Name: an alternative and validated injection method for accessing the subretinal space via a transcleral posterior approach
Uploaded: 2016-12-07T14:00:00
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We gratefully acknowledge support by the Harold and Pauline Price Chair in Ophthalmology and the Jules Stein Eye Institute to MBG, the NEI Core grant (EY00331-43) to SN. Research was supported in part by a generous gift from the Sakaria family to SN and MGB, and from an unrestricted grant from the Research to Prevent Blindness to the Department of Ophthalmology. We thank Charlotte Yiyi Wang at Berkeley School of Optometry for obtaining initial OCT images of subretinal injections.

Animali: tipo selvaggio C57Bl / 6J topi allevati presso l&#39;Università della California a Los Angeles (UCLA). Tutti gli animali erano tra 11-17 settimane di vita, e compresi i topi maschi e femmine. Tutti i topi sono stati alloggiati in gruppo, mantenuto in un ciclo 12:12 chiaro / scuro con cibo e acqua ad libitum. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con le linee guida istituzionali della UCLA e l&#39;Associazione per la Ricerca e la Visione e Ophthalmology Dichiarazione per l&#39;uso di animali in oftalmica...

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	<li>Garoon, R. B., Stout, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+ocular+gene+therapy+and+advances+in+treatment+of+inherited+retinal+diseases+and+exudative+macular+degeneration.">Update on ocular gene therapy and advances in treatment of inherited retinal diseases and exudative macular degeneration.</a> Curr Opin Ophthalmol. 27 (3), 268-273 (2016).</li><li>Pierce, E. A., Bennett, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Status+of+RPE65+Gene+Therapy+Trials:+Safety+and+Efficacy.">The Status of RPE65 Gene Therapy Trials: Safety and Efficacy.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 5 (9), a017285 (2015).</li><li>Tolmachova, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+expression+of+Rab+escort+protein+1+following+AAV2-mediated+gene+delivery+in+the+retina+of+choroideremia+mice+and+human+cells+ex+vivo.">Functional expression of Rab escort protein 1 following AAV2-mediated gene delivery in the retina of choroideremia mice and human cells ex vivo.</a> J Mol Med (Berl). 91 (7), 825-837 (2013).</li><li>Nork, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+anatomic+consequences+of+subretinal+dosing+in+the+cynomolgus+macaque.">Functional and anatomic consequences of subretinal dosing in the cynomolgus macaque.</a> Arch Ophthalmol. 130 (1), 65-75 (2012).</li><li>Ye, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+Biodistribution+Evaluation+in+Cynomolgus+Macaques+of+rAAV2tYF-PR1.7-hCNGB3,+a+Recombinant+AAV+Vector+for+Treatment+of+Achromatopsia.">Safety and Biodistribution Evaluation in Cynomolgus Macaques of rAAV2tYF-PR1.7-hCNGB3, a Recombinant AAV Vector for Treatment of Achromatopsia.</a> Hum Gene Ther Clin Dev. , (2016).</li><li>Qi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-Corneal+Subretinal+Injection+in+Mice+and+Its+Effect+on+the+Function+and+Morphology+of+the+Retina.">Trans-Corneal Subretinal Injection in Mice and Its Effect on the Function and Morphology of the Retina.</a> PLoS One. 10 (8), e0136523 (2015).</li><li>Engelhardt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+morphological+analysis+of+the+subretinal+injection+of+retinal+pigment+epithelium+cells.">Functional and morphological analysis of the subretinal injection of retinal pigment epithelium cells.</a> Vis Neurosci. 29 (2), 83-93 (2012).</li><li>Lambert, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subretinal+AAV2.COMP-Ang1+suppresses+choroidal+neovascularization+and+vascular+endothelial+growth+factor+in+a+murine+model+of+age-related+macular+degeneration.">Subretinal AAV2.COMP-Ang1 suppresses choroidal neovascularization and vascular endothelial growth factor in a murine model of age-related macular degeneration.</a> Exp Eye Res. 145, 248-257 (2016).</li><li>Muhlfriedel, R., Michalakis, S., Garcia Garrido, M., Biel, M., Seeliger, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+technique+for+subretinal+injections+in+mice.">Optimized technique for subretinal injections in mice.</a> Methods Mol Biol. 935, 343-349 (2013).</li><li>Nusinowitz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+visual+function+in+the+rd12+mouse+model+of+Leber+Congenital+Amarousis+(LCA)+after+gene+replacement+therapy+to+restore+retinal+function.">Cortical visual function in the rd12 mouse model of Leber Congenital Amarousis (LCA) after gene replacement therapy to restore retinal function.</a> Vision Res. 46 (22), 3926-3934 (2006).</li><li>Huang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+morphological+analysis+of+the+subretinal+injection+of+human+retinal+progenitor+cells+under+Cyclosporin+A+treatment.">Functional and morphological analysis of the subretinal injection of human retinal progenitor cells under Cyclosporin A treatment.</a> Mol Vis. 20, 1271-1280 (2014).</li><li>Maguire, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+efficacy+of+gene+transfer+for+Leber's+congenital+amaurosis.">Safety and efficacy of gene transfer for Leber's congenital amaurosis.</a> N Engl J Med. 358 (21), 2240-2248 (2008).</li><li>Ridder, W. . 3. r. d., Nusinowitz, S., Heckenlively, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Causes+of+cataract+development+in+anesthetized+mice.">Causes of cataract development in anesthetized mice.</a> Experimental Eye Research. 75 (3), 365-370 (2002).</li><li>Ridder, W. H. 3. r. d., Nusinowitz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+visual+evoked+potential+in+the+mouse--origins+and+response+characteristics.">The visual evoked potential in the mouse--origins and response characteristics.</a> Vision Res. 46 (6-7), 902-913 (2006).</li><li>Matynia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsically+photosensitive+retinal+ganglion+cells+are+the+primary+but+not+exclusive+circuit+for+light+aversion.">Intrinsically photosensitive retinal ganglion cells are the primary but not exclusive circuit for light aversion.</a> Experimental Eye Research. 105, 60-69 (2012).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li></ol>

iniezioni sottoretiniche sono il metodo di scelta per la fornitura di vettori virali e terapia con cellule staminali di derivazione per manipolare fotorecettori e RPE sia nella ricerca di base e trattamento clinico. Nei pazienti, le iniezioni sottoretiniche sono in genere fatto con un sclerotomie anteriore alla pars plana, una vitrectomia nucleo posteriore e la penetrazione della retina per l&#39;ago con visualizzazione diretta. Come con la maggior parte delle procedure vitrectomia, è comune per la formazione di catara...

Iniezioni sottoretinico sono il mezzo principale di diffondere agenti cellulari e virali per le retine di topi per studiare i loro effetti sui fotorecettori e RPE sottostante 1,2. La maggior parte dei protocolli di iniezione subretiniche nei topi utilizzano un transcorneal o di un sito di iniezione anteriore transcleral all&#39;equatore (Figura 1). Questo approccio può causare danni collaterali intrinseca che comprende intaccare e opacità risultante della lente, rottura dell&#39;integrità del vitreo, la penetrazione della retina neurosensoriale e iris, emorragia retinica, consistenti distacchi di retina e duratura edema sottoretinico 3-9. Manipolazioni sperimentali devono superare questi effetti al fine di valutare gli effetti degli interventi terapeutici 3,7,10,11. Questo studio fornisce una descrizione dettagliata e la validazione di un metodo di iniezione transcleral posteriore che evita queste complicazioni, riduce al minimo il trauma e ha un alto tasso di successo di mira il subspazio della retina. Le iniezioni di targeting spazio sottoretinico nei topi sono spesso molto difficili da eseguire e la maggior parte ricercatori incontrano una alta frequenza di tentativi falliti in cui il vettore è consegnato in una posizione non corretta o non vi è significativo danni alla retina, per esempio in un distacco della retina completa 6. Il numero di occhi esclusi dall&#39;analisi a causa di complicazioni di iniezione non è di solito indicata in studi sui topi, ma nella nostra esperienza e nella discussione con altri ricercatori, il numero di iniezioni falliti può essere alto come il 50% e variare a seconda del esperienza e capacità del ricercatore che sta eseguendo le iniezioni. Il successo della iniezione è di solito valutata mediante imaging fundus diretta e / o tomografia a coerenza ottica (OCT) 7,9. Un metodo facilmente masterizzato con alte percentuali di successo per le iniezioni sottoretiniche nei topi può accelerare la sperimentazione e ridurre il costo di studi preclinici di treatments per le malattie della retina che sono le principali cause di cecità negli Stati Uniti. Il posteriore, transcleral tecnica di iniezione sottoretinico qui descritto è un adattamento da protocolli clinici e preclinici 9,12. Le valutazioni diagnostiche non invasive effettuate in topi iniettati dimostrano i danni lievi e altamente localizzato e non hanno l&#39;obiettivo ulteriori garanzie, lesioni della retina e RPE. Inoltre, con relativamente poco pratica, sperimentatore può conseguire questi risultati con un alto tasso di successo (80 - 90% o superiore), riducendo così i costi associati a tali studi. Questa procedura può essere utilizzata per fornire interventi terapeutici cellulari, virali o farmacologici a fotorecettori e / o RPE in studi preclinici e valutare facilmente interventi sperimentali.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Hamilton Model 62 RN SYR</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>87942</td>
			<td>Syringe x 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton Needle 33G, 1.0&#34;, 20 DEG, point 3 (304 stainless steel)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7803-05</td>
			<td>Needles x 6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Curved Scissors</td>
			<td>Ted Pella, INC.</td>
			<td>1347</td>
			<td>5mm Blade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22.5 Degree Microsurgery Knife</td>
			<td>Wilson Ophthalmic Corp.</td>
			<td>91204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketaject&#160;</td>
			<td>Phoenix</td>
			<td>NDC 57319-609-02</td>
			<td>Ketamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anased</td>
			<td>Lloyd Laboratories</td>
			<td>NDC 61311-482-10</td>
			<td>Xylazine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein 10% AK-Fluor</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>NDC 17478-253-10</td>
			<td>100mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% Saline USP</td>
			<td>Hospira</td>
			<td>NDC 0409-4888-50</td>
			<td>0.9% NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Ointment</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>NDC 17478-235-35</td>
			<td>Ophthalmic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Circulating Pump</td>
			<td>Gaymar</td>
			<td>TP-500 T/Pump&#160;</td>
			<td>P/N 07999-000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sd-OCT</td>
			<td>Bioptigen</td>
			<td>R-Series</td>
			<td>Commercial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fundus Camera</td>
			<td>Phoenix Research Laboratories</td>
			<td>MICRON III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers Type 3</td>
			<td>Ted Pella, INC.</td>
			<td>5385-3SU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5% Phenylephrine</td>
			<td>Paragon BioTeck</td>
			<td>NDC 42702-102-15</td>
			<td>Ophthalmic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMARIS8</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td>Version 8.1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>V1.8.0_77</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypromellose&#160;2.5%</td>
			<td>Goniovisc</td>
			<td>AX0401</td>
			<td>Methylcellulose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye Drops (Rinse)</td>
			<td>Bausch &#38; Lomb</td>
			<td></td>
			<td>Saline Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi 2000</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light source</td>
			<td>Fostec</td>
			<td>P/N 20520</td>
			<td>Light source</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an alternative and validated injection method for accessing the subretinal space via a transcleral posterior approach

iniezioni sottoretinico sono stati utilizzati con successo in entrambi gli esseri umani e roditori per fornire interventi terapeutici di proteine, agenti virali, e le cellule al interphotoreceptor / vano sottoretinico che ha l&#39;esposizione diretta ai fotorecettori e dell&#39;epitelio pigmentato retinico (RPE). iniezioni sottoretinico di plasminogeno così come recenti studi preclinici e clinici hanno dimostrato la sicurezza e / o efficacia di erogare vettori virali e di cellule staminali per le persone con malattie della retina avanzata. modelli murini di malattie della retina, in particolare ereditaria distrofie retiniche, sono essenziali per testare queste terapie. La procedura di iniezione più comune nei roditori è utilizzare piccola transcorneal o incisioni transcleral con un approccio anteriore alla retina. Con questo approccio, l&#39;ago per l&#39;iniezione penetra la retina neurosensoriale interrompere il RPE sottostante e l&#39;inserimento può facilmente nick la lente, causando opacizzazione della lente e compromissione della imagi non invasivang. Accedere allo spazio sottoretinico attraverso un transcleral, approccio posteriore evita questi problemi: l&#39;ago attraversa la sclera circa 0,5 mm dal nervo ottico, senza penetrazione della retina ed evita interrompere il vitreo. danni collaterali è limitata a quella associata alla sclerotomie focale e gli effetti di un transitorio, sierosa distacco di retina. La semplicità del metodo minimizza lesioni oculari, assicura un rapido riattacco e recupero della retina, e ha un basso tasso di fallimento. Il minimo danno alla retina e RPE consente la chiara valutazione dell&#39;efficacia e degli effetti diretti degli stessi agenti terapeutici. Questo manoscritto descrive una tecnica di iniezione sottoretinico romanzo che può essere utilizzato per indirizzare vettori virali, gli agenti farmacologici, le cellule staminali o cellule staminali pluripotenti indotte (iPS) allo spazio sottoretinico nei topi con elevata efficacia, danni minimi, e il recupero veloce.

Posteriori approccio iniezioni sottoretiniche transcleral sono state effettuate su 31 occhi sani da 16 topi wild type con iniezioni di 0,3 ml (n = 18), 0,5 ml (n = 8) e 1,0 ml (n = 5) di 0,01% fluoresceina. Un occhio è stato escluso dalla iniezione a causa di una opacità corneale pre-esistente che ha impedito l&#39;analisi strutturale e funzionale. Tutti gli occhi iniettati è incluso in questo rapporto. Nessun distacco della retina non intenzionali, punture della retina neurosensorial...

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An Alternative and Validated Injection Method for Accessing the Subretinal Space via a Transcleral Posterior Approach

Subretinal injections are the most common technique for delivering large therapeutic agents such as proteins and viral vectors to photoreceptors and the retinal pigment epithelium. An alternative method in mice that successfully targets the subretinal space with minimal collateral damage and fast recovery times is described here.

Un metodo alternativo e validate iniezione per l&#39;accesso ai sottoretinico Spazio<i&gt; via</i&gt; Un approccio Transcleral posteriore

Subretinal injections have been successfully used in both humans and rodents to deliver therapeutic interventions of proteins, viral agents, and cells to ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An Alternative and Validated Injection Method for Accessing the Subretinal Space via a Transcleral Posterior Approach

A Method of Nodose Ganglia Injection in Sprague-Dawley Rat

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