Name: optogenetic random mutagenesis using histone-minisog in c. elegans
Uploaded: 2016-11-14T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans at JoVE.com

The work is supported by HHMI. We thank our lab members for their help with testing the protocol and revising the manuscript.

1. Конструкция светодиодной подсветки Примечание: Необходимое оборудование LED резюмируется в списке материалов. Вся светодиодная установка мал и может быть размещен в любом месте в лаборатории, хотя мы рекомендуем быть размещены в темной комнате , чтобы контролировать освещенность...

<ol>
	<li>Jorgensen, E. M., Mango, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+art+and+design+of+genetic+screens:+caenorhabditis+elegans.">The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans.</a> Nat Rev Genet. 3 (5), 356-369 (2002).</li><li>Kutscher, L. M., Shaham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forward+and+reverse+mutagenesis+in+C.+elegans.">Forward and reverse mutagenesis in C. elegans.</a> WormBook. , 1-26 (2014).</li><li>Collins, J., Saari, B., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+a+transposable+element+in+the+germ+line+but+not+the+soma+of+Caenorhabditis+elegans.">Activation of a transposable element in the germ line but not the soma of Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 328 (6132), 726-728 (1987).</li><li>Noma, K., Jin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+mutagenesis+in+Caenorhabditis+elegans.">Optogenetic mutagenesis in Caenorhabditis elegans.</a> Nat Commun. 6, 8868 (2015).</li><li>Cooke, M. S., Evans, M. D., Dizdaroglu, M., Lunec, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+DNA+damage:+mechanisms,+mutation,+and+disease.">Oxidative DNA damage: mechanisms, mutation, and disease.</a> FASEB J. 17 (10), 1195-1214 (2003).</li><li>Shu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+tag+for+correlated+light+and+electron+microscopy+of+intact+cells,+tissues,+and+organisms.">A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms.</a> PLoS Biol. 9 (4), 1001041 (2011).</li><li>Ruiz-Gonzalez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Singlet+oxygen+generation+by+the+genetically+encoded+tag+miniSOG.">Singlet oxygen generation by the genetically encoded tag miniSOG.</a> J Am Chem Soc. 135 (26), 9564-9567 (2013).</li><li>Pimenta, F. M., Jensen, R. L., Breitenbach, T., Etzerodt, M., Ogilby, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen-dependent+photochemistry+and+photophysics+of+"miniSOG,"+a+protein-encased+flavin.">Oxygen-dependent photochemistry and photophysics of "miniSOG," a protein-encased flavin.</a> Photochem Photobiol. 89 (5), 1116-1126 (2013).</li><li>Frokjaer-Jensen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+and+targeted+transgene+insertion+in+Caenorhabditis+elegans+using+a+modified+Mos1+transposon.">Random and targeted transgene insertion in Caenorhabditis elegans using a modified Mos1 transposon.</a> Nat Methods. 11 (5), 529-534 (2014).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).</li><li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+worm+lab:+from+culturing+worms+to+mutagenesis.">An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis.</a> J Vis Exp. (47), (2011).</li><li>Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+stable+transgenic+C.+elegans+using+microinjection.">Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection.</a> J Vis Exp. (18), (2008).</li><li>Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+transformation.">DNA transformation.</a> Methods Cell Biol. 48, 451-482 (1995).</li><li>Fay, D., Bender, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+mapping+and+manipulation:+chapter+4--SNPs:+introduction+and+two-point+mapping.">Genetic mapping and manipulation: chapter 4--SNPs: introduction and two-point mapping.</a> WormBook. , 1-7 (2006).</li><li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments.">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J Vis Exp. (62), (2012).</li><li>Westberg, M., Holmegaard, L., Pimenta, F. M., Etzerodt, M., Ogilby, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+an+efficient,+genetically+encodable,+protein-encased+singlet+oxygen+photosensitizer.">Rational design of an efficient, genetically encodable, protein-encased singlet oxygen photosensitizer.</a> J Am Chem Soc. 137 (4), 1632-1642 (2015).</li><li>Xu, S., Chisholm, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+optogenetic+cell+ablation+in+C.+elegans+using+membrane-targeted+miniSOG.">Highly efficient optogenetic cell ablation in C. elegans using membrane-targeted miniSOG.</a> Sci Rep. 6, 21271 (2016).</li><li>Mariol, M. C., Walter, L., Bellemin, S., Gieseler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+protocol+for+integrating+extrachromosomal+arrays+with+high+transmission+rate+into+the+C.+elegans+genome.">A rapid protocol for integrating extrachromosomal arrays with high transmission rate into the C. elegans genome.</a> J Vis Exp. (82), (2013).</li><li>Lin, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+inhibition+of+synaptic+release+with+chromophore-assisted+light+inactivation+(CALI).">Optogenetic inhibition of synaptic release with chromophore-assisted light inactivation (CALI).</a> Neuron. 79 (2), 241-253 (2013).</li><li>Minevich, G., Park, D. S., Blankenberg, D., Poole, R. J., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CloudMap:+A+Cloud-Based+Pipeline+for+Analysis+of+Mutant+Genome+Sequences.">CloudMap: A Cloud-Based Pipeline for Analysis of Mutant Genome Sequences.</a> Genetics. 192 (>4), 1249-1269 (2012).</li><li>Qi, Y., Xu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiniSOG-mediated+Photoablation+in+Caenorhabdtis+elegans.">MiniSOG-mediated Photoablation in Caenorhabdtis elegans.</a> Bio-protocol. 3 (1), 316 (2013).</li><li>Qi, Y. B., Garren, E. J., Shu, X., Tsien, R. Y., Jin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photo-inducible+cell+ablation+in+Caenorhabditis+elegans+using+the+genetically+encoded+singlet+oxygen+generating+protein+miniSOG.">Photo-inducible cell ablation in Caenorhabditis elegans using the genetically encoded singlet oxygen generating protein miniSOG.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (19), 7499-7504 (2012).</li><li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+activation+of+channelrhodopsin-2+in+excitable+cells+of+Caenorhabditis+elegans+triggers+rapid+behavioral+responses.">Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses.</a> Curr Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).</li></ol>

Здесь мы опишем подробно процедура оптогенетика мутагенеза с использованием His-mSOG выражается в зародышевой линии и представляют собой пример малого масштаба вперед генетического экрана. По сравнению со стандартным химического мутагенеза, этот оптогенетика метод мутагенеза имеет не?...

Форвард генетический скрининг широко используются для создания генетических мутантов разрушающие различные биологические процессы в модельных организмах , таких как Caenorhabditis Элеганс (C. Элеганс) 1. Анализ таких мутантов приводят к открытию функционально важных генов и их сигнальных путей 1,2. Традиционно мутагенеза в C. Элеганс достигается за счет использования мутагенных химических веществ, радиации или транспозонов 2. Химические вещества , такие как этиловый эфир метансульфоната (EMS) и N - этил - N -nitrosourea (ENU) являются токсичными для человека; гамма-лучей или ультрафиолетового (УФ) излучения мутагенеза требует специального оборудования; и транспозонов-активные штаммы, такие как мутаторов штаммов 3, может вызвать ненужные мутации во время технического обслуживания. Мы разработали простой подход , чтобы вызвать наследуемые мутации с использованием генетически закодированного фотосенсибилизатора 4. Активных форм кислорода (ROS) может привести к повреждению ДНК 5.Мини - Синглетно генератор кислорода (miniSOG) представляет собой зеленый флуоресцентный белок из 106 аминокислот , который был сконструированных из LOV (света, кислорода, и напряжение) области Arabidopsis phototropin 2 6. Под воздействием синего света (~ 450 нм), miniSOG генерирует РОС в том числе синглетный кислород с фл Авин мононуклеотид как кофактор 6-8, который присутствует во всех клетках. Мы сконструировали гибридный белок His-mSOG помечая miniSOG на С-конце гистона-72, в C. Элеганс вариант гистона 3. Мы создали одностраничный копию трансгена 9 , чтобы выразить Его-mSOG в зародышевую C. Элеганс. При нормальных условиях культивирования в темноте, трансгенные черви Его-mSOG имеют нормальный размер выводка и срок службы 4. При воздействии синей подсветкой, черви His-mSOG производят наследуемые мутации среди их потомства 4. Спектр индуцированных мутаций включает в себя нуклеотидные изменения, такие как G: C Т: А и G: C к C: G и небольшой chromosoя делеции 4. Эта процедура мутагенеза проста для выполнения, и требует минимальной настройки безопасности лаборатории. Здесь мы опишем установку светодиодной подсветки и процедуры для оптогенетика мутагенеза.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="626">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Ultra High Power LED light source</td>
			<td style="width:71px;">Prizmatix</td>
			<td style="width:115px;">UHP-mic-LED-460</td>
			<td style="width:184px;">460 &#177; 5 nm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">LED controller</td>
			<td style="width:71px;">Prizmatix</td>
			<td style="width:115px;">UHPLCC-01</td>
			<td style="width:184px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:256px;">Digital function generator/amplifier</td>
			<td style="width:71px;">PASCO</td>
			<td style="width:115px;">PI-9587C</td>
			<td style="width:184px;">PI-9587C is no longer available. The replacement is PI-8127.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">BNC cable male/male</td>
			<td style="width:71px;">THORLABS</td>
			<td style="width:115px;">CA3136</td>
			<td style="width:184px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">USB-TTL interface</td>
			<td style="width:71px;">Prizmatix</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:184px;">Optional</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Photometer</td>
			<td style="width:71px;">THORLABS</td>
			<td style="width:115px;">PM50 and Model D10MM</td>
			<td style="width:184px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Filter paper</td>
			<td style="width:71px;">Whatman</td>
			<td style="width:115px;">1001-110</td>
			<td style="width:184px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:256px;">Copper chloride dihydrate (CuCl2&#8729;2H2O)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">C6641</td>
			<td style="width:184px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:71px;">Leica</td>
			<td style="width:115px;">MZ95</td>
			<td style="width:184px;"></td>
		</tr>
		<tr height="163">
			<td height="163" style="height:163px;width:256px;">NGM plate</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:184px;">Dissolve 5g NaCl, 2.5g Peptone, 20g Agar, 10 &#181;g/ml cholesterol in 1 L H2O. After autoclaving, add 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 25 mM KH2PO4(pH6.0).&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="88">
			<td height="88" style="height:88px;width:256px;">Lysis solution</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:184px;">10 mM Tris(pH8.8), 50 mM KCl, 0.1% Triton X100, 2.5 mM MgCl2, 100 &#181;g/ml Proteinase K</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optogenetic random mutagenesis using histone-minisog in c. elegans

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most mutagenesis-based screens, researchers have relied on the use of toxic chemicals, carcinogens, or irradiation, which requires designated equipment, safety setup, and/or disposal of hazardous materials. We have developed a simple approach to induce heritable mutations in C. elegans using germline-expressed histone-miniSOG, a light-inducible potent generator of reactive oxygen species. This mutagenesis method is free of toxic chemicals and requires minimal laboratory safety and waste management. The induced DNA modifications include single-nucleotide changes and small deletions, and complement those caused by classical chemical mutagenesis. This methodology can also be used to induce integration of extrachromosomal transgenes. Here, we provide the details of the LED setup and protocols for standard mutagenesis and transgene integration.

Мы провели вперед генетический экран с CZ20310 juSi164 КСН-119 (ed3) с использованием 30 мин воздействия света в соответствии со стандартным протоколом , описанным в разделах 2 и 3. Среди 60 F 1 пластин , соответствующих 120 мутагенезу гаплоидных геномов, мы нашли 8 F 1 пл...

Watch this Scientific Journal Video about Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans at JoVE.com

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Генетически-кодируемый гистона-miniSOG индуцирует генома наследуемые мутации в голубой светло-зависимым образом. Этот метод мутагенеза является простым, быстрым, свободным от токсичных химических веществ, а также хорошо подходит для прямого генетического скрининга и интеграции трансгена.

Оптогенетика Случайные мутагенеза Использование гистона-miniSOG в<em&gt; C. Элеганс</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Genetics

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Classical and Modern Genetics

SCIENTISTS IN ACTION

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

целевое<em&gt; В Ситу</em&gt; мутагенеза гистона Гены в почкующихся дрожжах

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Transcriptomic Analysis of C. elegans RNA Sequencing Data Through the Tuxedo Suite on the Galaxy Project

Transcriptomic Analysis of C. elegans RNA Sequencing Data Through the Tuxedo Suite on the Galaxy Project

Транскриптомный Анализ<em&gt; C</em&gt;.<em&gt; Элеганс</em&gt; РНК Секвенирование данных через Tuxedo люкс по проекту Galaxy

Next generation sequencing (NGS) technologies have revolutionized the nature of biological investigation. Of these, RNA Sequencing (RNA-Seq) has emerged ...

Quantification of Information Encoded by Gene Expression Levels During Lifespan Modulation Under Broad-range Dietary Restriction in C. elegans

Quantification of Information Encoded by Gene Expression Levels During Lifespan Modulation Under Broad-range Dietary Restriction in C. elegans

Количественная оценка информации, кодируемых ген выражение уровня во время жизни модуляции под широкий диапазон диетическое ограничение в C. elegans

Sensory systems allow animals to detect, process, and respond to their environment. Food abundance is an environmental cue that has profound effects on ...

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Манипуляция плоидности в Caenorhabditis elegans

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has ...

Gene-targeted Random Mutagenesis to Select Heterochromatin-destabilizing Proteasome Mutants in Fission Yeast

Джин целевой случайных мутагенеза выбрать дестабилизирующих гетерохроматин протеасом мутантов в деления дрожжевой

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

Быстрое и поверхностным трубопровода для генерации геномной мутантов точки в C. elegans с помощью ТРИФОСФАТЫ/Cas9 Ribonucleoproteins

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

A Novel Saturation Mutagenesis Approach: Single Step Characterization of Regulatory Protein Binding Sites in RNA Using Phosphorothioates

Роман насыщения мутагенеза подхода: Один шаг характеристика регламентационный протеин привязки сайтов в РНК с помощью кислота

Gene regulation plays an important role in development. Numerous DNA- and RNA-binding proteins bind their target sequences with high specificity to ...

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

Определения скорости оплодотворение яйца Bemisia tabaci с помощью цитогенетического техника

A few species of sap-sucking whiteflies are some of the most damaging terrestrial pests worldwide because of the crop damage they inflict and plant ...

High-Throughput Quantitative RT-PCR in Single and Bulk C. elegans Samples Using Nanofluidic Technology

High-Throughput Quantitative RT-PCR in Single and Bulk C. elegans Samples Using Nanofluidic Technology

Высокая пропускная способность Количественный RT-PCR в одиночных и массовых C. elegans образцы с использованием нанофлюидных технологий

This paper presents a high-throughput reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) assay for Caenorhabditis elegans that is fast, robust, and highly ...

CRISPR/Cas9 Editing of the C. elegans rbm-3.2 Gene using the dpy-10 Co-CRISPR Screening Marker and Assembled Ribonucleoprotein Complexes.

CRISPR/Cas9 Editing of the C. elegans rbm-3.2 Gene using the dpy-10 Co-CRISPR Screening Marker and Assembled Ribonucleoprotein Complexes.

CRISPR/Cas9 Редактирование гена C. elegans rbm-3.2 с использованием скринингового маркера dpy-10 Co-CRISPR и собранных рибонуклеопротеиновых комплексов.

The bacterial Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat (CRISPR)/Streptococcus pyogenes CRISPR-associated protein (Cas) system has been ...