Name: thermostabilization, expression, purification, and crystallization of the human serotonin transporter bound to s-citalopram
Uploaded: 2016-11-27T15:00:00
Duration: 12 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram at JoVE.com

We thank D. Cawley for generating monoclonal antibodies. We thank A. Penmatsa and K. Wang for sharing ideas and expertise developed from the dopamine transporter. L. Vaskalis for assistance with figures, H. Owen for help with manuscript preparation and other Gouaux laboratory members for helpful discussions. J.A.C. has support from a Banting postdoctoral fellowship from the Canadian Institutes of Health Research. E.M.G. is supported by the National Science Foundation Graduate Research Fellowship. We are particularly grateful to Bernie and Jennifer LaCroute for their generous support, as well as for funding from the NIH (5R37MH070039). E.G. is an investigator of the Howard Hughes Medical Institute.

<ol>
	<li>Kristensen, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLC6+neurotransmitter+transporters:+structure,+function,+and+regulation.">SLC6 neurotransmitter transporters: structure, function, and regulation.</a> Pharmacol Rev. 63 (3), 585-640 (2011).</li><li>Broer, S., Gether, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+solute+carrier+6+family+of+transporters.">The solute carrier 6 family of transporters.</a> Br J Pharmacol. 167 (2), 256-278 (2012).</li><li>Andersen, J., Kristensen, A. S., Bang-Andersen, B., Stromgaard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+understanding+of+the+interaction+of+antidepressant+drugs+with+serotonin+and+norepinephrine+transporters.">Recent advances in the understanding of the interaction of antidepressant drugs with serotonin and norepinephrine transporters.</a> Chem Commun (Camb). 25 (25), 3677-3692 (2009).</li><li>Hahn, M. K., Blakely, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+impact+of+SLC6+transporter+genetic+variation.">The functional impact of SLC6 transporter genetic variation.</a> Annu Rev Pharmacol Toxicol. 47, 401-441 (2007).</li><li>Abdul-Hussein, S., Andrell, J., Tate, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermostabilisation+of+the+serotonin+transporter+in+a+cocaine-bound+conformation.">Thermostabilisation of the serotonin transporter in a cocaine-bound conformation.</a> J Mol Biol. 425 (12), 2198-2207 (2013).</li><li>Green, E. M., Coleman, J. A., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermostabilization+of+the+human+serotonin+transporter+in+an+antidepressant-Bound+Conformation.">Thermostabilization of the human serotonin transporter in an antidepressant-Bound Conformation.</a> Plos One. 10 (12), e0145688 (2015).</li><li>Goehring, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+and+large-scale+expression+of+membrane+proteins+in+mammalian+cells+for+structural+studies.">Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies.</a> Nat Protoc. 9 (11), 2574-2585 (2014).</li><li>Kawate, T., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-detection+size-exclusion+chromatography+for+precrystallization+screening+of+integral+membrane+proteins.">Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins.</a> Structure. 14 (4), 673-681 (2006).</li><li>De Becker, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adjuvant+monophosphoryl+lipid+A+increases+the+function+of+antigen-presenting+cells.">The adjuvant monophosphoryl lipid A increases the function of antigen-presenting cells.</a> Int Immunol. 12 (6), 807-815 (2000).</li><li>Coleman, J. A., Green, E. M., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+structures+and+mechanism+of+the+human+serotonin+transporter.">X-ray structures and mechanism of the human serotonin transporter.</a> Nature. , (2016).</li><li>White, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+progress+of+membrane+protein+structure+determination.">The progress of membrane protein structure determination.</a> Protein Sci. 13 (7), 1948-1949 (2004).</li><li>Gambotto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenicity+of+enhanced+green+fluorescent+protein+(EGFP)+in+BALB/c+mice:+identification+of+an+H2-Kd-restricted+CTL+epitope.">Immunogenicity of enhanced green fluorescent protein (EGFP) in BALB/c mice: identification of an H2-Kd-restricted CTL epitope.</a> Gene Ther. 7 (23), 2036-2040 (2000).</li><li>Galfre, G., Howe, S. C., Milstein, C., Butcher, G. W., Howard, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+major+histocompatibility+antigens+produced+by+hybrid+cell+lines.">Antibodies to major histocompatibility antigens produced by hybrid cell lines.</a> Nature. 266 (5602), 550-552 (1977).</li><li>Deller, M. C., Kong, L., Rupp, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+stability:+a+crystallographer's+perspective.">Protein stability: a crystallographer's perspective.</a> Acta Crystallogr F Struct Biol Commun. 72, 72-95 (2016).</li><li>Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescence-detection+size-exclusion+chromatography-based+thermostability+assay+for+membrane+protein+precrystallization+screening.">A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening.</a> Structure. 20 (8), 1293-1299 (2012).</li><li>Tate, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+seven+different+heterologous+protein+expression+systems+for+the+production+of+the+serotonin+transporter.">Comparison of seven different heterologous protein expression systems for the production of the serotonin transporter.</a> Biochim Biophys Acta. 1610 (1), 141-153 (2003).</li><li>Rigaud, J. L., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+membrane+proteins+into+liposomes.">Reconstitution of membrane proteins into liposomes.</a> Methods Enzymol. 372, 65-86 (2003).</li><li>Caffrey, M., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallizing+membrane+proteins+using+lipidic+mesophases.">Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases.</a> Nat Protoc. 4 (5), 706-731 (2009).</li><li>Faham, S., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bicelle+crystallization:+a+new+method+for+crystallizing+membrane+proteins+yields+a+monomeric+bacteriorhodopsin+structure.">Bicelle crystallization: a new method for crystallizing membrane proteins yields a monomeric bacteriorhodopsin structure.</a> J Mol Biol. 316 (1), 1-6 (2002).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Biyofiziksel tekniklerle membran proteini yapısının belirlenmesi, birçok tıbbi önemli taşıyıcıları, reseptörler ve kanallar 11 için zor bir girişim olarak kalır. Burada S -citalopramın bağlı insan serotonin taşıyıcı yapı tayini için geliştirilen ayrıntılı uzmanlık paylaşır. Biz bu yöntemlerin diğer yapısal durumları yanı sıra diğer zor zar proteinlerinin yapılarda SERT yapılarının yararlı olacağını tahmin ediyoruz. Bundan başka, burada açıklanan biyokimyasal teknikler aynı zamanda, deterjan saflaştırıldı eki ve bir yakın yerel lipid ortam işlevi çalışmak için de kullanılabilir. SERT kristalleşme birkaç araç ve tekniklerin geliştirilmesi üzerine menteşeli. İlk olarak, taşıyıcı termo gelişmeler membranların 6 taşıyıcı çıkarma aşağıdaki çeşitli deterjan miseller iyi davrandım SERT varyantları üretti. İkincisi, kullanımsaflaştırma ve kristalizasyon boyunca yüksek afiniteli ligandı S -citalopramın daha da geliştirilmiş kararlılık ve düşük yapısal heterojenite. Üçüncü olarak, aşılama ve kristalleşme hem de kolaylaştıran 2 hafta gibi kısa bir süre içinde SERT büyük miktarlarda üretimi için izin BacMam sentezleme sistemi 7 geliştirilmesi. Son olarak, stratejilerinin geliştirilmesi kristaller halinde SERT-antikor komplekslerinin iyi sıralı ambalaj teşvik 8B6 antikorunun keşfine izin 3D epitopları tanıyan yüksek afiniteli antikorların seçilmesi için. genellikle protokol boyunca meydana gelen kritik adımlar ve reaktifler yanı sıra ortak bir takım sorunlar vardır. İlk olarak, yüksek titre SERT P2 virüsün üretimi sorunlu olabilir. Bu protokolde tarif edildiği gibi P2 virüs üretmek için P1 virüsünün düşük konsantrasyonlarda eklemek genellikle bu sorunu ortadan kaldıran, ve P2 Virüs titresi düşük olduğu durumlarda, P3 virüsü usin yapılabilir0.0001 bir MOI&#39;da g virüsü. 1 x 10 8 virüs partiküllerinin daha düşük bir titreye sahip bir virüs / ml kullanılmamalıdır ve hemen hemen her zaman düşük protein verimine neden olur. Ekspresyon için, HEK293S GnTI - bunlar N kompleks N -glycans sentezleyemediği dolayısıyla I aktivitesini -acetylglucosaminyltransferase ve eksik olur hücreler yerine, yalnızca yüksek mannoz N -glycans üreten seçilmiştir. EndoH böler N asparajin bağlı bir N -acetylglucosamine bırakarak hücre dışı döngü 2 (EL2) iki noktada yüksek mannoz glikanların glikozilasyon -bağlı. N sindirimi şekerler kristalleştirme için olası önemli El2 yüzey entropi azaltır -bağlı. Antikorların üretimi için, SERT IC immünizasyon için kullanılmalıdır. GFP 12 yüksek oranda immünojenik ve tamamen SEC tarafından çıkarılması zor olduğu için antikorların üretilmesi için, bir füzyon etiket olarak kullanılmamalıdır. SERT esnek N- ve C-terminali de değildiBu bölgelerin karşı antikor önlemek için bir yapı da yer almaktadır. Fareler yeniden oluşturulmuş proteinin 30 ug ile immünize edilebilir; antikorların yüksek serum konsantrasyonları tespit edilmeye kadar immünize fareler devam tarif 13 hibridoma hücrelerinin üretilmesi. Bir thermostabilized yapı genellikle aşılama için en iyi seçimdir; taşıyıcı iyi davrandım ve arıtma için aşağıdaki biyolojik aktivitesini muhafaza, bu genellikle antikorları geliştirmek için yeterli olmaktadır. 8B6 antikoru WT SERT karşı büyüdü. kristalizasyon için FSEC ile değerlendirildiği gibi tek dağılımlı kompleksini ihtiva SEC sadece pik fraksiyonlar bir araya getirilmiş ve konsantre olmalıdır. SERT-8B6 kristalleri koşullar dar bir aralıkta büyür ve özellikle SERT kristal büyümesi ile ilgili sorunları gidermek için alınması gereken adımların bir dizi vardır. HCI ile ayarlanmıştır Tris baz, bu tampon, kristal büyümesini desteklemez, rezervuar çözeltisi içinde kullanılmamalıdır; böylece CRI olduğukortikal yerine NaOH ile ayarlanmıştır Tris kullanımı. Kristaller uzamıyor veya çok sayıda küçük kristaller gözlenir ise, PEG 400 konsantrasyonda bile küçük bir artış veya azalış tavsiye edilir eğer öyleyse SERT kristalleri, PEG 400 dar bir konsantrasyon aralığında büyür. Bundan başka, ilave 6-aminoheksanoik asit, aynı zamanda, nükleasyon artırmak için optimize ekran kullanılmıştır. Protein damla oranı: de bir çözüm de, kristal büyümesi için önemli bir belirleyici faktör olduğunu. tipik olarak daha büyük bir 3 boyutlu kristallerin büyümesine destek 1: 2 daha yakın açılan oranları önerilmektedir 1: 2 - 1.5 oranlarını bırakın. Son olarak, düşük profil 24 oyuklu plakalar kullanımı ki tahminen bu, buharı difüzyon hızının değiştirilmesi için, kristal büyüme yönünde çok önemlidir. SPA yöntemine alternatif bir yaklaşım, tahlil 5 bağlayıcı filtre kullanılarak kokaine bağlı konformasyonunda sıçan serotonin taşıyıcısını stabilize mutantlar için ekrana geliştirilmiştir. Buna karşılık, SPA baSED deney ligandına bağlı kalır SERT fraksiyonunun belirlenmesi ile, sırasıyla aşağıdaki ısıtma adımları sağlar. Bu nedenle, bu örneklerin az sayıda erime sıcaklığının hızlı bir şekilde belirlenmesine izin verir. SPA yöntem radyo-etiketli yüksek afiniteli bir ligandın varlığına dayanır ve herhangi bir ligand submikromolar afınite ile bağlanan, bilinmektedir sonra alternatif bir yaklaşım, gerekli olacaktır. Birçok diğer yöntemler yaygın olarak bu tür floresan boyalar ve kalorimetri 14 bağlayıcı protein stabilitesini ölçmek için kullanılan, ancak, düşük-verimlilik ve işlevi doğrudan ölçülmesi veya yüksek miktarda protein gerektirecek ya edemiyoruz vardır. SPA yöntem kullanılabilir olamaz, alternatif bir yüksek verimli bir yaklaşım, örnek taşıyıcı kalan fraksiyonunun ayrılması ve ardından ısıtılan bir FSEC tabanlı Termostabilite Deney 15 (FSEC-TS) vardır. FSEC-TS kromatografik davranış ve oligomerik durumunu erişmek için kullanışlı bir yaklaşım ve ApSPA yöntemiyle birlikte kullanılabilecek owerful tamamlayıcı bir araç. Çeşitli ortak protein ekspresyon sistemlerinin bir karşılaştırma da SERT ifadesi 16 için memeli hücrelerinin kullanımı tercih bulunmuştur ve şaşırtıcı Bu büyük olasılıkla, memeli kökenli birçok proteinler için geçerlidir. Biz ifade için kullanılan metodlar SERT için uyarlanmış ancak büyük olasılıkla kolayca adapte edilmiştir. yüksek ifade seviyeleri tercih şartlar dikkatli bir şekilde, örneğin sodyum bütirat histon deasetilaz inhibitörleri sentezlenmesi, sıcaklık, virüs konsantrasyonu ve varlığı süresi değiştirilerek belirlenmelidir. Genellikle bağlanmadan önce yüksek afiniteli bir ligandın tutmak için yeniden-teşekkül ettirilmeden CHS birlikte böyle C12M gibi hafif bir uzun zincirli deterjan afinite saflaştırma lehinedir. hidrofobik emilimini kullanarak Sulandırma biz birkaç diğer nakliyecilere ve alıcıları için etkili olduğu bulduk hafif bir tekniktir. Eğer budiyaliz, seyreltme, veya sek. yüksek kritik misel konsantrasyonu ile deterjan çıkarılması 17 antijeni deterjanlar içinde yeterince kararlı olarak temin başarılı kullanılabilir değildir. Uygun bir antikor bulunan durumlarda, hemen hemen her zaman sorun işlevi veya antijen denatürasyon kaybı nedeniyle ve bu gibi durumlarda başarıyla protein biyokimyası özel dikkat yeni aşılar uygulandı bulabilirsiniz. Son olarak, yüksek bir afinite ile bağlanan ligandlar ve antikorlar, bir rasyonel olarak planlanmış kristalizasyon deney için bir temel oluşturacaktır ve ısıya dayanıklı bir varyantın yararlanarak, biri farklı deterjanların özellikleri değiştirilerek koşullarının geniş bir aralıkta tarayabilir. Bundan başka, bir lipidik mezofaz 18 kristalleştirme veya bicelles 19 kullanılarak her miseller kristalleşme alternatif olarak düşünülmelidir. Bu ilkeler ve yöntemler bazı modifi ile kullanılabilirifade ve diğer ekspresyon ana den saflaştırmak ve yüksek afiniteli ilaçların hedeflerinden yapı tayini için özellikle faydalı olacaktır zor olan diğer zar proteini için bir katyondur.

Serotonin (SERT) hücre membranları 1 arasında serotonin taşınmasını kolaylaştıran bir integral membran proteinidir. SERT ayrıca dopamin ve norepinefrin taşıyıcıları 2 içeren nörotransmitter Sodyum Symporters (NSSs) bir aile aittir. SERT rekabetçi serotonin naklini 3 inhibe hareket yaygın olarak reçete antidepresan ve anti-anksiyete ilaçları moleküler hedeftir. SERT sinaptik gelen nörotransmitter çıkarmak için sodyum enerjik olumlu cotransport patlatır. Serotonerjik sistemin kapsamlı karakterizasyonu serotonin metabolizmasında değişiklikler neredeyse ruh hali, uyku, ağrı, kavrama dahil olmak üzere tüm nörolojik süreçleri etkilemek için görünür olduğunu göstermiştir ve saldırganlık 4 davranışları. SERT fonksiyonu S -citalopramın gibi antidepresanlar ve selektif serotonin gerialım inhibitörleri (SSRI) kullanımı yoluyla yanı sıra psychostimula tarafından değiştirilebilirNTS ve amfetamin ve 3,4-Metilendioksi N -methylamphetamine veya &quot;ecstasy&quot; 1,2 olarak bağımlılık ilaçlar. SSRI ruh hali bozukluklarının tedavisi için son derece önemli olan, ancak bunların eylem için değerli yapı temeli çok iyi anlaşılmamıştır. WT SERT Böylece SERT 5,6 bir üç boyutlu (3D) bir yapı doğru ilerlemeyi engelleyen, deterjan miseller stabil değildir. Son zamanlarda, deterjan geniş bir sağlam kararlıdır ve aktivitesi 6 bağlanma SSRI korumak SERT varyantlarını geliştirdi. Bu termo SERT varyantları, bir sintilasyon yakınlık tabanlı termostabilite deneyi kullanılarak belirlenmiştir. Burada antikorun ve S -citalopramın ile kompleks olarak, SERT bağlanan yüksek afiniteli antikorların üretilmesi için bir işlem, ve ısıya dayanıklı SERT saflaştırılması ve kristalleşme açıklar. Bu protokol SERT ve 8B6 genler başarılı olmuştur varsayary, sırasıyla, BacMam 7 ve böcek sentezleme vektörlerine klonlanmıştır. Antikorların üretilmesi için, bir cDNA kodlayan tortuları WT SERT&#39;in 73-616 bir C-terminal Strep II etiketi (SERT İS) BacMam vektörüne klonlanmıştır. Termostabilite ekran için, SERT artıkları C-terminali GFP ile 73-616, Strep II ve 10-His etiketleri (SERT TC) kullanılmıştır. Bireysel nokta mutasyonları SERT TC arka planda üretildi. Kristalleşme protokolü için, SERT-GFP füzyon proteini yüzey sisteinler C554A, C580A ve ısı ayarlı mutantlar, Y110A, I291A ve T439S ve mutasyonlar taşıyan Twin-Strep [TrpSerHisProGlnPheGluLys (GlyGlyGlySer) 2 GlyGlySerAlaTrpSerHisProGlnPheGluLys] ve 10-His etiketleri ile kullanılmıştır ve C622A (SERT CC). Trombin parçalama dizileri (LVPRGS) de N- çıkarılması ve C-ucu sağlamak için S76 ve T618 sonra SERT CC sokulmuştur. 8B6 Fab kodlayan plazmid ağır ve hafif hem de ifade etmek için olaniki ayrı polihedrin promoterlerin kontrolü altında GP67 salgılama sekansları ile antikor zincirleri. 8B6 antikorunun ağır zincirinin C-terminal 8 His etiketi ile etiketlenmiş ve bir trombin parçalanma alanı ağır zincir ve etiket arasına sokulmuştur.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="760">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:372px;">DH10Bac</td>
			<td style="width:179px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:109px;">10361-012</td>
			<td style="width:101px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Kanamycin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP906-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gentamicin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP918-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tetracycline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-7660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bluo-gal</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15519-028</td>
			<td>5-Bromo-3-indolyl &#946;-D-galactopyranoside</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">IPTG</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>I1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Miniprep kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cellfectin II</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10362-100</td>
			<td>Sf9 transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SF9</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sf-900 III SFM media</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12658-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEK-293S GnTI-</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Freestyle 293 media</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12338-018</td>
			<td>293 expression media</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>0984018DJ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium butyrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>303410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">S-citalopram</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4786</td>
			<td>Anagrade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">n-Dodecyl-?-D-Maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cholesteryl hemmisuccinate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850457P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850757P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840457P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Leupeptin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pepstatin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Aprotinin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PMSF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Desthiobiotin</td>
			<td>Iba Life Sciences</td>
			<td>2-1000-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Asolectin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cholesterol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-8667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lipid A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L5399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Brain polar lipid</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>141101C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Biobeads</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>152-3920</td>
			<td>Hydrophobic absorption resin</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Goat anti-mouse IRDye 680RD</td>
			<td>Odyssey</td>
			<td>926-68070</td>
			<td>Used as secondary for western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lauryl maltose neopentyl glycol</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>NG310</td>
			<td>Anagrade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Serotonin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pFastBac 8B6</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a name="RANGE!D35">Available from authors</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pEG Bacmam SERT Strep II</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>SERTIC, Available from authors</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pEG Bacmam SERT GFP twin Strep His</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>SERTTC, Available from authors</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pEG Bacmam SERT ts3 GFP twin Strep His</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>SERTCC, Available from authors</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imidazole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>56749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">n-Octyl &#946;-D-maltoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>O310</td>
			<td>Anagrade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Thrombin</td>
			<td>Haematologic Technologies</td>
			<td>HCT-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EndoH</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P0702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trizma-HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5941</td>
			<td>Tris used for preparation of crystallization reservoirs</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PEG 400</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>91893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">6-aminohexanoic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>MT25052CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isoplate-96 TC</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>6005070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PolyJet</td>
			<td>SignaGen</td>
			<td>SL100688</td>
			<td>Polymer transfection reagent for mamalian cells</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Copper HIS-Tag YSI SPA Beads</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>RPNQ0096</td>
			<td>His-tag affinity SPA beads</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Citalopram, [N-Methyl-3H]</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NET1039250UC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ThermoMixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000023</td>
			<td>heating block for thermostability assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ThermoTop</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5308000003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SmartBlock PCR 96, thermoblock for PCR plates</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5306000006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.2 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Olympus Plastics</td>
			<td>25-243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1 L filter system</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2 L flat bottom tissue culture flask</td>
			<td>Genemate</td>
			<td>F-5909-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2 L baffled tissue culture flask</td>
			<td>Genemate</td>
			<td>F-5909-2000B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Forma Orbital Shaker</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Strep-Tactin resin</td>
			<td>Iba Life Sciences</td>
			<td>2-1208-025</td>
			<td>Strep affinity resin</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Extruder</td>
			<td>Northern Lipids</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Li-Cor imaging system</td>
			<td>Odyssey</td>
			<td></td>
			<td>western blot imaging system</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">XK16 column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9889-37</td>
			<td>column used for Strep-Tactin and Talon purificaiton</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">100 kDa MWCO protein concentrator</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC910096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">30 kDa MWCO protein concentrator</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC903024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#196;kta FPLC</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>UPC-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HPLC</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>51476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Superose 6 (10/300) column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-5172-01</td>
			<td>Used for FSEC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tangential flow apparatus</td>
			<td>Pall Filtron</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.2 &#181;m filter tangential flow cell</td>
			<td>Pall Filtron</td>
			<td>PSM20C11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">30 kDa MWCO tangential flow concentrator</td>
			<td>Pall Filtron</td>
			<td>OS030T12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Talon resin</td>
			<td>Clonetech</td>
			<td>635504</td>
			<td>His-tag affinity resin used for Fab purification</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1 ml HiTrap SP column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17115101</td>
			<td>Cation exchanger used for Fab purification</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Superdex 200 10/300 GL column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-5175-01</td>
			<td>Used for SEC separation of SERT-8B6</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">24-well VDXm plate</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">18 mm coverslips</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-239</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Virocyt virus counter</td>
			<td>Virocyt</td>
			<td>2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MicroBeta Trilux</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>1450</td>
			<td>96-well scintillation counter</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HiTrap SP column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17115101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sertraline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6319</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

thermostabilization, expression, purification, and crystallization of the human serotonin transporter bound to s-citalopram

Serotonin taşıyıcı hücre içine ekstraselüler serotonin &quot;pompaları&quot; bir sodyum ve klorür-birleştiğinde taşıyıcı olduğunu. S -citalopram serotonin geri alımını engelleyerek, yüksek afinite ile serotonin taşıyıcısı bağlanarak depresyon ve anksiyete tedavisinde kullanılan bir ilaçtır. Burada verimli bir prosedür ve ekspres, stabilize arındırmak ve S -citalopramın ve diğer antidepresanlara bağlı serotonin taşıyıcı-antikor kompleksleri kristalize için bir dizi araç sunduk. Serotonin taşıyıcısını stabilize mutasyonlar bağlanma tahlili S -citalopram kullanılarak belirlendi. Bakulovirüs kalıt HEK293S GnTI ifade serotonin taşıyıcı - hücreleri, proteoliposomes halinde yeniden kurulmuş ve yüksek afıniteli antikorlar yükseltmek için kullanılmıştır. Biz yapısal çalışmalar için yararlı olan antikorları keşfetmek için bir strateji geliştirdik. Sf9 hücrelerinde antikor fragmanlarının ekspresyonu için basit bir yaklaşım, aynı zamanda tespit edilmiştir.Bu yordamı kullanarak arıtılmış Transporter-antikor kompleksleri uslu ve kolayca 3-4 Å çözünürlük X-ışınları yaymak S -citalopramın ile kompleks üreten, kristalize bulunmaktadır. Burada geliştirilen stratejiler diğer zorlu membran proteinlerinin yapısını belirlemek için kullanılabilir.

SERT TC arka planda tek nokta mutantlar bir kütüphane mutasyonlarını termo ekranına oluşturuldu. Bağımsız mutantlar standart mutagenez kullanılarak elde edilmiştir. Şekil 1A tarif edilen tarama programı geçici hızlı kimlik kristalleştirme için yararlı mutasyonlara HEK293S hücreleri ve bir sintilasyon yakınlık tabanlı termostabilite ekran transfekte kullanmaktadır. Çizim Tm değerleri bağlı [3H] oda sıcaklığında sitalopram, yüksek termostabilite ve sentezleme seviyeleri, uygun olan yapılar ortaya karşısında protein saflaştırma için (Şekil 1B). Üç mutant (Y110A, I291A ve T439S) son derece stabil bir yapı (Şekil 1C) oluşturmak üzere bir araya getirilmiştir. Termostabilitesini ayrıca SERT-Fab kompleksinin kristalleşme için gerekli kısa zincirli deterjanlarda artan istikrar ile ilişkilidir. baculovirüs-tr kullanılarak insan SERT büyük ölçekli ekspresyonuansduced HEK293S GnTI - hücreleri en az 2 hafta sürebilir ve Şekil 2A&#39;da gösterildiği gibi, miligram miktarları üretebilir. GFP etiketli SERT CC proteininin kullanımı SERT uygun floresan (Şekil 2B) ile ekspresyonu ve saflaştırılması sırasında takip edilebilir. ; Stabilize edici bir lipid olarak CHS mevcudiyetinde C12M hücrelerin - Bizim saflaştırma stratejisi 1) HEK293S GnTI S -citalopramın bağlı SERT çözünürlüğünü dahil 2) Strep afinite matrisi Sert bağlanması; Kapsamlı yıkama ile kirletici madde proteinlerinin 3) kaldırılması; ve 4) tamponu ihtiva eden destiyobiyotin (Şekil 2C) fonksiyonel SERT elüsyonu. FSEC (Şekil 2D, E) ile değerlendirildiği gibi Elüt edilen protein, büyük ölçüde, Coomassie mavi boyanması yolu ile, diğer tespit proteinlerin serbest ve tek dağılımlı olduğunu. Benzer bir strateji, reconstitutio için kullanılan bir Strep II etiketiyle SERT saflaştırmak için alındın ve aşılama (Şekil 3A, B). proteoliposomes halinde SERT eklenmesi SERT serum yarı-ömrü ve stabilitesini artırır ve yüksek afıniteli antikorların izole edilmesi ihtimalini arttırır. Bundan başka, lipid A dahil, bakteri hücre duvarının bir bileşeni olan güçlü bir yardımcı madde 9 olarak hizmet eder. Çok katmanlı lipozomlar cam tüplerde bir kurutulmuş lipid karışımına tampon maddesinin eklenmesi ile hazırlanmış ve tampon maddesi içinde yeniden süspansiyona alınmıştır. 200 nm gözenek büyüklüğü filtrelerden lipozomların Ekstrüzyon tek dağılımlı tek lamelli lipozom süspansiyonları üretir. Lipozomlar daha sonra deterjan saflaştırılmış SERT ilave edilir deterjan ile doymuştur. deterjan karışımı: Son olarak, deterjan lipide hidrofobik emici reçinenin eklenmesiyle kaldırılır. Ek ligand antidepresan bağlı yapısını tanıyan antikorları seçmek için yeniden örnek eklenmelidir. proteoliposomes içinde SERT varlığı ile teyit edilmelidirSDS-PAGE yükleme boya veya C12M olan küçük bir örnek çözündürülmesi ve SDS-PAGE ve FSEC (Şekil 3C, D) üzerinde çalışan. SERT antikorları eksprese eden hibridoma hücre çizgileri 3D epitopları tanıyan yüksek afiniteli bağlayıcılar için taranabilir. Antikor sıkıca homojen, iyi sıralı etki kristal ambalaj teşvik etmek yapılandırılmış bölgeye bağlı kalmalıdır gibi bu özellikler, kristalleşme nihai başarısı için çok önemlidir. İlk adımda, yapısal olmayan bölgeleri tanıyan antikorlar tanımlanmıştır. SERT denature edilir ve bir nitroselüloz zarı üzerine beneklendirilmiştir; denatüre SERT bağlanan antikorlar batı-pozitif ve büyük olasılıkla lineer epitopları tanıyacaktır. Şekil 4A, biz batı-pozitif ve crystallogenesis teşvik etmek olası yararlı değildir antikorların 2 örneklerini göstermektedir. Şekil 4B&#39;de, diğer Batı negatif antikorlar 100 nM SERT-GFP ile kuluçkaya yatırılır ve ayrılmışFSEC. SERT önceki bir konuma GFP pozitif tepe kayacak bağlayan antikorlar. SERT-antikor kompleksleri FSEC ile analiz ardından nanomolar afinite ile bağlanan belirlemek için başka deterjan seyreltilebilir. yapısal taşıyıcı değişiklikleri ve böylece antikorlar serotonin sonuçları eklenmesi de özellikle SSRI bağlı yapısını kabul belirlemek için tekrar elenebilir edilebilir. Şekil 4C&#39;de, antikorlar, epitop (lar) ilişkili bir durumu substrat SSRI arasında değişmez gösteren serotonin mevcudiyetinde SERT bağlandığı gösterilmiştir. Son olarak, Şekil 4D&#39;de antikorların kombinasyonları daha sola doğru bir kayma ile sonuçlanır, apayn epitopları bağlanma yetenekleri açısından test edilir. Burada 15B8 veya 8A11 antikorlar 8B6 farklı bir epitopu tanır. 8B6 antikor papain Akne tedavi edici ile ön kristal tarama dayalı daha fazla yapısal analiz için seçildited Fab. 8B6 Fab genler, bir böcek hücresi sentezleme vektörüne klonlanmıştır. Fab ifade süspansiyon içinde büyüyen Sf9 hücrelerinden salgılanabilir. 8B6 Fab His-tag afinite (Şekil 5a, b) ve SDS-PAGE jelleri üzerinde yabancı maddelerden arındırılmış görünen protein elde katyon değişim kromatografisiyle (Şekil 5C, D) Sf9 hücre yüzer saflaştırılabilir. Şekil 5E&#39;de, yeniden birleştirici 8B6 Fab SERT bağlandığı gösterilmiştir ve sonraki biyokimyasal ve biyofiziksel deneylerde kullanılır. Eğilim saf hale getirilmiş SERT CC trombin ve EndoH ile sindirilmiş ve S -citalopramın mevcudiyetinde bir kompleks oluşturmak için 8B6 Fab ile karıştırılır. Taşıyıcı-antikor kompleksi, daha sonra C8M (Şekil 6A) SEC ile ayrılır ve SDS-PAGE (Şekil 6B) ile gösterildiği gibi, en yüksek fraksiyonlar eki ve Fab ikisini de içerir. C8M kullanımı kristal oluşumu muhtemelen için çok önemlidirkısa zincirli deterjan kristal kafes içinde moleküller arasında daha iyi ambalaj sağlar. FSEC kristalizasyon için toplanmış hangi fraksiyonlar belirlemek için kullanılmıştır (Şekil 6C); tek dağılımlı değildir ve / veya serbest SERT veya Fab büyük miktarlarda içeren fraksiyonlar kombine edilmemelidir. Prizma şeklindeki SERT-antikor kristaller damla buhar difüzyonu (Şekil 7A) asılarak Bu protokol kullanılarak S -citalopramın mevcudiyetinde yetiştirilebilir. Oluşan kristaller 3.15 Å 10 (Şekil 7B) bir çözünürlük X-ışınları yaymak. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54792/54792fig1.jpg" /> Şekil 1:. Sintilasyon Termostabilite Deneyi A Yakınlık tabanlı. [3H] sitalopram. B mevcudiyetinde termostabilite taranması için protokol bakış. En bağlanmış [3 </belirgin erime sıcaklığı (Tm) karşı destek&gt; H] sitalopram. Noktalı çizgiler WT taşıyıcısı değerlerini temsil etmektedir. 3 En termostabil mutantlar etiketlenir. Gri alanı nedeniyle düşük sinyal-gürültü. C WT ve dolayısıyla doğru olmayan Tm değerlerine kıyasla bağlanan [3H] sitalopram% 10&#39;dan daha az olan mutantlar temsil eder. WT SERT TC ve ilk 3 mutantlar için termostabilite eğrileri. Hata çubukları standart sapmayı (SD) temsil etmektedir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54792/54792fig2.jpg" /> Şekil 2:. Memeli Heterolog Protein Ekspresyonu A Genel Bakış. HEK293S GnTI içinde BacMam virüs üretimi ve SERT ifade şematize bakış -. Hücreler B. HEK293S GnTI -. SERT CC (GFP floresans) Cı ifade eden hücreler. Strep afinite reçine SERT CC elüsyon profili. % 100 (0 - - 5 mM) D. Yeşil iz destiyobiyotin konsantrasyonunu, 0 temsil eder. % 15 SDS-PAGE jeli e -. 4 üzerinde yakınlık saf hale SERT CC analizi. GFP floresans tespit afinite saflaştırılmış SERT CC FSEC (eksitasyon: 480 nm; emisyon: 510 nm). 15 mL akıtılarak zirve SERT (#) ve 18 ml ücretsiz GFP (*) &#39;dir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54792/54792fig3.jpg" /> Şekil 3:. SERT IC A Temsilcisi Affinity Arıtma ve Sulandırma. Antikor nesil şematik bakış. &lt;strong&gt; B. Elüsyon profili Strep afinite reçinesi üzerinde SERT IC afinite saflaştırma 280 nm&#39;de gözlendi. % 100. (0 - - 5 mM) C yeşil iz destiyobiyotin konsantrasyonunu, 0 temsil eder. Afinitesi analizi saf hale getirilir ve bir 4 SERT yeniden -% 15 SDS-PAGE jeli D.. yeniden çözme aşamalarından sonraki çözündürülmüş SERT&#39;in FSEC. Triptofan artıklarının floresan SERT (: 280 nm; Emisyon: Uyarma 335 nm) tespit etmek için kullanılmıştır. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54792/54792fig4.jpg" /> Şekil 4:. Temsilci SERT Antikorların Analizi. Western blot ile antikorların taranması. Yaklaşık 1 mikrogram GFP ile veya olmadan SERT CC 4 uygulandı -% 15 SDSPAGE jel ve bir nitroselüloz zarı üzerine beneklendirilmiştir. Bağlama IR boyası konjüge edilmiş bir keçi anti-sıçan antikoru kullanılarak tespit edildi. 2G4 ve 10F2 batı olumlu. B bulunmaktadır. FSEC 100 nM GFP etiketli eki ve algılama antikorların bağlanma GFP floresan kullanılarak tespit edildi. C. 1 mM serotonin. D varlığında 100 nM GFP etiketli Sert seçilen Fab&#39;ların bağlanması. 8A11 ve 15B8 Fab&#39;ın bağlanma SERT-8B6 için Fab. 18 mL akıtılarak minör zirveleri ücretsiz GFP vardır. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/54792/54792fig5.jpg" /> Şekil 5: Sf9 hücrelerinden 8B6 Fab&#39;ın Örnek saflaştırılması için uygun değildir.. Elüsyon profili His-tag afinite kromatografisi yolu ile 8B6 Fab saflaştırılması 280 nm&#39;de gözlenmiştir<html> hy. % 50 (0 - - 250 mM) B. Yeşil iz imidazol konsantrasyonunu, 0 temsil eder. Indirgeyici olmayan ve His-etiketi afinite saflaştırmadan sonra, SDS-PAGE jeli azaltır. 50 kDa yakınına kadar protein indirgenmemiş Fab (#) ve kDa Fab (*). C azalır 25 ° küçük bir türdür. Elüsyon profili, doğrusal bir sodyum klorür gradyanı altında elüt edilmektedir tek simetrik tepe gösteren katyon değişimiyle 8B6 Fab saflaştırılması 280 nm&#39;de gözlendi. % 100. (0 - - 500 mM) D yeşil iz NaCl konsantrasyonu, 0 temsil eder. Katyon değişim. E ile saflaştırma sonrasında% 12.5 SDS-PAGE jeli üzerinde 8B6 Fab analizi. GFP floresan kullanılarak tespit, 10 nM GFP etiketli SERT için 8B6 Fab bağlanması. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> e 6 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 54792 / 54792fig6.jpg &quot;/&gt; Şekil 6:. Varlığı S -citalopram A SERT-8B6 Kompleksi&#39;nin Temsilcisi Jel Filtrasyon Kromatografisi. saflaştınldı SERT-8B6 kompleksinin Jel filtrasyon elüsyon profili. 11.5 mL elüsyon ana pik SERT-8B6 kompleksidir. 15 tepe -. 17 mL GFP ve Fab B içerir. % 15 SDS-PAGE jeli - 4 üzerinde saflaştırıldı SERT-8B6 kompleksi analizi. SERT ve Fab ağır ve hafif zincirlerinin pozisyonları tire. C ile gösterilir. beden ayrılan fraksiyonların FSEC. SERT-8B6 kompleksleri triptofan floresan kullanılarak tespit edildi. Fraksiyon 17 Fab ile kompleks vermedi SERT daha büyük bir miktarda içerir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 7,"src = &quot;/ files / ftp_upload / 54792 / 54792fig7.jpg&quot; /&gt; Şekil 7:. S -citalopram A Bound SERT-8B6 Kompleksinin Kristalizasyon. büyüme 2 hafta sonra SERT-8B6 kompleksinin paralel yüzlü şekilli kristallerin ışık mikroskobu. Ölçek çubuğu 200 mikron. B eşittir. SERT-8B6 kristalleri 3.15 Å X-ışınları yaymak. Mavi halka 3.15 Å temsil eder. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig7large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Tablo 1:. S -citalopramın Bound SERT-8B6 Kompleksi için bir Kristalizasyon Ekranı <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792table1.xlsx">Bu tabloyu indirmek için tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram at JoVE.com

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Bu el yazması, mutasyonlar termo için ekran insan serotonin taşıyıcı arındırmak, yüksek afiniteli antikorların üretilmesi ve antidepresan ilaç S -citalopramın bağlı serotonin taşıyıcı-antikor kompleksi kristalize açıklamaktadır. Bu protokol için diğer zor membran ileticileri, reseptör ve kanal çalışması için adapte edilebilir.

Termo, İfade, saflaştırılması, ve İnsan serotonin Transporter Kristalizasyon Bound<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

S100A12&#39;nin Ekspresyon, Saflaştırma ve Antimikrobiyal Aktivitesi

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

Birliğin Rekombinant Protein Ekspresyonu, Kristalleştirilmesi ve Biyofiziksel Araştırmaları<em&gt; Bacillus</em&gt; - Konserve Nükleotid Pyrophosphorylase, BcMazG

To overcome safety restrictions and regulations when studying genes and proteins from true pathogens, their homologues can be studied. Bacillus anthracis ...

A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/&#945;

A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â±

Üretim, kristalizasyon ve insan IKK1/α yapı belirlenmesi için bir rehber

A class of extracellular stimuli requires activation of IKK1/&#945; to induce generation of an NF-&#954;B subunit, p52, through processing of its ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

İfade ve arıtma memeli Bestrophin iyon kanalları

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

İfade ve insan Lipid duyarlı ba * kanal TRPC3 arınma için tek-parçacık Cryo-elektron mikroskobu ile yapısal kararlılık

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

İfade, Solubilization ve ökaryotik Bor taşıyıcılar arıtma

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...

Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

Nükleazsız Oksijen Çöpçü Protocatechuate 3,4-Dioksijenaz İfadesi ve Saflaştırma

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Fumarylacetoasetat Hydrolase etki alanı Içeren proteinleri ifade, arıtma, kristalizasyon ve enzim Asdimleri

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

PCR Mutagenesis, Cloning, Expression, Fast Protein Purification Protocols and Crystallization of the Wild Type and Mutant Forms of Tryptophan Synthase

PCR Mutagenezi, Klonlama, İfade, Hızlı Protein Saflaştırma Protokolleri ve Triptofan Synthase'in Vahşi Tipinin ve Mutant Formlarının Kristalizasyonu

Structural studies with tryptophan synthase (TS) bienzyme complex (&#945;2&#946;2 TS) from Salmonella typhimurium have been performed to better understand ...

Bacterial Expression and Purification of Human Matrix Metalloproteinase-3 using Affinity Chromatography

Afinite Kromatografisi Kullanılarak İnsan Matriksi Metalloproteinaz-3'ün Bakteriyel İfadesi ve Saflaştırılması

Matrix metalloproteinases (MMPs) belong to the family of metzincin proteases with central roles in extracellular matrix (ECM) degradation and remodeling, ...