. Cirka 1 pg av SERT CC med eller utan GFP applicerades på en 4 - 15% SDSPAGE-gel och blottades på ett nitrocellulosamembran. Bindning detekterades med användning av en get-anti-mus-antikropp konjugerad till IR Dye. 2G4 och 10F2 är västra positiv. B. Bindning av antikroppar till 100 nM GFP-märkta Sert och upptäckt av FSEC detekteras med hjälp av GFP fluorescens. C. Bindning av utvalda Fabs till 100 nM GFP-tagged SERT i närvaro av 1 mM serotonin. D. Bindning av 8A11 eller 15B8 Fabs att sert-8B6 Fab. Mindre toppar som eluerade vid 18 ml är gratis GFP. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig4large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> <img alt="figur 5" src="/files/ftp_upload/54792/54792fig5.jpg" /> Figur 5: Representant Rening av 8B6 Fab från Sf9 celler A.. Elueringsprofilen observerades vid 280 nm av rening av 8B6 Fab av His-tag affinitet chromatograp<html> hy. Grön spår representerar koncentrationen av imidazol, 0-50% (0-250 mM) B.. Icke-reducerande och reducerande SDS-PAGE-gel efter His-tag affinitetsrening. Protein som löper nära 50 kDa är icke-reducerad Fab (#) och mindre arter på 25 kDa reduceras Fab (*). C. Elueringsprofilen observerades vid 280 nm av rening av 8B6 Fab genom katjonbyte visar en enda symmetrisk topp som eluerar i en linjär natriumkloridgradient. Grön spår representerar koncentrationen av NaCl, 0 - 100%. (0-500 mM) D. Analys av 8B6 Fab på en 12,5% SDS-PAGE-gel efter rening genom katjonbyte. E. Bindning av 8B6 Fab till 10 nM GFP-märkta Sert, detekteras med hjälp av fluorescens av GFP. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig5large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> e 6 &quot;src =&quot; / filer / ftp_upload / 54792 / 54792fig6.jpg &quot;/&gt; Figur 6: Representant Gelfiltreringskromatografi av SERT-8B6 komplexet i närvaro av S -citalopram A.. Gelfiltrering elueringsprofilen för renat Sert-8B6 komplex. Huvudtopp som eluerade vid 11,5 ml är Sert-8B6 komplex. Peak på 15-17 ml innehåller GFP och Fab B.. Analys av det renade SERT-8B6-komplexet på en 4 - 15% SDS-PAGE-gel. Positionerna för SERT och de tunga och lätta kedjorna av Fab visas med ett streck. C. FSEC av storleksseparerade fraktioner. SERT-8B6 komplex detekterades med användning av tryptofan fluorescens. Fraktion 17 innehåller en större mängd Sert som inte komplex med Fab. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig6large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> <img alt="figur 7"src = &quot;/ filer / ftp_upload / 54792 / 54792fig7.jpg&quot; /&gt; Figur 7: Kristallisation av Sert-8B6 Complex Bound S -citalopram A.. Ljusmikroskopi av parallellepipedformade formade kristaller av Sert-8B6 komplexet efter 2 veckors tillväxt. Skala bar är lika med 200 nm. B. SERT-8B6 kristaller diffrakterar röntgenstrålar till 3,15 Å. Blå ringen representerar 3,15 Å. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig7large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> Tabell 1: a. Kristallisebilden för den Sert-8B6 Complex Bound S -citalopram <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792table1.xlsx">Klicka här för att ladda ned den här tabellen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram at JoVE.com

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Detta manuskript beskriver hur man screena för thermostabilizing mutationer, rena mänskliga serotonintransportören, generera antikroppar med hög affinitet, och kristallisera serotonintransportören-antikroppskomplex bundet till det antidepressiva läkemedlet S -citalopram. Detta protokoll kan anpassas till studier av andra utmanande membrantransportörer, receptorer, och kanaler.

Thermostabilization, Expression, rening och kristallisation av den mänskliga Serotonin Transporter Bound till<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

Expression, rening och antimikrobiell aktivitet av S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

Rekombinant Proteinuttryck, Kristallisation och Biofysiska Studier av a<em&gt; Bacillus</em&gt; -konserverad nukleotidpyrofosforylas, BcMazG

To overcome safety restrictions and regulations when studying genes and proteins from true pathogens, their homologues can be studied. Bacillus anthracis ...

A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/&#945;

A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±

En Guide till produktion, kristallisering och strukturbestämning av mänskliga IKK1/α

A class of extracellular stimuli requires activation of IKK1/&#945; to induce generation of an NF-&#954;B subunit, p52, through processing of its ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

Uttryck och rening av däggdjur Bestrophin jonkanaler

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Uttryck och rening av den mänskliga Lipid-känsliga ering kanal TRPC3 för strukturella bestämning genom Single-particle kryo-elektronmikroskopi

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

Uttryck, lösbarhet och rening av eukaryota Borat transportörer

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...

Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

Uttryck och rening av Nukleasfri syre avskiljare Protocatechuat 3, 4-dioxygenas

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Uttryck, rening, kristallisering, och enzym analyser av Fumarylacetoacetat Hydrolase Domain-innehållande proteiner

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

PCR Mutagenesis, Cloning, Expression, Fast Protein Purification Protocols and Crystallization of the Wild Type and Mutant Forms of Tryptophan Synthase

PCR Mutagenesis, Kloning, Uttryck, Snabba protein rening protokoll och kristallisering av den vilda typen och mutanta former av tryptofan syntas

Structural studies with tryptophan synthase (TS) bienzyme complex (&#945;2&#946;2 TS) from Salmonella typhimurium have been performed to better understand ...

Bacterial Expression and Purification of Human Matrix Metalloproteinase-3 using Affinity Chromatography

Bakteriellt uttryck och rening av human matrix metalloproteinase-3 med hjälp av affinitetskromatografi

Matrix metalloproteinases (MMPs) belong to the family of metzincin proteases with central roles in extracellular matrix (ECM) degradation and remodeling, ...