Name: preparation of primary mixed glial cultures from adult mouse spinal cord tissue
Uploaded: 2016-11-19T14:00:00
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Adult spinal cord mixed cultures were first developed using rats with grant support from an NIH/NIDA R01 award (PI De Leo) and an NIH T32 training grant (PI Green). These methods were further adapted for mouse spinal cords with support from the following grants: NIH/NIDA 5K01DA023503 (PI Cao), NIH/NINDS 5R21NS066130 (PI Cao), and NIH/NIGMS P20GM103643 (PI Meng). The authors would also like to thank Dr. Alejandro M. S. Mayer, Department of Pharmacology, Chicago College of Osteopathic Medicine, for his technical help in obtaining microglia-rich mixed glial cells.

Das folgende Protokoll wurde von der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) an der Universität von New England zugelassen. Das folgende Protokoll ist für Glia-Kulturen von 4 erwachsenen Maus Rückenmark vor. 1. Herstellung von Lösungen in einer Kultur Hood unter aseptischen Bedingungen <ol><li> Bereiten Kulturmedien: alle Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (cDMEM), enthaltend DMEM (mit 4,5 g / L Glucose), 10% Fetal Bovine Serum (FBS), 2 mM L-Glutamin, 100 IU / ml Penicill...

<ol>
	<li>Gaskin, D. J., Richard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+economic+costs+of+pain+in+the+United+States.">The economic costs of pain in the United States.</a> J Pain. 13 (8), 715-724 (2012).</li><li>Ji, R. R., Berta, T., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glia+and+pain:+Is+chronic+pain+a+gliopathy?.">Glia and pain: Is chronic pain a gliopathy?.</a> Pain. 154 (01), S10-S28 (2013).</li><li>Ni, M., Aschner, M., Maines, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+rat+primary+icroglia:+isolation,+culturing+and+selected+applications.">Neonatal rat primary icroglia: isolation, culturing and selected applications.</a> Curr Protoc Toxicol. , (2010).</li><li>Cao, L., Fei, L., Chang, T. T., DeLeo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+interleukin-1beta+by+interleukin-4+in+lipopolysaccharide-treated+mixed+glial+cultures:+microglial-dependent+effects.">Induction of interleukin-1beta by interleukin-4 in lipopolysaccharide-treated mixed glial cultures: microglial-dependent effects.</a> J Neurochem. 102 (2), 408-419 (2007).</li><li>Malon, J. T., Maddula, S., Bell, H., Cao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+calcitonin+gene-related+peptide+and+CCL2+production+in+CD40-mediated+behavioral+hypersensitivity+in+a+model+of+neuropathic+pain.">Involvement of calcitonin gene-related peptide and CCL2 production in CD40-mediated behavioral hypersensitivity in a model of neuropathic pain.</a> Neuron Glia Biol. 7 (2-4), 117-128 (2011).</li><li>Blasi, E., Barluzzi, R., Bocchini, V., Mazzolla, R., Bistoni, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalization+of+murine+microglial+cells+by+a+v-raf+/+v-myc+carrying+retrovirus.">Immortalization of murine microglial cells by a v-raf / v-myc carrying retrovirus.</a> J Neuroimmunol. 27 (2), 229-237 (1990).</li><li>Bocchini, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+immortalized+cell+line+expresses+properties+of+activated+microglial+cells.">An immortalized cell line expresses properties of activated microglial cells.</a> J Neurosci Res. 31 (4), 616-621 (1992).</li><li>Alliot, F. O., Marty, M. C., Cambier, D., Pessac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+spontaneously+immortalized+mouse+microglial+cell+line+expressing+CD4.">A spontaneously immortalized mouse microglial cell line expressing CD4.</a> Dev Brain Res. 95 (1), 140-143 (1996).</li><li>Alliot, F. O., Pessac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+cell+clones+derived+from+established+cultures+of+8-day+postnatal+mouse+cerebella.">Astrocytic cell clones derived from established cultures of 8-day postnatal mouse cerebella.</a> Brain Res. 306 (1-2), 283-291 (1984).</li><li>Malon, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+content-dependent+inhibitory+effects+of+calcitonin+gene-related+peptide+(CGRP)+on+murine+retroviral+infection+of+glial+cells.">Microglial content-dependent inhibitory effects of calcitonin gene-related peptide (CGRP) on murine retroviral infection of glial cells.</a> J Neuroimmunol. 279, 64-70 (2015).</li><li>Cao, L., DeLeo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CNS+Infiltrating+CD4(+)+T+lymphocytes+Contribute+to+Murine+Spinal+Nerve+Transection-Induced+Neuropathic+Pain.">CNS Infiltrating CD4(+) T lymphocytes Contribute to Murine Spinal Nerve Transection-Induced Neuropathic Pain.</a> Eur J Immunol. 38 (2), 448-458 (2008).</li><li>Mayer, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+a+short-term+in+vitro+exposure+to+the+marine+toxin+domoic+acid+on+viability,+tumor+necrosis+factor-alpha,+matrix+metalloproteinase-9+and+superoxide+anion+release+by+rat+neonatal+microglia.">Effect of a short-term in vitro exposure to the marine toxin domoic acid on viability, tumor necrosis factor-alpha, matrix metalloproteinase-9 and superoxide anion release by rat neonatal microglia.</a> BMC Pharmacol. 1, 7 (2001).</li><li>Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+the+distribution+and+morphology+of+microglia+in+the+normal+adult+mouse+brain.">Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain.</a> Neuroscience. 39 (1), 151-170 (1990).</li><li>Rock, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Microglia+in+Central+Nervous+System+Infections.">Role of Microglia in Central Nervous System Infections.</a> Clin Microbiol Rev. 17 (4), 942-964 (2004).</li><li>Yang, I., Han, S. J., Kaur, G., Crane, C., Parsa, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Microglia+in+Central+Nervous+System+Immunity+and+Glioma+Immunology.">The Role of Microglia in Central Nervous System Immunity and Glioma Immunology.</a> J Clin Neurosci. 17 (1), 6-10 (2010).</li></ol>

Es ist wichtig, alle Schritte-einschließlich der Medien zur Durchführung plan in einer konsistenten Art und Weise zu ändern, um zu reproduzierbaren Ergebnissen zwischen den Experimenten erhalten. Die folgenden Schritte sind besonders kritisch in ausgezeichneter Qualität erwachsenen gemischten Glia zu erhalten. Die enzymatische Verdauung ist ein wichtiger Aspekt dieses Protokolls. Entscheidend ist, dass die Gewebestücke sind gut verdaut, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten. Allerdin...

Chronische Schmerzen sind ein ernstes gesundheitliches Problem , dass etwa 100 Millionen Erwachsene in den Vereinigten Staaten, mit einem geschätzten jährlichen Kosten von bis zu 635.000.000.000 $ 1 betrifft. Montage Beweise hat einen wesentlichen Beitrag des Rückenmarks Gliazellen bei der Entwicklung von neuropathischen Schmerzen angegeben, einer der verheerendsten Arten von chronischen Schmerzen 2. Eine geeignete in vitro - Kultursystem würde dazu beitragen , deutlich weiter die Rolle von Gliazellen auf zellulärer und molekularer Ebene zu untersuchen. Derzeit umfassen die in - vitro - Glia - Kultursystemen von Forschern verwendet hauptsächlich Gliazellen aus Rindengewebe von neugeborenen Maus oder Ratte Gehirn abgeleiteten Zellen und verewigte Linien Gliazellen aus neonatalen Maus abgeleitet oder primäre Gliazellen Ratte. Neonatal Zellen enthalten eine signifikante Anzahl von undifferenzierten Zellen, die in Gliazellen unterschieden werden weiter können (vor allem Astrozyten und Mikroglia), so dass eine Bereitstellung vonbundant Zellen für die experimentelle Verwendung 3. Allerdings hat unsere früheren Studie gezeigt, dass die neonatale Gehirn Gliazellen Rückenmark Gliazellen auf Lipopolysaccharid (LPS) Stimulation signifikant unterschiedlich von Erwachsenen reagiert. Beispielsweise Interleukin (IL) -4 angezeigt verbesserte hemmende Wirkung auf LPS-induzierten Stickstoffmonoxid (NO) Produktion in adulten Ratten Glia Rückenmark im Vergleich zu neugeborenen Gehirn Glia 4. Des Weiteren sind die Profile der Chemokin - Produktion nach Stimulierung durch ein Neuropeptid, Calcitonin - Gen-verwandtes Peptid (CGRP), unarguably unterschiedlich zwischen neonatalen Mausgehirn Glia (Methods in Ref. 5 beschrieben) und adulten Rückenmark der Maus Glia (Abbildung 1). Etablierte Zelllinien sind leicht zu bedienen und zu warten, und eine große Anzahl von Zellen in einer kurzen Zeitperiode liefern kann. Im allgemeinen sind immortalisierte Zelllinien erzeugt entweder einen Virus-vermittelte Immortalisierung System (wie beispielsweise die weit verbreiteten Mikroglia - Zelllinie , BV2) 6 unter Verwendung von , 7 oder folgenden the Identifizierung von spontanen Transformation (wie beispielsweise die Astrozyten Zelllinie C8-D1A und Mikroglia - Zelllinie C8-B4) 8, 9 Zellinien sind ausgezeichnet in den molekularen Eigenschaften von Astrozyten und Mikroglia individuell studieren. aber die erhaltenen Ergebnisse aus Zelllinien erfordern immer eine weitere Validierung in primären Zellen oder in in vivo - Bedingungen. Es sollte auch angemerkt werden, dass es keinen Bericht einer glialen Zelllinie wurde, die aus einem Nagetier Rückenmark Gliazellen abgeleitet ist. Um die Rolle des Rückenmarks Gliazellen in der Entwicklung von neuropathischen Schmerzen untersucht, einem Kultursystem , das aus adulten Rückenmark der Maus abgeleitet ist , wurde durch Anpassung einer zuvor berichteten Verfahren entwickelt worden verwendet erwachsenen Ratte gemischten Gliakulturen 4 erzeugen, 5 . Das Rückenmark glial Kultur Maus wurde weitere kürzlich 10 verfeinert und wird ausführlicher in diesem Artikel beschrieben. Erwachsener Rückenmark gemischt Gliakulturen ceine mit einer Maus aus ausgewählten Stämmen hergestellt werden, die den Bedürfnissen der speziellen Studie passen, und die Zellen können für bis zu 21 d nach Beginn der Kultur in Kultur gehalten werden. Dieses Verfahren kann bei neuropathischen Schmerzstudien verwendet werden, sowie in Untersuchungen von verschiedenen neurologischen Erkrankungen, die pathologischen Veränderungen innerhalb des Rückenmarks, wie amyotropher Lateralsklerose (ALS), human immunodeficiency virus (HIV) -assoziierten sensorische Neuropathie beinhalten, und multiple Sklerose (MS).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="2053">
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:489px;">Dulbecco&#8217;s modification of Eagle&#8217;s media (DMEM) with 4.5g/L glucose</td>
			<td style="width:277px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">12-709F</td>
			<td style="width:1168px;">The cDMEM media is a standard, widely used culture media. Individual researcher can decide where to purchase the DMEM and all other component used to make cDMEM media.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">L-Glutamine (100x)</td>
			<td style="width:277px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">17-605E</td>
			<td>The L-glutamine is a standard, widely used component for various culture media. Individual researcher can decide where to purchase L-glutamine.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:489px;">Antibiotic-Antimycotic Solution (100x)</td>
			<td style="width:277px;">Corning-Mediatech</td>
			<td style="width:119px;">30-004-CI</td>
			<td>This is a combination of penicillin, streptomycin and Amphotericin formulated to contain 10,000 units/ml penicillin G, 10 mg/ml streptomycin sulfate and 25 &#181;g/ml amphotericin B. Individual researcher can decide where to purchase individual component.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">2-mercaptoethanol (2-ME)</td>
			<td style="width:277px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M3148</td>
			<td>A BioReagent, suitable for cell culture, molecular biology and electrophoresis.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Papain dissociation system</td>
			<td style="width:277px;">Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LK003150</td>
			<td>Individual components of this kit can be purchased separately.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:489px;">Percoll</td>
			<td>GE Health Care</td>
			<td style="width:119px;">17-0891-01</td>
			<td>Percoll is sold as sterile solution. Undiluted Percoll can be re-autoclaved if needed.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:489px;">Lab-line incubator/shaker&#160;</td>
			<td style="width:277px;">Barstead/Lab-line</td>
			<td style="width:119px;">MaxQ4000&#160;</td>
			<td>This is the incubator/shaker we have currently. Other types of shakers can be used instead.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:489px;">Lipopolysaccharides, Salmonella Minnesota Re595&#160;</td>
			<td style="width:277px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L-9764</td>
			<td>Other strains of LPS can also induce glial responses. The magnitude of the responses may vary.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:489px;">Mouse IL-6 DuoSet ELISA&#160;</td>
			<td style="width:277px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:119px;">DY406</td>
			<td>Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:489px;">Mouse TNF-alpha DuoSet ELISA</td>
			<td style="width:277px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:119px;">DY410</td>
			<td>Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:489px;">Mouse IP-10 (CXCL10) DuoSet ELISA</td>
			<td style="width:277px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:119px;">DY466</td>
			<td>Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:489px;">Mouse MCP-1 (CCL2) ELISA Opteia set</td>
			<td style="width:277px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">555260</td>
			<td>Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:489px;">Mouse chemokine Q-Plex</td>
			<td style="width:277px;">Quansys Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">120251MS</td>
			<td>This product was available for in-house assay at the time. Instead, we sent out samples to the manufacturer for analysis.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:489px;">APC-anti-mouse-CD45 (clone 30-F11)</td>
			<td style="width:277px;">eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">17-0451</td>
			<td>Antibody of the same clone but from other vendors can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:489px;">FITC-anti-mouse-CD11b (clone M1/70)</td>
			<td style="width:277px;">eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">11-0112</td>
			<td>Antibody of the same clone but from other vendors can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:489px;">Accuri C6 flow cytometer</td>
			<td style="width:277px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">BD Accuri C6&#160;</td>
			<td>Each individual Researcher can use any flow cytometer he or she prefers.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:489px;">FlowJo software</td>
			<td style="width:277px;">Tree Star, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">FlowJo7.6.5</td>
			<td>Each individual Researcher can use any analysis software he or she prefers.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of primary mixed glial cultures from adult mouse spinal cord tissue

Es wurde gut angenommen, dass das Rückenmark glial Reaktionen wesentlich zur Entwicklung von neuropathischen Schmerzen bei. Enorme Informationen über Gliazellen Aktivitäten auf zellulärer und molekularer Ebene wurde durch in - vitro - Zellkultursystemen erhalten. Die in - vitro - Systemen verwendet werden , umfassen vor allem primäre Gliazellen abgeleitet von Neugeborenen Gehirn Rindengewebe und immortalisierten Zelllinien. Jedoch beziehen sich diese Systeme können nicht die Merkmale des Rückenmarks Gliazellen in vivo. Um die Rollen der Rückenmark Gliazellen in der Entwicklung peripherer Nervenverletzung induzierter neuropathischer Schmerz unter Verwendung eines Kultursystems weiter zu untersuchen , die besser auf die in - vivo - Zustand wiedergibt , hat unserem Labor , ein Verfahren zu etablieren primären Rückenmark gemischten Gliakulturen entwickelt von erwachsene Mäuse. Kurz gesagt, werden Rückenmark von erwachsenen Mäusen und verarbeitet durch Papainverdau durch Myelinentfernung mit einem dens gesammelt, gefolgtkeit-Gradientenmedium. Einzelzellsuspensionen werden kultiviert in vollständigen Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (cDMEM) , ergänzt mit 2-Mercaptoethanol (2-ME) bei 35,9 o C. Diese Kulturbedingungen wurden speziell für das Wachstum von gemischten Gliazellen optimiert. Unter diesen Bedingungen bereit sind Zellen zwischen 12 für Experimente verwendet werden - 14 d (Zellen sind in der Regel in der log-Phase während dieser Zeit) nach der Einrichtung der Kultur (D 0) und 21 in Kulturbedingungen bis zu D gehalten werden. Dieses Kultursystem kann verwendet werden, um die Reaktionen des Rückenmarks Gliazellen bei Stimulierung mit verschiedenen Substanzen und Wirkstoffe zu untersuchen. Neben neuropathischen Schmerzen, kann dieses System verwendet werden, glial Reaktionen in andere Krankheiten zu studieren, die pathologischen Veränderungen des Rückenmarks Gliazellen beinhalten.

Dieses Verfahren kann verwendet werden, um gemischte Gliazellen von beiden Mäusen und Ratten herzustellen. Die durchschnittliche Gesamtzellzahl pro Vertiefung in einer 12-Well-Platte auf D 12 nach Beginn der Kultur sollte relativ stabil sein, mit etwa 100.000 Zellen pro Vertiefung, wenn die Zellen aus Maus-Rückenmark abgeleitet sind. Gliazellen aus diesem Verfahren erhalten wird, kann in Versuchen verwendet werden, die für Erwachsene glial Rückenmark zu prüfen sollen Antworten auf d...

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Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

Die Entwicklung von neuropathischen Schmerzen handelt pathologischen Veränderungen der Wirbelsäule Gliazellen. Eine zuverlässige Gliazellen Kultursystem aus adulten Rückenmarksgewebe abgeleitet und für diese Zellen in vitro zu studieren fehlt. Deshalb zeigen wir hier, wie primären gemischten Glia-Kulturen von adulten Mausrückenmarksgewebe herzustellen.

Herstellung von primären gemischten Gliazellen Kulturen von erwachsenen Maus Rückenmarksgewebe

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

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Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

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Establishing Mixed Neuronal and Glial Cell Cultures from Embryonic Mouse Brains to Study Infection and Innate Immunity

Establishing Mixed Neuronal and Glial Cell Cultures from Embryonic Mouse Brains to Study Infection and Innate Immunity (Video) | JoVE 

Etablierung gemischter neuronaler und glialer Zellkulturen aus embryonalen Mäusegehirnen zur Untersuchung von Infektionen und angeborener Immunität

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Microglia Research on Spinal Cord Heterogeneity and Purification (Video) | JoVE

Schnelle und effiziente Anreicherung von Mikroglia des Rückenmarks der Maus

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Isolierung von reinen Astrozyten und Mikroglia aus dem Rückenmark adulter Mäuse für In-vitro-Assays und Transkriptomstudien

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